Name: Inducción y Micro-CT en la proyección de imagen de malformaciones cavernosas cerebrales en modelo murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Aprende a inducir malformaciones cavernosas cerebrales en ratones neonatales y a medir la carga de la enfermedad mediante micro-CT. Este método permite visualizar lesiones vasculares con alta precisión para investigar enfermedades cerebrovasculares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores reconocen las instalaciones y la asistencia científica y técnica de la microscopía de Sydney y centro de investigación de microanálisis (AMMRF) y el centro australiano de microscopía y microanálisis (ACMM) en la Universidad de Sydney. Estos estudios fueron apoyados por nacional australiano de salud y Consejo de investigación médica (NHMRC) proyecto beca 161558 y APP1124011 (XZ).

todos los animal ética y protocolos fueron aprobados por el Sydney Local salud distrito Animal Comité de bienestar institucional Animal atención y Comité uso (IACUC) de la Universidad de medicina de Tianjin. Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices/normas del Instituto Centenario, Universidad de Sydney y Universidad de medicina de Tianjin 1. Inducción de malformaciones cavernosas cerebrales en modelos de ratón <ol><li>Cruz Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl ratones con Ccm2 fl/fl generar camadas con Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl (Ccm2 iECKO) cachorros y littermate controles (Ccm2 fl/fl). CreErt2 Cdh5 y Ccm2 fl/fl animales han sido previamente descritos 19.</li>
	<li>Disolver 4HT en etanol al 100% y almacenar a-80 ° C en alícuotas de 30 μl (4HT concentración: 10 mg/mL). En el día de uso, diluir alícuotas 4HT en aceite de maíz (0.5 mg/mL).</li>
	<li>Intragástricamente inyectar 50 μl de 4HT (0.5 mg/mL) a cachorros neonatales en P1 para inducir lesiones CCM experimentales utilizando una jeringa de insulina.</li>
</ol> 2. Preparación de exploraciones del Micro-CT de la muestra <ol><li>eutanasia neonatales cachorros en P8 mediante asfixia dióxido de carbono.</li>
	<li>Realizar perfusión intra cardiaca mediante la inserción de una aguja de calibre 29 con 3 mL de paraformaldehído al 2% en PBS en una jeringa de 10 mL en el ventrículo del corazón de ratón. 
	PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar protección adecuada.</li>
	<li>Separar la cabeza del cuerpo usando unas tijeras. Quitar toda la piel de la cabeza usando unas tijeras y retire el cráneo usando pinzas para diseccionar el cerebro entero.</li>
	<li>Tomar imágenes del cerebro con el estereomicroscopio en 7,82 x aumento, aumento de x 1, gamma 0,6 y tiempo de exposición de 20 ms.</li>
	<li>Fijar los cerebros disecados con paraformaldehído al 4% en solución de PBS durante la noche. 
	PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar protección adecuada.</li>
	<li>Al día siguiente, separar usando un fórceps de hindbrains y lavarse con solución de PBS.</li>
	<li>Incubar hindbrains en Lugol &#39; solución de yodo de s para 48 h.</li>
	<li>Después de la incubación, brevemente aire seco hindbrains para quitar exceso Lugol &#39; solución de yodo s.</li>
	<li>Paquete el Lugol &#39; yodo s manchado hindbrains en tubos de microcentrífuga de 0,65 mL y sello totalmente con película de plástico de parafina para evitar la contracción del tejido ( figura 2 A).</li>
	<li>Colocar tubos de microcentrífuga en tubos de plástico de 5 mL con esponjas para evitar movimientos durante la exploración ( figura 2 B).</li>
</ol> 3. Micro-CT Scan de CCM en el cerebro de ratón <ol><li>montar verticalmente el cerebelo que se embalará en un tubo sobre un soporte de aluminio en el sistema de micro-CT.</li>
	<li>Configurar los parámetros de exploración 540 proyecciones y tiempo de exposición de s 2 condiciones fuente de 50 kV y 10 W para adquirir los conjuntos de datos tomográficos (imagen resolución 9,5 μm/píxeles).</li>
	<li>Las radiografías de la exploración se reconstruyen automáticamente por el software de reconstrucción de proyección basados en hardware suministrado por el sistema de micro-CT, produciendo una serie de imágenes de cortes axiales de 16-bit (&#34; TXM &#34; archivo).</li>
</ol> 4. Análisis de conjuntos de datos de Micro-CT <ol><li>abrir el archivo de imagen reconstruida (&#34; TXM &#34; archivo) en el software de análisis 3D y visualizar el cerebro usando la &#34; volumétrica &#34; función.</li>
	<li>Transformar el cerebelo a la orientación deseada usando el &#34; rectángulo de &#34; y &#34; plano de recorte &#34; funciones.</li>
	<li>Volver a muestrear la imagen transformada en modo extendido y preservar el tamaño de voxel.</li>
	<li>Crear &#34; editar nueva etiqueta campo &#34; en la imagen transformada (4.3) y resaltar solo el cerebelo con intensidad en escala de grises.</li>
	<li>Agregar las zonas resaltadas y ejecutar &#34; Análisis de la etiqueta &#34; para obtener mediciones del cerebelo todo (es decir, volumen total y área). Exportación medidas en un archivo de Excel.</li>
	<li>Visualizar el cerebelo usando la &#34; representación de isosuperficies &#34; función.</li>
	<li>Crear otro &#34; editar nueva etiqueta campo &#34; en las transformada imagen y resaltar las áreas con lesiones usando la intensidad en escala de grises.</li>
	<li>Agregar las zonas resaltadas y ejecutar &#34; etiqueta &#34; análisis para obtener mediciones de las lesiones en el cerebelo (es decir, volumen total y área). Exportación medidas en un archivo de Excel.</li>
	<li>Visualizar las lesiones utilizando el &#34; generar superficie &#34; y &#34; de la superficie vista &#34; funciones.</li>
	<li>Instantánea de las imágenes del cerebelo en orientaciones deseadas o generar una película para la visualización 3D de las lesiones.</li>
</ol>

