Un modelo de trofoblasto humano primario para estudiar el efecto de la inflamación asociado con obesidad materna sobre la regulación de la autofagia en la Placenta

El objetivo general de este modelo de cultivo de células trofoblásticas es medir el efecto de la inflamación relacionada con la obesidad en la regulación de vías críticas en trofoblastos. La principal ventaja de este sistema de control es que establece una relación entre la inflamación mediada por TNF alfa y la regulación génica en la placenta en el contexto de la obesidad materna. La principal ventaja de este sistema experimental es que establece relaciones entre la inflamación mediada por TNF-alfa y la regulación génica en la placenta en el contexto de la obesidad materna.

Bailey Simon y Matt Bucher, técnicos de mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento. El tejido velloso debe extraerse de la placenta tan pronto como sea posible después del parto, preferiblemente en 30 minutos o menos. Con la placa coriónica hacia arriba, use fórceps y tijeras para extirpar, al azar, dos o tres secciones de espesor completo, de dos a tres centímetros de la periferia de la placenta.

Evite las partes de la placenta que parezcan anormales. Recorte las placas coriónicas y basales y los vasos sanguíneos grandes. Coloque el tejido velloso resultante en un medio tibio y completo.

Dentro de los 30 minutos posteriores a la toma de muestras de tejido velloso, comience el aislamiento del trofoblasto. Coloque cada pieza de tejido velloso en un tubo cónico de 50 mililitros lleno de PBS a temperatura ambiente y agite suavemente para liberar el exceso de sangre en el tejido. Decantar el PBS y reemplazarlo con PBS nuevo.

Repita el enjuague de PBS hasta que se elimine la mayor parte del exceso de sangre. El enjuague de PBS será de color rojo claro o rosado cuando el pañuelo esté completamente enjuagado. Coloque el tejido velloso en una placa de Petri estéril y extraiga tantos vasos sanguíneos como sea posible mediante el uso de un portaobjetos de microscopio para raspar suavemente el tejido velloso blando de los vasos.

Con unas tijeras, pica finamente el tejido velloso resultante. Transfiera el tejido velloso picado a un frasco estéril con solución de digestión de acuerdo con los volúmenes calculados en función de la actividad específica de la tripsina y la DNasa. Incubar la botella de digestión en un baño de agua a 37 grados centígrados agitando a 70 rpm durante 35 minutos.

Después de 35 minutos, incline la botella de digestión de lado y permita que los trozos de tejido no digeridos se asienten en el fondo de la botella. Extraer cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta serológica, evitando el tejido sedimentado. Dispense el sobrenadante a través de un colador de células de 100 micras a partes iguales entre tubos cónicos de 50 mililitros.

Comience la segunda digestión agregando la solución de digestión al tejido sedimentado restante e incubando la botella en el baño de agua a 37 grados centígrados. Aplique suavemente capas de tres a cinco mililitros de suero para terneros recién nacidos, o NCS, debajo del sobrenadante colado de la primera digestión dispensando lentamente desde una pipeta serológica en el fondo del tubo. Debe ser visible un menisco entre el sobrenadante tensado que contiene trofoblastos y el NCS.

Centrifugar los sobrenadantes sobre NCS a 1.250 veces g a 20 grados Celsius durante 15 minutos. El gránulo resultante incluirá glóbulos rojos en la capa inferior, seguidos de una capa blanca que contiene células trofoblásticas. De la misma manera, cuela el sobrenadante de la segunda y tercera digestión.

Coloque una capa de NCS debajo del sobrenadante colado y centrifugue a 1.250 veces g a 20 grados centígrados durante 15 minutos. Una vez que se hayan centrifugado todos los sobrenadantes y se hayan eliminado las capas de NCS y sobrenadantes, vuelva a suspender cada pellet en cinco mililitros de medio tibio completo y luego agrupe las suspensiones. Divida la suspensión de la celda en partes iguales entre dos tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 1.250 veces g a 20 grados centígrados durante 15 minutos.

Retire suavemente el sobrenadante y vuelva a suspender cada uno de los gránulos de celda en seis mililitros de medio tibio y completo. Para comenzar este procedimiento, divida la suspensión celular en partes iguales entre cuatro gradientes de densidad utilizando una pipeta de transferencia para superponer lenta y cuidadosamente la suspensión celular sobre los gradientes de densidad. Centrifugar los gradientes de densidad a 1.250 veces g a 20 grados centígrados durante 20 minutos con una aceleración y desaceleración mínimas.

