Name: Un modelo de trofoblasto humano primario para estudiar el efecto de la inflamación asociado con obesidad materna sobre la regulación de la autofagia en la Placenta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprende a aislar citotrofoblastos primarios de tejido placentario humano para estudiar la regulación génica mediada por TNFα en el contexto de obesidad materna. Este modelo permite identificar dianas moleculares en disfunción placentaria.

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Los autores agradecen a las mujeres que donaron sus placentas para este estudio. También agradecemos el trabajo y entrega Departamento OHSU y Maternal y Fetal equipo de investigación de la coordinación de la colección de placentas. Agradecemos a Eric Wang, pH.d. y Kelly Kuo, MD por apoyo y ayuda con métodos experimentales y optimización.
Este trabajo fue financiado por los NIH HD076259A (AM) y AHA GRNT29960007 (AM).

la placenta se recogieron de la mano de obra y entrega de unidad en Hospital Universitario bajo un protocolo aprobado por el institucional de Junta de Oregon Health and Science University en Portland, Oregon, con el consentimiento informado de la pacientes.
 1. colección de tejido placentario <ol><li>preparación de Nota: todo el equipo que se encuentra el tejido debe ser estéril.
	<ol><li>Esterilizar el equipo de disección en autoclave durante 60 min a 121 ° C.</li>
		<li>Utilizar equipo de protección personal (EPP): laboratorio capas/vestidos/exfoliantes, guantes y máscara con una careta o gafas de seguridad.</li>
		<li>Vuelta en baño de agua y a 37 ° C.</li>
		<li>Caliente dos tubos cónicos de 50 mL, cada que contiene 25 mL de medio completo (Iscove &#39; s Modified Dulbecco &#39; s suplementado con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina, tabla 3) en un baño de agua de 37 ° C.</li>
		<li>Con el consentimiento informado del paciente, obtener una placenta inmediatamente después del parto por cesárea.</li>
		<li>Familiarizarse con la placenta. Se observan vasos sanguíneos irradiando hacia fuera desde el sitio de inserción del cordón umbilical y el cordón umbilical se inserta en el lado fetal (placa coriónica). El lado opuesto es el lado materno, o placa basal. Incluye la decidua y las estructuras que contienen árboles de vasos, llamados cotiledones.</li>
	</ol></li> <li>Toma de muestras de tejido velloso Nota: debe ser muestreado tejido velloso de la placenta tan pronto como sea posible después del parto, preferiblemente en 30 minutos o menos.
	<ol><li>Con la placa coriónica hacia arriba y suprimir secciones de espesor total de 2-3 (aproximadamente 2,5 cm x 2,5 cm de tamaño) 2-3 cm en de la periferia de la placenta al azar, utilizando pinzas y tijeras ( figura 1A). 
		Nota: Evitar partes de la placenta que aparecen anormales (es decir, blancas calcificaciones).</li>
		<li>Recorte las placas coriónicas y basals y cualquier vasos sanguíneos grandes.</li>
		<li>Ponga el tejido velloso resultante ( figura 1B, total aproximadamente de 80-120 g) en medios completo calientes y empieza a aislamiento de trofoblasto dentro de 30 minutos de muestreo. 
		Nota: Algunas aplicaciones y ensayos posteriores son afectadas por la duración del período de latencia entre el nacimiento, muestreo y aislamiento de trofoblasto. Es mejor mantener estos períodos tan cortos como sea posible y consistente entre aislamientos.</li>
		<li>Utilizando las técnicas descritas en los pasos 1.2.1 - 1.2.2, muestra 5 secciones al azar de 1 x 1 cm de tejido velloso a través de la placenta (incluyendo el centro).</li>
		<li>Corte cada muestra de tejido velloso de 1 cm x 1 cm en 4-5 trozos más pequeños (aproximadamente 30 mg cada una), colocar en tubos de microcentrífuga de 2 mL y flash freeze en líquido N 2. Tienda a-80 ° C para su uso en análisis más adelante.</li>
	</ol></li></ol> 2. Aislamiento de trofoblastos del tejido velloso <ol><li>preparación de Nota: utilizar material estéril y realizar procedimientos que involucran células en campana de flujo laminar.
	<ol><li>Deshielo cuatro gradientes de densidad congelados (tabla 1, ver tabla de suministros esenciales, reactivos y equipo, material complementario) a 4 ° C la noche antes de la placenta llega. 
		Nota: Alternativamente, gradientes de densidad se pueden hacer en el día del aislamiento.</li>
		<li>Vuelta en centrífuga y a 20 ° C. 
		Nota: Todos los pasos de centrifugación son en máxima aceleración y desaceleración a menos que se especifique lo contrario.</li>
		<li>Prepare 1 x solución salina tamponada con HEPES (HBSS) suplementado con Ca + 2 y Mg + 2 (tabla 3).</li>
		<li>Tripsina caliente a 37 ° C.</li>
		<li>DNasa diluir a aproximadamente 2720 kilounits/mL en estéril suplido HBSS.</li>
		<li>Caliente 50 mL de suero de recién nacidos (NCS) a 37 ° C.</li>
		<li>Caliente media completa a 37 ° C.</li>
		<li>Caliente media congelación (90% de SBF, 10% DMSO, tabla 3) a 37 ° C. 
		PRECAUCIÓN: DMSO es tóxica y debe manipularse con guantes.</li>
		Buffer de <li>preparar la digestión (tabla 2 y 3) mediante la mezcla de 308 mL de suplido HBSS, 50 mL de tripsina (3751.7 y unidades/mL) y 0.5 mL de DNasa (379.4 kilounits/mL) en una botella estéril. 
		Nota: El tiempo aproximado necesario para aislar las células del tejido velloso es 7 h.</li>
	</ol></li> <li>Procesamiento del tejido velloso <ol><li>enjuague cada pieza de tejido velloso en un tubo cónico de 50 mL llena con temperatura ambiente fosfato tampón salino (PBS). Repita y cambie el PBS como sea necesario hasta retira el exceso de sangre (enjuague de PBS será rojo claro o rosado cuando el tejido es completamente aclarado).</li>
		<li>Colocar el tejido velloso en una placa Petri estéril y eliminar fuera de muchos vasos sanguíneos posible raspando suavemente el tejido velloso suave de los vasos con un portaobjetos de microscopio.</li>
		<li>Pique finamente el tejido velloso resultante usando tijeras.</li>
	</ol></li> <li>Digestión de tejido velloso y aislamiento bruto de trofoblastos <ol><li>transferir el tejido velloso picadito a un frasco estéril con solución de digestión según los volúmenes calculados basados en la actividad específica de la tripsina y ADNasa (165 mL, tabla 2).</li>