<ol><li>Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cavernous+malformations%3A+from+CCM+genes+to+endothelial+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis.</a> Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).</li>
<li>Liquori, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+gene+encoding+a+novel+protein+containing+a+phosphotyrosine-binding+domain+cause+type+2+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).</li>
<li>Laberge-le Couteulx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncating+mutations+in+CCM1%2C+encoding+KRIT1%2C+cause+hereditary+cavernous+angiomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas.</a> Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).</li>
<li>Sahoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+gene+encoding+KRIT1%2C+a+Krev-1%2Frap1a+binding+protein%2C+cause+cerebral+cavernous+malformations+%28CCM1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1).</a> Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).</li>
<li>Denier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+MGC4607+gene+cause+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).</li>
<li>Bergametti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+programmed+cell+death+10+gene+cause+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).</li>
<li>McDonald, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+of+cerebral+cavernous+malformations+based+on+the+two-hit+mutation+hypothesis+recapitulates+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease.</a> Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).</li>
<li>Boulday, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+timing+of+CCM2+loss+influences+cerebral+cavernous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice.</a> J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).</li>
<li>Chan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+2+distinct+genetic+pathways+result+in+cerebral+cavernous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice.</a> J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cavernous+malformations+arise+independent+of+the+heart+of+glass+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor.</a> Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).</li>
<li>McDonald, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasudil+decreases+lesion+burden+in+a+murine+model+of+cerebral+cavernous+malformation+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease.</a> Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).</li>
<li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li>
<li>Gibson, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+identifying+repurposed+drugs+for+the+treatment+of+cerebral+cavernous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation.</a> Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).</li>
<li>Choi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+Imaging+Reveals+Mekk3+Heterozygosity+Prevents+Cerebral+Cavernous+Malformations+in+Ccm2-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice.</a> PLoS One. 11 (8), 0160833(2016).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cavernous+malformations+arise+from+endothelial+gain+of+MEKK3-KLF2%2F4+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling.</a> Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+comparative+morphology%3A+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiol. 9, 11(2009).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), 61(2006).</li>
<li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Procedure+for+Rapid+Imaging+of+Adult+Mouse+Brains+with+MicroCT+Using+Iodine-Based+Contrast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast.</a> PLoS One. 10 (11), 0142974(2015).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+cerebral+cavernous+malformation+pathway+controls+vascular+stability+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth.</a> Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

