Un Multimodal enfoque de imagen basados en tomografía Molecular Micro-CT y la fluorescencia para la evaluación Longitudinal de la Fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones

El objetivo general de este estudio en un modelo de ratón similar a la FPI es monitorizar longitudinalmente la fibrosis pulmonar con técnicas de imagen no invasivas como el TMF y la micro-TC. Este método puede avanzar en la secuencia con respecto a estos eventos moleculares específicos que ocurren en la fibrosis pulmonar. La principal ventaja de estas técnicas es que los cambios anatómicos de eventos moleculares específicos se pueden monitorear de manera no invasiva.

Las aplicaciones de estas tecnologías se extienden hacia la terapia de la patología de la FPI porque la fusión de FMT y micro-CT representa la posibilidad de estudiar la progresión de la enfermedad y la evaluación de nuevas terapias. Comience colocando un ratón anestesiado en la plataforma de intubación, colgándolo por sus incisivos colocados en el alambre. Encienda el laringoscopio, luego tome un par de pinzas de punta roma y abra suavemente la boca.

Coloque la hoja del laringoscopio hacia la parte posterior de la boca hasta que se visualice la abertura de la tráquea. Use la otra mano para insertar el tubo de administración conectado al extremo del tubo de PE en la tráquea. Gire la válvula de tres vías para suministrar 50 microlitros de bleomicina.

Después de la instalación, retire rápidamente el tubo de la tráquea para evitar la asfixia. Sostén a los ratones en posición vertical durante unos segundos. Para la inyección de la sonda, tome el ratón por la cola y deje que agarre la tapa de la jaula.

Luego agárrelo por los hombros y sostenga al ratón por el pescuezo. Sumerge la cola en un vaso de precipitados con agua tibia para hacer que las venas se hinchen y faciliten la visualización y la inserción de la aguja. Encuentra las dos venas caudales a cada lado de la cola, no la arteria en la parte inferior de la cola.

Inserte la aguja de calibre 26 de la jeringa de 1 mililitro cargada con MMP en la vena e inyecte la solución de sonda MMP a 10 mililitros por kilogramo de peso corporal. Para comenzar, inicialice el software de adquisición de fecha y abra un nuevo estudio en la base de datos para el experimento. Antes de comenzar la toma de imágenes, transfiera el ratón afeitado y anestesiado al centro del casete de imágenes.

Mantenga el ratón plano, seguro y suavemente comprimido contra ambas ventanas del casete de imágenes. Luego, en la ventana de escaneo del software, haga clic en Asunto" y luego obtenga una vista previa para ver la imagen en vivo. Dibuje la región de escaneo lo suficientemente grande como para que se capturen los tejidos que rodean el área de fluorescencia anticipada.

Una vez que se dibuja el ROY, haga clic en Agregar a la cola de reconstrucción y luego haga clic en Escanear" para obtener una imagen del mouse. Una vez completada la adquisición de la imagen, retire el ratón del casete de imágenes y vuelva a colocarlo en la jaula de inicio. Cuantifique los picomoles de fluorescencia utilizando la herramienta ROY y reduzca el ROY alrededor de 700 a 800 milímetros cúbicos en la señal proveniente de la región pulmonar.

Repita las imágenes cada siete días o según sea necesario. Para obtener imágenes por micro-CT, primero encienda el micro-CT presionando el botón verde de encendido e inicie el software para calentar la fuente de rayos X. Cree la base de datos haciendo clic en "Nueva base de datos" y construya el navegador en función del número de ratones en el experimento.

Antes de iniciar el escaneo, seleccione los parámetros de adquisición en la ventana de control del software de la siguiente manera. Establezca el voltaje del tubo de rayos X en 90 kilovoltios, la corriente del tubo de rayos X CT en 160 micro angstroms, la corriente del tubo de rayos X en vivo en 80 micro angstroms y el campo de visión en 36 milímetros. Seleccione no Técnica de compuerta" y Alta resolución" y cuatro minutos para la técnica de escaneo.

Después de anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano al 3%, colóquelo en la cama del animal insertado en el pequeño orificio con un cono de nariz que proporciona un suministro constante de anestésico. Inmovilice las patas con cinta adhesiva en la cama para permitir que el pecho quede expuesto. Al lado del instrumento, se cierra la puerta del instrumento y se activa el modo en vivo para ver la posición del mouse en tiempo real presionando el botón de captura.

Mueva la cama del animal para alinear el tórax con el campo de visión usando los botones del instrumento de tomografía computarizada. Una vez que el mouse esté centrado, gire el pórtico para confirmar la posición óptima de la cama seleccionando 90 grados y haciendo clic en Establecer "Luego haga clic en el botón de tomografía computarizada. Haga clic en "Sí" para el mensaje que informa que se encenderá la fuente de rayos X.

Después de la toma de imágenes, vuelva a colocar a los animales en la jaula y los monitoree hasta que se recuperen por completo de la anestesia. Repita las imágenes cada siete días o según sea necesario. La tinción con tricrómico de Masson revela la morfología en el tejido pulmonar.

Las imágenes del grupo tratado con bleomicina mostraron un patrón pronunciado de fibrosis a partir del día siete, principalmente como masas fibróticas individuales y progresaron en el día 14 a conglomerados confluentes de colágeno sustituido y permanecieron inalterados hasta el día 21. La repetición de las microtomografías computarizadas permitió la cuantificación y segmentación de las vías respiratorias en los lóbulos pulmonares de fibrosis. Las vías respiratorias se dividieron en una parte central y otra distal.

La parte distal de las vías respiratorias es el tracto intrapulmonar y se divide en lóbulos pulmonares como el lóbulo craneal derecho, el lóbulo medio derecho, el lóbulo caudal derecho, el lóbulo accesorio derecho y el pulmón izquierdo. La cuantificación del radio de la vía aérea mostró un aumento del radio en los ratones tratados con bleomicina en comparación con los controles con solución salina. Cada punto representa el error estándar medio de la media de cinco animales para un total de 30 ratones.

La cuantificación de la fibrosis pulmonar total en ratones tratados con vehículo o bleomicina en diferentes momentos demuestra que estos parámetros de micro-TC concuerdan con los hallazgos histológicos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar para el cribado de drogas de forma rutinaria. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la enfermedad de fibrosis pulmonar exploraran la eficacia del tratamiento repetido en modelos animales similares a la FPI.