		<li>Después de 35 min de incubación en baño de agua de 37 ° C con agitación a 70 revoluciones por minuto (rpm), incline la botella de la digestión a su lado y deje que las piezas no digeridas del tejido para colocar en la parte inferior de la botella. Elaborar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta serológica, evitando el tejido colocado.</li>
		<li>Dispensar el sobrenadante a través de un tamiz de celular 100 μm igualmente entre tubos cónicos de 50 mL. 
		Nota: Para ahorrar tiempo, es recomendable comenzar la segunda digestión por adición de solución de digestión (110 mL, tabla 2) para el restante colocó tejido y reasumir la incubación como se describe en el paso 2.3.2.</li>
		<li>Capa suavemente 3-5 mL de NCS debajo el sobrenadante filtrado por dispensación lentamente de una pipeta serológica en la parte inferior del tubo. Un menisco entre el sobrenadante filtrado (que contiene los trofoblastos) y NCS debe ser visible ( figura 2A).</li>
		<li>Centrifugar el sobrenadante sobre NCS a 1.250 x g durante 15 min a 20 ° C. El pellet resultante incluye células de sangre rojas en la capa inferior seguida por una capa blanca que contiene las células del trofoblasto ( figura 2B).</li>
		<li>Repita 2.3.2 - 2.3.5 para cada uno de las segunda y terceros las digestiones (adición de 110 mL y 83,5 m, respectivamente, de solución de digestión a la botella de tejido, tabla 2).</li>
		<li>Todos los sobrenadantes han sido centrifugados, resuspender cada precipitado en 5 mL de medio completo caliente y luego las suspensiones de la piscina juntos.</li>
		<li>Partido de la suspensión de células entre dos tubos cónicos de 50 mL y centrifugar a 1.250 x g durante 15 min a 20 ° C.</li>
		<li>Suavemente Quite el sobrenadante y resuspender cada uno de los pellets de células en 6 mL de caliente compllos medios de comunicación ETE.</li>
	</ol></li> <li>Densidad centrifugación <ol><li>dividir la suspensión de células equitativamente entre cuatro gradientes de densidad (3 mL) por lenta y cuidadosamente acodar la suspensión de células en la parte superior de los gradientes de densidad con una pipeta de transferencia.</li>
		<li>Centrifugar los gradientes de densidad 1.250 x g por 20 min a 20 ° C con mínima aceleración y desaceleración. Esto debe producir bandas distinguibles de las células sedimentadas (tabla 4).</li>
		<li>Lentamente y con cuidado quitar las capas superiores de densidad gradiente los medios de comunicación (DGM) hasta las bandas opacas que contiene células de trofoblasto (entre 35-50% DGM) (tabla 4).</li>
		<li>Transferencia de las bandas de trofoblasto en dos tubos cónicos de 50 mL y llenar con medios completo calientes.</li>
		<li>Invertir suavemente los tubos 3 - 6 veces para mezclar y centrifugar a 1.250 x g durante 15 min a 20 ° C.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y resuspender cada precipitado de células en 5 mL de medio completo caliente. Combinar las suspensiones celulares y contar las células viables usando un hemocitómetro y Trypan azul (o célula recomendado: método de conteo).</li>
	</ol></li> <li>Contar las células con un hemocitómetro <ol><li>mezcle la suspensión de células mediante pipeteo arriba y abajo con una pipeta serológica o suavemente invirtiendo el tubo varias veces.</li>
		<li>Combinar partes iguales de la suspensión celular y Trypan blue (es decir, 20 μl cada una) en un tubo separado y mezclar suavemente.</li>
		<li>Incubar durante 1-2 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Suavemente dispensar 15-20 μl de la célula-Trypan azul mezcla entre el cubreobjetos y el hemocitómetro y permitir que las células se difunden a través de la red por la acción capilar.</li>
		<li>Contar células viables (las células muertas se teñido azul profundo) en cada uno de los cuadrantes de cuatro 4 x 4 con un contador de cuenta. Emplear un sistema de conteo asegurar que las células no se cuentan más de una vez (es decir, no cuentan las células que tocan la parte inferior o izquierdas límites). 
		Nota: Cada cuadrante de 4 x 4 debe contener entre 50-150 células. Demasiados o demasiados pocos células pueden llevar a una sobre o subestimación del número de celular.</li>
		<li>Media del recuento total de cada uno de los cuadrantes de 4 x 4, multiplicar por 10 4 y luego multiplicar por el factor de dilución (suspensión de células a azul de tripán) para calcular el número de células por mL.</li>
		<li>Multiplicar el número de células por mL por el volumen total de la suspensión celular para calcular el rendimiento total celular. 
		Nota: Se esperan aproximadamente 100 millones células de aislamientos a partir de 80-120 g de tejido velloso.</li>
	</ol></li> <li>Las células de la galjanoplastia <ol><li>placa 3 millones células/pozo (3.3 x 10 5 células por cm 2) en una placa de 6 pozos (2 mL de la suspensión por pozo) y suavemente balancee hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para distribuir las células. 
		Nota: Trofoblastos requieren placas de cultivo de tejidos tratado para adherirse correctamente. Una monocapa de células es necesaria para promover la syncytialization.</li>
		<li>Deja las células plateadas en la campana de flujo laminar durante aproximadamente 30 minutos permitir que las células para distribuir uniformemente, colocar y comienzan a adherirse a la parte inferior de los pocillos antes de colocarlos en la incubadora.</li>
		<li>Células en cultivo hasta 72 h (con cambios diarios de media) en una incubadora de 37 ° C con 5% CO 2 y 95% de humedad. 
		Nota: Examine los trofoblastos bajo un microscopio en 10-20 x cada 24 h de cultivo. Trofoblastos no proliferan y no pasados. En el transcurso de 72 h de la cultura, los trophoblasts individuales redondeos fusionan para formar un sincitio ( Figura 3A y B).</li>
	</ol></li> <li>Células de congelación <ol><li>Pellet sin usar las células por centrifugación a 1.250 x g durante 10 min a 20 ° C.</li>
		<li>Aspirar tanto los medios como sea posible de la pelotilla de.</li>
		<li>Resuspender el precipitado en congelación media (cuadro 3).</li>
		<li>Congelar alícuotas a-80 ° C en un recipiente congelación llenado de isopropanol al 100%. Transferencia las alícuotas congeladas a líquido N 2 al día siguiente para almacenamiento a largo plazo. 
		Nota: Las células pueden cultivarse después de congelar.</li>