Esto debería producir bandas distinguibles de células sedimentadas. Retire lenta y cuidadosamente la capa superior del medio de gradiente de densidad hasta llegar a la banda opaca que contiene las células trofoblásticas. Transfiera las bandas de trofoblasto a dos tubos cónicos de 50 mililitros y llénelos con medio tibio y completo.

Invierta suavemente los tubos de tres a seis veces para mezclar y centrifugar a 1.250 veces g a 20 grados centígrados durante 15 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet de celda en cinco mililitros de medio tibio y completo. Combine las suspensiones celulares y cuente las células viables usando un hemocitómetro y azul de tripán.

El siguiente paso después del conteo de células es colocar las placas de las células. Placa de tres millones de células por pocillo en cada placa de seis pocillos. Mueva suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente las células.

Deje las celdas plateadas en el respiradero de flujo laminar durante aproximadamente 30 minutos para permitir que las celdas se distribuyan, se asienten y comiencen a adherirse uniformemente al fondo de los pocillos. Después de 30 minutos, coloque las placas en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad. Examinar los trofoblastos bajo un microscopio después de 24 horas de cultivo para confirmar la adhesión y la morfología adecuada del trofoblasto.

Las células se pueden tratar después de 24 horas de cultivo. Aspire el medio de cultivo de las células y reemplácelo con dos mililitros de medio suplementado con TNF alfa por pocillo. Regrese las placas a la incubadora a 37 grados centígrados.

Después de 24 horas de exposición al TNF alfa, reemplace el medio suplementado con TNF alfa por un medio completo. Incubar durante otras 24 horas. 24 horas después de la extracción del TNF alfa, aspire los medios y enjuague suavemente las células con PBS a temperatura ambiente.

Añadir directamente a cada pocillo 80 microlitros de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación helado que contenga inhibidores de la proteasa y la fosfatasa recién añadidos. Retire las células de la placa con un raspador de células. Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, agrupando los pocillos dentro de los grupos de tratamiento.

Congele las células mediante el vórtice de los tubos en alto durante al menos tres intervalos de 15 segundos. Incubar las células a cuatro grados centígrados meciéndolas durante 15 minutos. Vórtice los tubos de nuevo en lo alto.

Centrifugar a 10.000 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para pellet los restos celulares. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Almacene las muestras de proteínas celulares a 80 grados centígrados hasta el análisis por Western blot para la proteína de interés.

Después de 72 horas de cultivo, el análisis inmunocitoquímico de la citoqueratina 7, mostrada en rojo, en trofoblastos primarios confirma que las células sufrieron sincitilización evidenciada por la presencia de masas celulares multinucleadas. Además, el análisis inmunocitoquímico de la vimentina, también en rojo, reveló muy pocos fibroblastos contaminantes. La contratinción nuclear se muestra en azul en ambas imágenes.

El tratamiento con TNF alfa hasta 250 picogramos por mililitro reguló al alza la expresión de rubicón. A concentraciones de TNF alfa superiores a 250 picogramos por mililitro, los niveles de expresión de rubicón disminuyeron hacia el valor basal e incluso por debajo. Del mismo modo, el rubicon está significativamente regulado al alza en las biopsias de tejido velloso congelado rápidamente de placentas de embarazos obesos con fetos femeninos en comparación con los controles delgados.

Una vez dominado, el aislamiento de los trofoblastos del tejido velloso se puede realizar en seis o siete horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante preparar los materiales y los reactivos con anticipación para que pueda trabajar de manera deliberada y eficiente. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros ensayos, como los que miden la bioenergética celular, para responder preguntas adicionales, como ¿la inflamación en el entorno intrauterino obeso afecta la capacidad metabólica de los trofoblastos?

Después de esto, el método de desarrollo allanó el camino para que el investigador de la placenta estableciera el efecto del entorno materno en la función del trofoblasto. Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo aislar trofoblastos de tejido velloso para su experimento de cultivo celular y cómo determinar el efecto de la inflamación mediada por TNF alfa en la regulación de vías críticas en los trofoblastos. No olvide que trabajar con tejido humano, células cultivadas, DMSO, acrilamida y reactivos reductores puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de EPP adecuado y el uso de técnicas asépticas al realizar este procedimiento.