CCM es una malformación vascular común que afecta hasta el 0,5% de los individuos1. CCM puede ocurrir en forma esporádica o familiar. Pronóstico paciente desconoce a menudo como lesiones CCM pueden romperse inesperadamente para causar derrame cerebral y otras consecuencias neurológicas. Actualmente, la opción único tratamiento es extirpar quirúrgicamente las lesiones, que van acompañadas de alto riesgo.
Las condiciones humanas de CCM han sido reproducidas recientemente ...

CCM son de paredes delgadas, dilatados malformaciones vasculares en el cerebro con prevalencia de hasta el 0,5% en la población humana1. CCM puede ser heredado como un desorden dominante debido a las mutaciones de pérdida de función en uno de tres genes: CCM1 (aka Krit1), CCM2y CCM3 (también llamado PDCD10)2,3,4 ,5,6. Estos genes están presentes en un solo complejo de señalización.
Varios modelos se han desarrollado la enfermedad humana de CCM modelo y comprender las vías descendentes de los genes CCM que son responsables de CCM7,8,9,10. El modelo más robusto es condicional eliminar alguno de los genes MCP con tamoxifeno-inducible CreERT2 Cdh5 en P1 en cachorros recién nacidos8,10. Estos cachorros desarrollan lesiones CCM en el cerebro de P6 hacia adelante y se espera que sean un modelo ideal para los estudios preclínicos en búsqueda de mecanismos y agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedades CCM.
CCM lesión en cerebro de ratón se ha medido principalmente por métodos basados en la histología, un enfoque que es extremadamente lento y sujeto a investigador diagonal10,11,12. Métodos de MRI basado se han utilizado para evaluar la carga de lesión CCM en el ratón adulto modelo9,13. Sin embargo, un especializado instrumento de MRI animal pequeño y largo tiempo de la exploración de varias horas hasta toda la noche es necesaria para lograr una resolución satisfactoria para identificar lesiones CCM. Además, si la MRI puede usarse para detectar lesiones CCM en ratones neonatales no se ha divulgado y resolución puede limitar la sensibilidad.
Recientemente hemos desarrollado una técnica de micro-CT para la imagen y analizar CCM lesión14,15. Esta alta resolución, tiempo y rentable método dramáticamente habían aumentado el valor del modelo de enfermedad CCM en estudios mecanísticos y terapéuticos. Métodos de tinción mejoran el contraste, todo Monte se han utilizado para micro-CT en la proyección de imagen de tejidos blandos y de embriones de ratón16,17. Previamente, hemos utilizado una tinción basada en osmio para mejorar contraste para micro-CT en la proyección de imagen de las lesiones CCM en el cerebro14. En este trabajo, usamos menos tóxico, no-destructiva, y reactivo eficiente, un yodo basado en solución de Lugol, para mejorar el contraste para la proyección de imagen micro-CT. Yodo puede difundir a través del cerebro y tiene una alta afinidad de sangre18.
El protocolo detallado se presenta aquí de la inducción de lesiones CCM en un modelo de ratón neonatal junto con la proyección de imagen y análisis de las lesiones CCM con un contraste basado en micro-CT. Este método basado en micro-CT proporciona medición cuantitativa global del volumen de lesión CCM, identifica con precisión el número y la localización 3D de CCM lesiones en el cerebro de ratón y reduce el costo y tiempo requerido para el fenotipo de estos animales.