	</ol></li> <li>Descongelar células <ol><li>sacar una alícuota de células congeladas y descongelar en baño de agua de 37 ° C mientras se arremolinan. Eliminar la alícuota del baño justo antes de que completamente descongelado a un líquido.</li>
		<li>Transferir inmediatamente las células descongeladas a un tubo cónico de 15 ml. Principio de frenar al principio, agregar 10 mL de medio completo con mezcla intermitente.</li>
		<li>Invertir el tubo varias veces para mezclar.</li>
		<li>Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 20 ° C.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 2-5 mL de medios completo calientes.</li>
		<li>Contar las células y la placa como se ha descrito.</li>
	</ol></li></ol> 3. Tratamiento de Trophoblasts primaria con TNFα, colección de Lysates de la célula y Western Blotting <ol><li>preparación de <ol><li>caliente media completa a 37 ° C.</li>
		<li>Hacer un stock de 10 μg/mL de TNFα en los medios de comunicación completa y conservar a-20 ° C hasta que esté listo para uso.</li>
		<li>Hacer un 1 μg/mL bolsa de trabajo de TNFα en medios completo cuando esté listo para el tratamiento de las células. Serie diluir la acción TNFα trabajo 4 10 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL y 125 pg/mL en medios completo. 
		Nota: La concentración de TNFα de 10 4 pg/mL es moderadamente citotóxica. Ajuste de las concentraciones de TNFα prueba dependerá de las características específicas de las aplicaciones de bajada deseadas.</li>
	</ol></li> <li>Tratamiento de células con TNFα <ol><li>después de 24 h de cultivo, aspirar el medio de cultivo de las células y reemplazar con 2 mL de TNFα suplido medios por pozo en placas de 6 pocillos (por lo menos dos pozos por tratamiento y vehículo control).</li>
		<li>Después de 24 h de exposición de TNFα (48 h de la cultura), sustituir los medios de comunicación TNFα complementado con medios completo.</li>
	</ol></li> <li>Cosecha de células y proteínas totales <ol><li>después de 72 h de cultivo (24 h pasado retiro de TNFα), aspirar los medios de comunicación, enjuague suavemente las células con PBS temperatura y añadir 80 μl de frío hielo ensayo de radioinmunoprecipitación Tampón (RIPA) que contiene recién añadido inhibidores de la proteasa y fosfatasa (tabla 3) directamente a cada pocillo.</li>
		<li>Extraer las células de la placa con un raspador celular. Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, agrupación de pozos dentro de los grupos de tratamiento.</li>
		<li>Lyse las células con un vórtex los tubos en alta durante al menos tres intervalos de 15 s.</li>
		<li>Incubar a las células a 4 ° C con oscilación durante 15 minutos 
		Nota: como alternativa, después paso 3.3.3., las células pueden ser incubadas en hielo durante 15 min con agitación intermitente por sacudiendo el tubo Vortex, o pipeteando arriba yWN.</li>
		<li>Repetir paso 3.3.3.</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C para que sedimenten la ruina celular.</li>
		<li>Traslado el sobrenadante (que contiene proteína celular) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y conservar a -80 ° C. 
		Nota: El protocolo puede ser detenido aquí y reanudó más tarde. Es recomendable hacer varias alícuotas de las muestras de proteína celular para evitar múltiples ciclos de hielo-deshielo.</li>
		<li>Determinar la concentración de proteínas totales por el método preferido, como un ensayo de ácido bicinchoninic (BCA, ver tabla de suministros esenciales, reactivos y equipo, material complementario).</li>
	</ol></li> <li>SDS-PAGE y Western blot para el Rubicon o proteínas de interés Nota: seguir Western Blot protocolos según fabricante &#39; instrucciones mediante un sistema de laboratorio preferido.
	Gel <ol><li>carga entre 20-40 μg de proteína total en el tampón de muestra (tabla 3) por pozo en una 12% de acrilamida. Separar proteínas por SDS-PAGE en la gestión de memoria intermedia (cuadro 3).</li>
		<li>Mojado-transferencia de las proteínas desde el gel a una membrana de polivinilideno difluoruro (PVDF) según el fabricante &#39; instrucciones en tampón de transferencia (tabla 3).</li>
		<li>Incubar la membrana en leche en polvo 5% en solución salina Tris-Buffered con 0,1% Tween 20 (TBST, tabla 3) durante al menos 1 h a temperatura ambiente con mecedora.</li>
		<li>Incubar la membrana de un anticuerpo primario de Rubicon (ver tabla de suministros esenciales, reactivos y equipo, material complementario) a 1: 500 en 1% leche en polvo en TBST durante la noche a 4 ° C con oscilación.</li>
		<li>Lave suavemente la membrana 3 veces, 5 minutos en TBST y 1 veces, 5 minutos en TBS a temperatura ambiente con mecedora.</li>
		<li>Incubar la membrana de 1: 2000 - 1: 5000 de anticuerpo secundario (conjugado visible ligados por la HRP o preferida, ver la tabla de los suministros esenciales, reactivos y equipo, material complementario) en 5% leche en polvo en TBST durante al menos 1 h a temperatura ambiente con mecedora.</li>
		<li>Repetir el procedimiento de lavado descrito en paso 3.4.5 y visualizar la mancha con un visualización apropiada (es decir, quimioluminiscencia) de sustrato en un sistema de proyección de imagen.</li>
		<li>Repetir el procedimiento de lavado descrito en paso 3.4.5 y probe la membrana para β-actina o un control de carga recomendado: según fabricante &#39; instrucciones s.</li>
		<li>En software de análisis de imagen preferida, analizar la expresión de Rubicon por cuantificación manual de absorbancia (intensidad de la banda), sustracción de absorbancia de fondo y la normalización de la carga correspondiente control de intensidad de la banda. Realizar análisis estadísticos como adecuados detectar cambios estadísticamente significativos en niveles de proteína.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La placenta, responsable de regular el crecimiento del feto, exhibe función comprometida en el ambiente obesidad6. A pesar de las altas demandas metabólicas de trofoblastos, placentas con obesidad materna presentan respiración mitocondrial disfuncional6,19. Cambios en el metabolismo placentario pueden contribuir a la mayor incidencia de complicaciones y los resultados fetales adversos observados en embarazos obesos3...

