Inducción y Micro-CT en la proyección de imagen de malformaciones cavernosas cerebrales en modelo murino
September 4th, 2017
Este protocolo demuestra la inducción de la enfermedad de malformación cavernosa cerebral en un modelo de ratón y utiliza contraste realzado micro tomografía para medir la carga de lesión. Este método aumenta el valor de modelos de ratón establecido para estudiar la base molecular y terapias potenciales para la malformación cavernosa cerebral y otras enfermedades cerebrovasculares.
El objetivo general de este procedimiento es inducir malformaciones cavernosas cerebrales en ratones neonatos y medir la carga de la enfermedad mediante micro-CT. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades vasculares cerebrales, como las malformaciones cavernosas cerebrales. La principal ventaja de esta técnica es que la carga de enfermedad por malformación cavernosa cerebral en modelos neonatos de ratón puede determinarse de forma precisa y eficiente en comparación con los métodos existentes.
La demostración visual de este método es fundamental, ya que la inducción de la malformación cavernosa cerebral y los pasos de análisis de la micro-TC son difíciles de aprender, ya que requieren experiencia y el uso de software sofisticado. Comience disolviendo 4-HT en etanol al 100% a una concentración de 10 miligramos por mililitro. Prepare 30 alaquads de microlitros y luego guárdelos a menos 80 grados centígrados.
El día de uso, diluya el alaquad a 4-HT en aceite de maíz a 0,5 miligramos por mililitro. A continuación, utilice una jeringa de insulina para inyectar introgástricamente 50 microlitros de 4-HT en crías neonatales P1 para inducir lesiones experimentales de MCC. Comience la preparación de la muestra llenando una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 29 con tres mililitros de paraformaldehído al 2% y PBS.
A continuación, realice la profusión intracardíaca en la cría P8 euthenizada insertando la aguja en el ventrículo del corazón del ratón e inyectando lentamente el volumen completo de paraformaldehído. Después de usar tijeras para separar la cabeza, retire la piel de la cabeza y pegue el cráneo con pinzas para diseccionar todo el cerebro en 4% de paraformaldehído y PBS. Fije el cerebro durante la noche a 4 grados centígrados.
Al día siguiente, separe los cerebros posteriores con pinzas y enjuague con una solución de PBS. Luego incube los cerebros posteriores en la solución de yodo de Lugol, durante 48 horas. Después de la incubación, seque brevemente al aire los cerebros posteriores para eliminar el exceso de solución de yodo de Lugol.
A continuación, empaque los cerebros traseros teñidos con yodo de Lugol en tubos de microcentrífuga de 0,65 microlitros y selle completamente con una película plástica de parafina para evitar la contracción del tejido. Coloque los tubos de microcentrífuga en tubos de plástico de cinco mililitros con esponjas para evitar que se muevan durante el escaneo. Monte verticalmente el tubo que contiene un cerebro posterior en un soporte de aluminio en el sistema micro-CT.
Establezca los parámetros de escaneo. Utilice 540 proyecciones y un tiempo de exposición de dos segundos con condiciones de fuente de 50 kilovoltios y 10 vatios para adquirir los conjuntos de datos tomográficos. Los gráficos de radio de la exploración se reconstruyen automáticamente mediante un software de reconstrucción de proyección basado en hardware, suministrado por el sistema de micro-CT, produciendo una serie de imágenes de cortes axiales de 16 bits.
La micro-TC contrastada con yodo de Lugol detectó suficientemente las lesiones de la MCC. Las imágenes de rayos X escaneadas se reconstruyeron para producir imágenes en 3D del cerebro del ratón, lo que permitió la visualización de lesiones completas en el parénquima cerebral, a diferentes profundidades y orientaciones, y la evaluación de la estructura en la ubicación en 3D de las lesiones en el cerebro. Esta tabla muestra un ejemplo de salida cuantitativa de las lesiones individuales marcadas.
Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades vasculares exploraran el mecanismo y las opciones terapéuticas para las malformaciones cavernosas cerebrales en modelos de ratón. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inducir la lesión de CCM en modelos de ratón y cómo adquirir y analizar la carga de lesiones de CCM con la técnica de micro-CT.
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Visión general
Este protocolo demuestra la inducción de la enfermedad de malformación cavernosa cerebral en ratones neonatales y utiliza micro-CT para medir la carga de lesiones. Este método mejora la comprensión de la base molecular y las posibles terapias para la malformación cavernosa cerebral y otras enfermedades cerebrovasculares.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Vascular
- Modelos de Ratones
Antecedentes
- Las malformaciones cavernosas cerebrales (CCMs) son lesiones vasculares que pueden conducir a problemas neurológicos significativos.
- Los métodos existentes para medir la carga de la enfermedad en modelos de ratones a menudo son ineficientes.
- Micro-CT ofrece una forma no invasiva de visualizar y cuantificar lesiones.
- Entender las CCMs puede proporcionar información sobre otras enfermedades cerebrovasculares.
Propósito del estudio
- Inducir malformaciones cavernosas cerebrales en ratones neonatales.
- Medir con precisión la carga de la enfermedad usando micro-CT.
- Mejorar las metodologías para estudiar enfermedades cerebrovasculares.
Métodos utilizados
- Disolución de 4-HT en etanol para crear una solución para inducir CCMs.
- Preparación de alícuotas para almacenamiento a -80 grados Celsius.
- Utilización de micro-CT con contraste para la imagen.
- Demostración visual del proceso de inducción y análisis.
Resultados principales
- El método permite una determinación precisa y eficiente de la carga de la enfermedad CCM.
- Micro-CT proporciona una visualización clara de las lesiones en los modelos de ratón.
- La inducción de CCMs se logró con éxito en ratones neonatales.
- Este enfoque puede facilitar la investigación adicional en posibles terapias.
Conclusiones
- Este protocolo mejora el valor de los modelos de ratón para estudiar CCMs.
- Micro-CT es una herramienta poderosa para evaluar la carga de enfermedades cerebrovasculares.
- Estudios futuros pueden basarse en esta metodología para explorar opciones terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Quantitative micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations (CCMs) in genetically engineered mouse models enables precise assessment of lesion burden, supporting mechanistic de-risking and target validation in cerebrovascular disease research. This approach enhances predictive confidence for early-stage therapeutic hypothesis testing and informs portfolio triage by providing robust, reproducible lesion quantification. Integration of high-resolution imaging with genetic disease models positions this workflow as a critical inflection point for translational continuity in vascular biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of CCM gene function and pathway involvement in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying lesion formation following targeted gene deletion.
- Provides functional target validation through direct measurement of disease-relevant phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in selecting or deprioritizing molecular targets for further study.
Screening & Assay Development
- Establishes validated mouse models and imaging protocols for downstream compound screening.
- Delivers standardized, quantitative lesion metrics suitable for assay development and reproducibility assessment.
- Enables scalable, high-throughput evaluation of therapeutic interventions in preclinical settings.
- Supports reliable comparison of experimental conditions through consistent imaging outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease genetics for translational biomarker development.
- Ensures continuity from genetic discovery to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Reduces translational risk by providing quantitative endpoints for disease progression and intervention efficacy.
- Strengthens mechanistic understanding of cerebrovascular pathology relevant to clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven genetic manipulation and quantitative phenotyping in mouse models, supporting lead identification and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing and pathway clarification through genetic lesion induction and quantification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Delivers volumetric and numerical lesion data to support statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects genetic models to disease-relevant endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse cerebrovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes lesion quantification and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic mouse model handling and micro-CT imaging protocols.
- Demands access to high-resolution micro-CT instrumentation and specialized analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data interpretation.
- May require adaptation of protocols for different genetic backgrounds or lesion types.
- Dependent on precise sample preparation and imaging conditions to ensure data quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