<table><tbody><tr><td>4-hidroxitamoxifeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6278</td><td>Para activar Cdh5-CreErt2</td></tr><tr><td>Aceite de maíz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td>Para diluir 4-hidroxi tamoxifeno</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>M205FA</td><td>Para tomar imágenes macroscópicas</td></tr><tr><td>Solución de yodo de Lugol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6146</td><td>Para teñir muestras para micro-CT</td></tr> <tr><td>de contrastePelícula de parafina plástica</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>Para empaquetar muestras</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Xradia</td><td>MicroXCT-400</td><td>Micro-CT</td></tr><tr><td>3D software</td><td>FEI Visualization Science group</td><td>Avizo Software de procesamiento de imágenes 3D</td><td>Para analizar micro-CT</td></tr></tbody></table>

inducción y micro-ct en la proyección de imagen de malformaciones cavernosas cerebrales en modelo murino

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Las mutaciones en el CCM1 (aka KRIT1), CCM2, o CCM3 (aka PDCD10) gene causar malformación cavernosa cerebral (CCM) en seres humanos. Se han establecido modelos de ratón de la enfermedad CCM por tamoxifeno inducido supresión de genes de Ccm en animales postnatales. Estos modelos de ratón proporcionan herramientas muy valiosas para investigar el mecanismo molecular y aproximaciones terapéuticas para la enfermedad CCM. Un método preciso y cuantitativo para evaluar la progresión y la carga de lesión es fundamental para aprovechar todo el valor de estos modelos animales. Aquí, demostramos la inducción de la enfermedad en un modelo murino de CCM y el uso del contraste mejorado método de (micro-CT) micro tomografía de rayos x a medida CCM lesión carga en cerebros de ratón. En el día postnatal 1 (P1), utilizamos 4-hydroxytamoxifen (4HT) para activar la actividad recombinase de Cre de transgén Cdh5 CreErt2 hender el alelo floxed del Ccm2. Se analizaron las lesiones CCM en cerebros de ratón en P8. Para micro-CT, solución de Lugol yodo basado fue utilizado para mejorar el contraste en el tejido cerebral. Hemos optimizado los parámetros de exploración y utiliza una dimensión del voxel de 9,5 μm, que conducen a un tamaño mínimo de la función de aproximadamente 25 μm. Esta resolución es suficiente para medir el número y volumen de la lesión CCM a nivel global y precisa y proporcionar cartografía 3D de alta calidad de lesiones CCM en cerebros de ratón. Este método aumenta el valor de los modelos de ratón establecido para estudiar la base molecular y terapias potenciales para CCM y otras enfermedades cerebrovasculares.

Una sola inyección de 4HT en P1 fue suficiente para inducir lesiones en el cerebelo de CCM. Micro-CT en contraste de yodo de Lugol suficientemente detectó lesiones CCM y podría cuantificar su número y volumen. Utilizando el micro-CT en optimizado, imágenes de lesiones CCM en el hindbrains de ratones Ccm2iECKO . Se reconstruyeron imágenes escaneadas de rayos x para producir imágenes 3D de cerebro de ratón, que permitió la visualización de todas lesiones en el parénquim...

Este protocolo demuestra la inducción de la enfermedad de malformación cavernosa cerebral en un modelo de ratón y utiliza contraste realzado micro tomografía para medir la carga de lesión. Este método aumenta el valor de modelos de ratón establecido para estudiar la base molecular y terapias potenciales para la malformación cavernosa cerebral y otras enfermedades cerebrovasculares.

Inducción y Micro-CT en la proyección de imagen de malformaciones cavernosas cerebrales en modelo murino