La obesidad es un estado inflamatorio caracterizado por inflamación crónica de bajo grada, derivadas del exceso de tejido adiposo y la disponibilidad de nutrientes. En obesidad, citocinas proinflamatorias son elevados en los tejidos metabólicos así como sistémicamente en circulación. Un sólido cuerpo de evidencia ha demostrado que TNFα se eleva significativamente en el ámbito de la obesidad con implicaciones en la resistencia a la insulina y la disfunción metabólica1. Activación de TNFα también contribuye a la patogénesis de la enfermedad en condiciones como el cáncer y autoinmunidad, lo que es una diana terapéutica atractiva2.
Inflamación en la obesidad se ve agravada por el embarazo, también una proinflamatorias del estado3,4. Se ha demostrado previamente que contenido TNFα placentaria aumenta con la adiposidad materna en embarazos con fetos femeninos. Además, el tratamiento TNFα inhibe la respiración mitocondrial en células de trofoblasto femeninas pero no masculinas, lo que sugiere que TNFα está implicado en la regulación del metabolismo placentario en un dimorfismo sexual de la forma5. Obesidad materna está asociada con el aumento de la incidencia de una variedad de complicaciones durante el embarazo, incluyendo a parto muerto, con fetos masculinos, siendo los más susceptibles de3,6,7,8 . Debido a su papel clave en la interfase materno fetal, cambios en la capacidad funcional de la placenta en el ambiente intrauterino obesidad en respuesta a señales inflamatorias pueden desempeñar un papel importante en la mediación de los resultados de embarazos de obesos.
Citotrofoblastos y sincitiotrofoblastos en el tejido velloso de la placenta son críticos para la señalización endocrina y el intercambio de nutrientes y oxígeno entre la madre y el feto en desarrollo9. Alteraciones en la capacidad funcional de citotrofoblastos velloso (en lo sucesivo, trofoblastos) pueden comprometer la salud fetal y el desarrollo. Este protocolo describe un método para el muestreo de tejido velloso de la placenta de término humano por disección a las placas coriónicas y basals junto con un procedimiento optimizado para el aislamiento de trofoblastos para el cultivo celular primario. Este protocolo se deriva de metodologías establecidas que implica la digestión enzimática del tejido velloso para liberar las células de la matriz extracelular, seguido por centrifugación diferencial de densidad para aislar trofoblastos10, 11,12. Este detalles de protocolo un enfoque en que primaria trofoblastos de placentas de embarazos magros son tratados con medios de cultivo suplementados con TNFα para simular uno de los componentes del ambiente inflamatorio asociado con la obesidad materna. Por último, se describe un procedimiento simple para la recolección de lysates de la célula total de trofoblastos tratados con TNFα seguidas de Western blot para detectar cambios en la expresión génica.
Mientras que este modelo no recapitular el entorno obesogénico en el útero en su totalidad, ofrece un sistema controlado que permite analizar la contribución individual de la inflamación mediada por el TNFα ante los trofoblastos obesidad materna. Este modelo brinda la oportunidad de ambos para descubrir o confirmar dianas moleculares directamente reguladas por señalización de TNFα en trofoblastos como permite para probar si observaron cambios en los patrones de expresión génica en vivo en placentas con maternal la obesidad puede ser el resultado de la inflamación mediada por el TNFα.
El enfoque se describe aquí se implementó para probar el efecto de la inflamación mediada por el TNFα en la regulación de la autofagia en trofoblastos humanos. Trofoblastos de obesos embarazos con fetos masculinos exposición interrumpen facturación autophagic o autophagosome maduración13. Una proteína llamada Rubicón (RUN dominio proteína interacción Beclin1 y ricos en cisteína que contiene), que se localiza en los lisosomas y endosomas finales, se ha descrito recientemente como un "freno" en el proceso de autofagia facturación porque funciona como una negativa regulador de autophagosome maduración14,15. De hecho, el Rubicon es un raro ejemplo de una proteína que frena la autofagia, lo que lo convierte en un valioso objetivo terapéutico. Muy poca información está disponible sobre el significado fisiopatológico de Rubicon, excepto por sus papeles en la respuesta inmune innata a microbials16,17 y cardiomiocitos protección18. Utilizando el protocolo descrito aquí, se encuentra que el Rubicon es upregulated en trofoblastos femenino primarios en la respuesta al tratamiento con el aumento de las concentraciones de TNFα hasta 250 pg/mL. La regulación de Rubicon puede desempeñar un papel en cómo hembra fetos precio mejor que los machos en embarazos con obesidad materna. Recapitulando la inflamación asociada con la obesidad materna ex vivo exponiendo trofoblastos humanos a TNFα exógena proporciona una plataforma para estudiar el impacto del obesidad ambiente intrauterino en la regulación de las vías críticas en trofoblastos y por extensión, función placentaria.

