Una base de RANKL osteoclasto cultura ensayo de médula ósea de ratón para investigar el papel de mTORC1 en la formación de osteoclastos

El objetivo general de este protocolo es aislar y cultivar osteoclastos in vitro a partir de médula ósea de ratón y estudiar el papel de la diana de mamíferos del complejo uno de rapamicina en la formación de osteoclastos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la formación de osteoclastos, como el papel de mTORC1 en la diferenciación de los osteoclastos. La principal ventaja de esta técnica es que da como resultado una gran cantidad de osteoclastos gigantes en una semana.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la osteoporosis porque es útil estudiar el mecanismo por el cual los osteoclastos se diferencian de sus precursores. Para comenzar este procedimiento, haga una incisión vertical en el extremo distal de la tibia de un ratón sacrificado y diseccione la piel a lo largo de las extremidades traseras. A continuación, corte el ligamento articular de las articulaciones de la cadera con unas tijeras y disloque las extremidades traseras del tronco.

Corta el ligamento articular de la articulación de la rodilla y disocia con cuidado la tibia y el fémur de él. Retire suavemente el tejido blando con unas tijeras. Coloque todos los huesos de un ratón en cada pocillo de una placa de seis pocillos con dos mililitros de alfa-MEM en hielo.

Para el aislamiento, llene un pocillo de una placa de seis pocillos con etanol al 75% y los otros cinco pocillos con alfa-MEM. Coloque todos los huesos de un ratón en el lavado con etanol durante 15 segundos y luego lave los huesos cinco veces con alpha-MEM durante 10 segundos cada vez. Corta las epífisis con la tijera e inserta una aguja de jeringa de 0,45 milímetros en la cavidad ósea.

Enjuague la médula con alfa-MEM en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. A continuación, enjuague la cavidad ósea utilizando el mismo método desde el otro extremo del hueso. Repita al menos dos veces para lavar bien la cavidad ósea hasta que el hueso esté pálido.

Posteriormente, centrifugar la médula ósea para obtener un pellet de células a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después, aspira el sobrenadante. Agregue tres mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos en el tubo de centrífuga y pipetee suavemente para resuspender la médula ósea.

Luego, mantenga el tubo de centrífuga en hielo durante ocho minutos para lisar los glóbulos rojos. Después de ocho minutos, agregue seis mililitros de alfa-MEM en el tubo de centrífuga para detener la lisis celular. Centrifugar a 800 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos, y aspirar el sobrenadante.

Luego, vuelva a suspender en tres mililitros de medio de cultivo alfa-MEM y coloque las células en una placa de seis pocillos. Incubar a 37 grados centígrados durante la noche. En este paso, transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 15 mililitros para recoger las células no adheridas a la mañana siguiente.

A continuación, centrifugar a 800 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos y aspirar el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender las células en cuatro mililitros de medio de cultivo alfa-MEM. Tome 20 microlitros de la solución celular y mezcle con 20 microlitros de Azul de Tripán.

Posteriormente, agregue 10 microlitros de la mezcla a la cámara de conteo y obtenga el recuento de células por mililitro de solución. A continuación, añada un volumen adecuado de medio de cultivo alfa-MEM para obtener una solución celular de 500.000 células por mililitro. A continuación, agregue 500 microlitros y 50 microlitros de medio de inducción de macrófagos de médula ósea en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y una placa de 96 pocillos, respectivamente.

Luego, agregue 500 microlitros y 50 microlitros de solución celular en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y una placa de 96 pocillos, respectivamente. Incubar a 37 grados centígrados durante tres días. Tres días después de la siembra, recoja 50 microlitros de medio de cada pocillo de la placa de 96 pocillos y congélela a 20 grados centígrados negativos.

A continuación, aspire el medio residual. Agregue un mililitro y 100 microlitros de medio de inducción de osteoclastos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y una placa de 96 pocillos, respectivamente. Incubar a 37 grados centígrados durante dos días.

Después de dos días, recoja 50 microlitros de medio de cada pocillo y aspire el medio residual. A continuación, se añade el medio de inducción de osteoclastos en cada pocillo y se incuba a 37 grados centígrados durante un día. Después de que se hayan formado los osteoclastos, recoja 50 microlitros de medio de cada pocillo de la placa de 96 pocillos.

En este paso, aspire el medio y lave la muestra suavemente tres veces con 1X PBS. A continuación, fije las celdas de cada pocillo de la placa de 96 pocillos con 100 microlitros de solución fija durante 30 segundos a temperatura ambiente. Después de la fijación, aspire la solución fija y lave las células suavemente tres veces con agua desionizada precalentada a 37 grados centígrados.

Luego, aspire el agua desionizada y agregue 100 microlitros de tinte TRAP en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos y protéjala de la luz. Después de teñir, aspire la mancha TRAP y lave suavemente tres veces con agua desionizada.

Posteriormente, obtenga imágenes de los osteoclastos en un microscopio invertido con un aumento de 40X. Luego, transfiera 30 microlitros del medio recolectado anteriormente a una nueva placa de 96 pocillos. A continuación, agregue 90 microlitros de mezcla de sustrato en cada pocillo de la placa de 96 pocillos.

Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante una hora y protéjala de la luz. Después de una hora, detenga la reacción agregando 30 microlitros de hidróxido de sodio de tres molares en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. A continuación, mida la absorbancia en la longitud de onda de 405 nanómetros con el lector de placas multietiqueta EnVision.

Esta es la vista representativa de los osteoclastos observados en campo claro en el sexto día. La línea roja delineaba el borde de los osteoclastos. Y aquí se muestra un osteoclasto típicamente gigante, multinucleado y positivo para TRAP.

La flecha negra indicaba dos núcleos del osteoclasto multinucleado. Esta figura muestra la tinción TRAP de BMMs en el sexto día. Se muestran imágenes de gran aumento de los cuadrados en los grupos knockout de tipo salvaje y Ctsk-Cre Raptor, respectivamente.

Estos eran osteoclastos menos gigantes, TRAP positivos, formados en los BMM knockout Ctsk-Cre Raptor en comparación con el grupo de tipo salvaje. Esta figura muestra la actividad TRAP de BMMs cultivados de tipo salvaje y Ctsk-Cre Raptor knockout. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una semana si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la viabilidad de los macrófagos de la médula ósea, ya que la densidad óptima de siembra de macrófagos viables de la médula ósea es fundamental. Se recomienda mantener el hueso en hielo no más de una hora y resuspender las células suavemente. Este procedimiento puede combinarse con otros métodos, como el ensayo de reabsorción de osteoclastos con cortes de hueso, para estudiar la fisiología normal y patológica de los osteoclastos.

Con este método, descubrimos que mTORC1 desempeña un papel importante en la formación de osteoclastos, lo que puede actuar como una diana farmacológica potencial para el tratamiento de trastornos metabólicos óseos, como la osteoporosis, en el futuro.