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir malformaciones cavernosas cerebrales en ratones neonatos y medir la carga de la enfermedad mediante micro-CT. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades vasculares cerebrales, como las malformaciones cavernosas cerebrales. La principal ventaja de esta técnica es que la carga de enfermedad por malformación cavernosa cerebral en modelos neonatos de ratón puede determinarse de forma precisa y eficiente en comparación con los métodos existentes.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la inducción de la malformación cavernosa cerebral y los pasos de análisis de la micro-TC son difíciles de aprender, ya que requieren experiencia y el uso de software sofisticado. Comience disolviendo 4-HT en etanol al 100% a una concentración de 10 miligramos por mililitro. Prepare 30 alaquads de microlitros y luego guárdelos a menos 80 grados centígrados.El día de uso, diluya el alaquad a 4-HT en aceite de maíz a 0,5 miligramos por mililitro. A continuación, utilice una jeringa de insulina para inyectar introgástricamente 50 microlitros de 4-HT en crías neonatales P1 para inducir lesiones experimentales de MCC. Comience la preparación de la muestra llenando una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 29 con tres mililitros de paraformaldehído al 2% y PBS.A continuación, realice la profusión intracardíaca en la cría P8 euthenizada insertando la aguja en el ventrículo del corazón del ratón e inyectando lentamente el volumen completo de paraformaldehído. Después de usar tijeras para separar la cabeza, retire la piel de la cabeza y pegue el cráneo con pinzas para diseccionar todo el cerebro en 4% de paraformaldehído y PBS. Fije el cerebro durante la noche a 4 grados centígrados.Al día siguiente, separe los cerebros posteriores con pinzas y enjuague con una solución de PBS. Luego incube los cerebros posteriores en la solución de yodo de Lugol, durante 48 horas. Después de la incubación, seque brevemente al aire los cerebros posteriores para eliminar el exceso de solución de yodo de Lugol.A continuación, empaque los cerebros traseros teñidos con yodo de Lugol en tubos de microcentrífuga de 0,65 microlitros y selle completamente con una película plástica de parafina para evitar la contracción del tejido. Coloque los tubos de microcentrífuga en tubos de plástico de cinco mililitros con esponjas para evitar que se muevan durante el escaneo. Monte verticalmente el tubo que contiene un cerebro posterior en un soporte de aluminio en el sistema micro-CT.Establezca los parámetros de escaneo. Utilice 540 proyecciones y un tiempo de exposición de dos segundos con condiciones de fuente de 50 kilovoltios y 10 vatios para adquirir los conjuntos de datos tomográficos. Los gráficos de radio de la exploración se reconstruyen automáticamente mediante un software de reconstrucción de proyección basado en hardware, suministrado por el sistema de micro-CT, produciendo una serie de imágenes de cortes axiales de 16 bits.La micro-TC contrastada con yodo de Lugol detectó suficientemente las lesiones de la MCC. Las imágenes de rayos X escaneadas se reconstruyeron para producir imágenes en 3D del cerebro del ratón, lo que permitió la visualización de lesiones completas en el parénquima cerebral, a diferentes profundidades y orientaciones, y la evaluación de la estructura en la ubicación en 3D de las lesiones en el cerebro. Esta tabla muestra un ejemplo de salida cuantitativa de las lesiones individuales marcadas.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades vasculares exploraran el mecanismo y las opciones terapéuticas para las malformaciones cavernosas cerebrales en modelos de ratón. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inducir la lesión de CCM en modelos de ratón y cómo adquirir y analizar la carga de lesiones de CCM con la técnica de micro-CT.

induction-micro-ct-imaging-cerebral-cavernous-malformations-mouse

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Un mayor contraste de imagen pequeña embarcación animales microCT es una manera rápida, rentable y de alto rendimiento para la técnica...

Contraste de imagen mejorada del buque utilizando MicroCT

En este artículo presentamos una técnica sencilla y práctica para la fundición cerebrovascular que es fácil de realizar y pueden ser utilizados para obtener imágenes del árbol vascular del cerebro del ratón adulto.

Fundición cerebrovascular del ratón adulto de imágenes en 3D y el análisis morfológico

Fuente: Xavier, A. L. R., et al. Implantación de cánula en la cisterna magna de roedores. J. Vis. Exp. (2018)Este video muestra el procedimiento para implantar una cánula en la cisterna magna de un ratón anestesiado. La técnica consiste en guiar una cánula montada con aguja a través de la duramadre hacia la cisterna magna triangular invertida y asegurarla para su administración dirigida al líquido cefalorraquídeo.