<table><tbody><tr><td>10X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (anhyd.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (anhyd.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS002139</tr><tr><td>Inhibidores de la proteasa/fosfatasa</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>88668</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-600</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio.</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6228822</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco modificado' s Medio (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero neonatal para terneros (NCS)</td><td>Gibco</td><td>26010-074</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (pluma/estreptococo)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-427-098</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TNF y alfa;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3177-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td></td></tr><tr><td>K2EDTA tubos de extracción de sangre vacutainer</td><td>BD</td><td>366450</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (Medios de gradiente de densidad, DGM)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Filtros celulares</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos Safe-Lock 2.0 mL, natural</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658033</td><td></td></tr><tr><td>TGX FastCast Acrylamidde Kit, 12% </td><td>Bio-Rad</td><td>1610175</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean 3 Cámara de fundición múltiple</td><td>Bio-Rad</td><td>1654112</td><td></td></tr><tr><td>4X Laemmli tampón de muestra</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada instantánea</td><td>Clavel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubicon (D9F7) Ab de conejo</td><td>Tecnología de señalización de células</td><td>8465S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&beta;-actina monoclonal producido en ratón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228-100UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-conejo IgG, anticuerpo ligado a HRP Tecnología de</td><td>señalización celular</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón IgG, anticuerpo</td> <td>ligado a HRPTecnología de señalización celular</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS sustrato quimioluminiscente</td><td>Thermo Scientific</td><td>34578</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de trofoblasto humano primario para estudiar el efecto de la inflamación asociado con obesidad materna sobre la regulación de la autofagia en la placenta

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Obesidad materna está asociada con un mayor riesgo de resultados perinatales adversos que son probablemente mediados por la comprometida función placentaria que puede atribuirse, en parte, la desregulación de la autofagia. Cambios aberrantes en la expresión de los reguladores de la autofagia en las placentas de embarazos obesos pueden ser regulados por procesos inflamatorios asociados con la obesidad y embarazo. Se describe aquí es un protocolo para toma de muestras de tejido velloso y aislamiento de citotrofoblastos velloso de la placenta humana de término para el cultivo celular primario. Esto es seguido por un método para simular el ambiente inflamatorio en el ambiente intrauterino obesidad por el tratamiento primarios trofoblastos de embarazos magros con el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), una citoquina proinflamatoria que está elevada en la obesidad y en embarazo. A través de la implementación del protocolo descrito aquí, se encuentra que la exposición a exógena TNFα regula la expresión de Rubicon, un regulador negativo de la autofagia en trofoblastos de la magros embarazos con fetos femeninos. Mientras que una variedad de factores biológicos en el ambiente intrauterino obeso mantienen el potencial de modular las vías críticas en trofoblastos, este sistema ex vivo es especialmente útil para determinar si los patrones de expresión observados en vivo en placentas humanas con obesidad materna son un resultado directo de la señalización de TNFα. En última instancia, este enfoque brinda la oportunidad de analizar las implicaciones reglamentarias y moleculares de inflamación asociados con la obesidad materna en autofagia y otras vías celulares críticos en trofoblastos que tienen el potencial de impacto función placentaria.