Implantación de cánula en la cisterna magna en un modelo de ratón

En este video, una cría de ratón modificada genéticamente portadora del gen Ccm2 flanqueada por sitios loxP y Cre recombinasa fusionada con un receptor de estrógeno se utiliza para inducir malformaciones cavernosas cerebrales (MCC). La administración de 4-hidroxitamoxifeno activa Cre en las células endoteliales, lo que conduce a la deleción de Ccm2 y la formación de CCM en el cerebro.

Inducción mediada por Cre-LoxP de malformaciones cavernosas cerebrales en un modelo de ratón

Fuente: Choi, J. P. et al. Imágenes de inducción y micro-TC de malformaciones cavernosas cerebrales en modelo de ratón. J. vis. exp. ( 2017)Este video demuestra el uso de imágenes de micro-CT para visualizar lesiones de malformación cavernosa cerebral (CCM) en el cerebro de un ratón. En él se detallan los pasos para la preparación de la muestra, la obtención de imágenes y la reconstrucción de imágenes en 3D para evaluar la densidad y la ubicación de las lesiones de la MCC en el tejido cerebral.

Imágenes de micro-TC con contraste de lesiones de malformaciones cavernosas cerebrales en el cerebro de un ratón

Fuente: Kim, D., et. al. Combinación de imágenes fluorescentes de infrarrojo cercano y tomografía microcomputarizada para la visualización directa de tromboembolios cerebrales. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la visualización de trombos cerebrales en ratones utilizando imágenes de microtomografía computarizada (micro-CT). A un modelo de ratón con trombo cerebral se le inyectan nanopartículas de oro dirigidas a la fibrina que actúan como agente de contraste. El ratón se coloca en la cama...

Visualización de un trombo cerebral en un ratón mediante imágenes de microtomografía computarizada

Este protocolo describe la aplicación de la tomografía combinado fluorescente en el infrarrojo cercano (NIRF) de formación de imágenes y micro-computarizada (microCT) para la visualización de tromboembolia cerebral. Esta técnica permite la cuantificación de la carga de trombo y la evolución. La técnica de imagen NIRF imagina y marcado con fluorescencia de trombos en el cerebro escindido, mientras que la técnica microCT visualiza trombo dentro de animales vivos utilizando nanopartículas de oro-.

Imagen Fluorescente combinado del infrarrojo cercano y la tomografía computarizada-Micro para visualizar de manera directa tromboembolia cerebral

El objetivo de este artículo es presentar un método que permite una reconstrucción 3 dimensional del árbol cerebrovascular en ratones después micro tomografía computada y determinación de volúmenes de segmentos de todo buque que pueden utilizarse para cuantificar el vasoespasmo cerebral en modelos murinos de hemorragia subaracnoidea.

Un método volumétrico para la cuantificación de vasoespasmo Cerebral en un modelo murino de hemorragia subaracnoidea

Este artículo describe un método sencillo para preparar pequeños cerebros animales micro-CT en la proyección de imagen, en que las lesiones se pueden cuantificar y electrodos con alta precisión en el contexto de todo el cerebro.

Un método basado en el Micro-CT para caracterizar las lesiones y la localización de electrodos en cerebros de animales pequeños

En este trabajo, presentamos un protocolo para establecer un modelo de oclusión distal de la arteria cerebral media (dMCAO) mediante electrocoagulación transcraneal en ratones C57BL/6J y evaluamos el comportamiento neurológico y las características histopatológicas posteriores.

Inducción de ictus isquémico agudo en ratones mediante la técnica de oclusión de la arteria media distal

El protocolo describe un método para inyectar células tumorales a través de la vía de punción percutánea en la cisterna magna que induce de forma robusta la metástasis leptomeníngea en ratones, reduciendo el trauma y la carga tumoral extracraneal.

Modelo de inyección mínimamente invasiva de cisterna magna para estudios de metástasis leptomeníngeas en ratones

Aprende a inducir malformaciones cavernosas cerebrales en ratones neonatales y a medir la carga de la enfermedad mediante micro-CT. Este método permite visualizar lesiones vasculares con alta precisión para investigar enfermedades cerebrovasculares.

Inducción y Micro-CT en la proyección de imagen de malformaciones cavernosas cerebrales en modelo murino

Explorar más videos