Término de placentas humanas de lean (índice de masa corporal antes del embarazo (IMC) &lt; 25) las madres con embarazos sin complicaciones con descendencia femenina fueron recogidas y muestreadas a 15 minutos del parto por cesárea (no laboral). Las placentas se examinaron de la ausencia de calcificaciones y desarrollo típico: pesa entre 300-600 g con el cordón umbilical y membranas quitadas, redondo en la forma, entre 15-25 cm de diámetro y el cordón umbilical insertado en el centro de l...

Presentamos es un protocolo para el muestreo de tejido velloso placentario humano seguido por el aislamiento de citotrofoblastos para el cultivo celular primario. Tratamiento de trofoblastos con TNFα recapitula la inflamación en el ambiente intrauterino obeso y facilita el descubrimiento de dianas moleculares regulados por inflamación en placentas con obesidad materna.

Un modelo de trofoblasto humano primario para estudiar el efecto de la inflamación asociado con obesidad materna sobre la regulación de la autofagia en la Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

El objetivo general de este modelo de cultivo de células trofoblásticas es medir el efecto de la inflamación relacionada con la obesidad en la regulación de vías críticas en trofoblastos. La principal ventaja de este sistema de control es que establece una relación entre la inflamación mediada por TNF alfa y la regulación génica en la placenta en el contexto de la obesidad materna. La principal ventaja de este sistema experimental es que establece relaciones entre la inflamación mediada por TNF-alfa y la regulación génica en la placenta en el contexto de la obesidad materna.Bailey Simon y Matt Bucher, técnicos de mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento. El tejido velloso debe extraerse de la placenta tan pronto como sea posible después del parto, preferiblemente en 30 minutos o menos. Con la placa coriónica hacia arriba, use fórceps y tijeras para extirpar, al azar, dos o tres secciones de espesor completo, de dos a tres centímetros de la periferia de la placenta.Evite las partes de la placenta que parezcan anormales. Recorte las placas coriónicas y basales y los vasos sanguíneos grandes. Coloque el tejido velloso resultante en un medio tibio y completo.Dentro de los 30 minutos posteriores a la toma de muestras de tejido velloso, comience el aislamiento del trofoblasto. Coloque cada pieza de tejido velloso en un tubo cónico de 50 mililitros lleno de PBS a temperatura ambiente y agite suavemente para liberar el exceso de sangre en el tejido. Decantar el PBS y reemplazarlo con PBS nuevo.Repita el enjuague de PBS hasta que se elimine la mayor parte del exceso de sangre. El enjuague de PBS será de color rojo claro o rosado cuando el pañuelo esté completamente enjuagado. Coloque el tejido velloso en una placa de Petri estéril y extraiga tantos vasos sanguíneos como sea posible mediante el uso de un portaobjetos de microscopio para raspar suavemente el tejido velloso blando de los vasos.Con unas tijeras, pica finamente el tejido velloso resultante. Transfiera el tejido velloso picado a un frasco estéril con solución de digestión de acuerdo con los volúmenes calculados en función de la actividad específica de la tripsina y la DNasa. Incubar la botella de digestión en un baño de agua a 37 grados centígrados agitando a 70 rpm durante 35 minutos.Después de 35 minutos, incline la botella de digestión de lado y permita que los trozos de tejido no digeridos se asienten en el fondo de la botella. Extraer cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta serológica, evitando el tejido sedimentado. Dispense el sobrenadante a través de un colador de células de 100 micras a partes iguales entre tubos cónicos de 50 mililitros.Comience la segunda digestión agregando la solución de digestión al tejido sedimentado restante e incubando la botella en el baño de agua a 37 grados centígrados. Aplique suavemente capas de tres a cinco mililitros de suero para terneros recién nacidos, o NCS, debajo del sobrenadante colado de la primera digestión dispensando lentamente desde una pipeta serológica en el fondo del tubo. Debe ser visible un menisco entre el sobrenadante tensado que contiene trofoblastos y el NCS.Centrifugar los sobrenadantes sobre NCS a 1.250 veces g a 20 grados Celsius durante 15 minutos. El gránulo resultante incluirá glóbulos rojos en la capa inferior, seguidos de una capa blanca que contiene células trofoblásticas. De la misma manera, cuela el sobrenadante de la segunda y tercera digestión.Coloque una capa de NCS debajo del sobrenadante colado y centrifugue a 1.250 veces g a 20 grados centígrados durante 15 minutos. Una vez que se hayan centrifugado todos los sobrenadantes y se hayan eliminado las capas de NCS y sobrenadantes, vuelva a suspender cada pellet en cinco mililitros de medio tibio completo y luego agrupe las suspensiones. Divida la suspensión de la celda en partes iguales entre dos tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 1.250 veces g a 20 grados centígrados durante 15 minutos.Retire suavemente el sobrenadante y vuelva a suspender cada uno de los gránulos de celda en seis mililitros de medio tibio y completo. Para comenzar este procedimiento, divida la suspensión celular en partes iguales entre cuatro gradientes de densidad utilizando una pipeta de transferencia para superponer lenta y cuidadosamente la suspensión celular sobre los gradientes de densidad. Centrifugar los gradientes de densidad a 1.250 veces g a 20 grados centígrados durante 20 minutos con una aceleración y desaceleración mínimas.Esto debería producir bandas distinguibles de células sedimentadas. Retire lenta y cuidadosamente la capa superior del medio de gradiente de densidad hasta llegar a la banda opaca que contiene las células trofoblásticas. Transfiera las bandas de trofoblasto a dos tubos cónicos de 50 mililitros y llénelos con medio tibio y completo.Invierta suavemente los tubos de tres a seis veces para mezclar y centrifugar a 1.250 veces g a 20 grados centígrados durante 15 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet de celda en cinco mililitros de medio tibio y completo. Combine las suspensiones celulares y cuente las células viables usando un hemocitómetro y azul de tripán.El siguiente paso después del conteo de células es colocar las placas de las células. Placa de tres millones de células por pocillo en cada placa de seis pocillos. Mueva suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente las células.Deje las celdas plateadas en el respiradero de flujo laminar durante aproximadamente 30 minutos para permitir que las celdas se distribuyan, se asienten y comiencen a adherirse uniformemente al fondo de los pocillos. Después de 30 minutos, coloque las placas en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad. Examinar los trofoblastos bajo un microscopio después de 24 horas de cultivo para confirmar la adhesión y la morfología adecuada del trofoblasto.Las células se pueden tratar después de 24 horas de cultivo. Aspire el medio de cultivo de las células y reemplácelo con dos mililitros de medio suplementado con TNF alfa por pocillo. Regrese las placas a la incubadora a 37 grados centígrados.Después de 24 horas de exposición al TNF alfa, reemplace el medio suplementado con TNF alfa por un medio completo. Incubar durante otras 24 horas. 24 horas después de la extracción del TNF alfa, aspire los medios y enjuague suavemente las células con PBS a temperatura ambiente.Añadir directamente a cada pocillo 80 microlitros de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación helado que contenga inhibidores de la proteasa y la fosfatasa recién añadidos. Retire las células de la placa con un raspador de células. Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, agrupando los pocillos dentro de los grupos de tratamiento.Congele las células mediante el vórtice de los tubos en alto durante al menos tres intervalos de 15 segundos. Incubar las células a cuatro grados centígrados meciéndolas durante 15 minutos. Vórtice los tubos de nuevo en lo alto.Centrifugar a 10.000 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para pellet los restos celulares. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Almacene las muestras de proteínas celulares a 80 grados centígrados hasta el análisis por Western blot para la proteína de interés.Después de 72 horas de cultivo, el análisis inmunocitoquímico de la citoqueratina 7, mostrada en rojo, en trofoblastos primarios confirma que las células sufrieron sincitilización evidenciada por la presencia de masas celulares multinucleadas. Además, el análisis inmunocitoquímico de la vimentina, también en rojo, reveló muy pocos fibroblastos contaminantes. La contratinción nuclear se muestra en azul en ambas imágenes.El tratamiento con TNF alfa hasta 250 picogramos por mililitro reguló al alza la expresión de rubicón. A concentraciones de TNF alfa superiores a 250 picogramos por mililitro, los niveles de expresión de rubicón disminuyeron hacia el valor basal e incluso por debajo. Del mismo modo, el rubicon está significativamente regulado al alza en las biopsias de tejido velloso congelado rápidamente de placentas de embarazos obesos con fetos femeninos en comparación con los controles delgados.Una vez dominado, el aislamiento de los trofoblastos del tejido velloso se puede realizar en seis o siete horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante preparar los materiales y los reactivos con anticipación para que pueda trabajar de manera deliberada y eficiente. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros ensayos, como los que miden la bioenergética celular, para responder preguntas adicionales, como ¿la inflamación en el entorno intrauterino obeso afecta la capacidad metabólica de los trofoblastos?Después de esto, el método de desarrollo allanó el camino para que el investigador de la placenta estableciera el efecto del entorno materno en la función del trofoblasto. Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo aislar trofoblastos de tejido velloso para su experimento de cultivo celular y cómo determinar el efecto de la inflamación mediada por TNF alfa en la regulación de vías críticas en los trofoblastos. No olvide que trabajar con tejido humano, células cultivadas, DMSO, acrilamida y reactivos reductores puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de EPP adecuado y el uso de técnicas asépticas al realizar este procedimiento.

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En este protocolo, se describe la disección de placenta de ratón en el embarazo D10.5, seguido por el aislamiento de las células trofoblásticas utilizando un gradiente de Percoll. A continuación, demostrar el uso de las células aisladas en un ensayo de invasión de Matrigel.

El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

Este manuscrito presenta un modelo in vitro único de células de citotrofoblasto velloso humano inmunopurificadas cultivadas bajo hipoxia/reoxigenación. Este modelo es adecuado para estudiar los efectos protectores de tratamientos prometedores, como la melatonina, sobre las complicaciones del embarazo asociadas con el aumento del estrés oxidativo y la alteración de la función placentaria.

Trofoblasto humana primaria cultivo celular modelo para estudiar los efectos protectores de la melatonina contra la hipoxia / reoxigenación interrupción inducida

Se describe un método simple para establecer la placenta humana primaria (vellosidades) y cultivos de órganos de la decidua. cultivos de órganos de las vellosidades y decidua son herramientas muy valiosas para el estudio de la patogénesis en la interfase materno-fetal humano. La infección con la bacteria intracelular Listeria monocytogenes facultativos se demuestra.

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

Este protocolo permite un investigador aislar y caracterizar tejido residente macrófagos en varios sello inflamado los tejidos extraídos de modelos inducida por la dieta de los trastornos metabólicos.

Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

Aquí, presentamos un protocolo altamente accesible para evaluar el movimiento de la célula en células de trofoblasto humano mediante tres ensayos in vitro: el ensayo de rayado, el ensayo de invasión transwell y el ensayo de proliferación celular.

En los ensayos de Vitro para evaluar la migración, invasión y proliferación de las líneas de células inmortalizadas trofoblasto humano de primer trimestre

Desarrollamos un modelo de coleamnionitis para simular la exposición fetal a la inflamación materna (FEMI) sin complicaciones de organismos vivos para examinar los efectos del FEMI en el desarrollo del tracto intestinal de la descendencia. Esto permite el estudio de causas mecanicistas para el desarrollo de lesiones intestinales después de la coleamnionitis.

Un modelo murino de exposición fetal a la inflamación materna para estudiar los efectos de la coleamnionitis aguda en el desarrollo intestinal neonatal

Aquí se presenta un protocolo para administrar oligonucleótidos como ARN de interferencia pequeña (siRNA), imitadores de microARN (miR) o anti-micro-ARN (anti-miR) en adipocitos maduros para modular la expresión de proteínas y microARN.

Un modelo de cultivo celular de adipocitos para estudiar el impacto de la modulación de proteínas y microARN en la función de los adipocitos

A continuación se presenta un protocolo para el cultivo de explantes placentarios en condiciones de flujo constante. Este enfoque mejora los sistemas tradicionales de cultivo estático de vellosidades al permitir la replicación de entornos fisiológicos dinámicos.

Ex Vivo Cultivo de flujo de explante placentario: imitación de las condiciones dinámicas en el útero

Este protocolo permite la purificación, caracterización y cultivo de trofoblastos extravillosos primarios de HLA-G+ (EVT) de la decidua basal y la membrana coriónica de placentas humanas a término. Los cultivos primarios de EVT mantienen la viabilidad durante 96 horas, permitiendo el cocultivo con células inmunitarias maternas emparejadas por muestras y el posterior análisis citométrico y molecular de flujo de sus interacciones.

Purificación de trofoblastos extravillosos HLA-G+ de tejidos placentarios humanos para fenotipado y análisis funcional

Utilizando un modelo explantado ex vivo , se cultivan pequeños fragmentos de la porción rostral del tejido adiposo visceral blanco de ratones magros durante 7–10 días, lo que permite inducir y estudiar la inflamación del tejido adiposo a medida que ocurre durante la alimentación rica en grasas.

Un modelo ratón ex vivo para inflamación del tejido adiposo con una dieta alta en grasas

Aprende a aislar citotrofoblastos primarios de tejido placentario humano para estudiar la regulación génica mediada por TNFα en el contexto de obesidad materna. Este modelo permite identificar dianas moleculares en disfunción placentaria.

Un modelo de trofoblasto humano primario para estudiar el efecto de la inflamación asociado con obesidad materna sobre la regulación de la autofagia en la Placenta (Video) | JoVE Journal

Un modelo de trofoblasto humano primario para estudiar el efecto de la inflamación asociado con obesidad materna sobre la regulación de la autofagia en la Placenta

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