Name: Establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el Virus Zika utilizando estrategias de inyección Intracerebral: embrionario, Neonatal y adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a establecer modelos de ratón para infección cerebral por Virus Zika mediante inyección intracerebral en etapas embrionaria, neonatal y adulta. Este método permite estudiar la patogénesis viral y microcefalia inducida.

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Los autores desean reconocer el Dr. Abdellatif Benraiss de la Universidad de Rochester por su tutoría y discusiones relevantes para aprender las técnicas de recién nacido y adulto quirúrgico. Los autores también agradece a Dr. James Lauderdale en UGA para el uso de su equipo estereotáxicas y discusiones relacionadas con ajuste de la metodología de esta técnica y la promoción para la Fundación de investigación Colegio científicos (arcos) para su apoyo y nuestro apoyo de NIH (NINDS becas R01NS096176-02 R01NS097231-01 y F99NS105187-01).

Todo animal use protocolos seguir las pautas de cuidado de los animales de la Universidad de California del sur y la Universidad de Georgia. Métodos de eutanasia para presas embarazadas y los adultos se realizan según protocolos aprobados: asfixia dióxido de carbono, seguido por dislocación cervical como método secundario para eutanasia. Cachorros neonatales son sacrificados por decapitación.
PRECAUCIÓN: El siguiente protocolo incluye un virus patógeno. Debe tenerse precaución adecuada durante la manipulación de los virus. Todos los protocolos deben ser aprobados por la previa Comisión institucional para utilizar.
1. embrionaria inoculación Intracerebral del Virus Zika
<ol><li>Para apareamiento tiempo embarazada, considere mediodía del día después de aparearse como E0.5. Par de ratones al final del día y comprobar enchufes temprano en la mañana para reducir la variabilidad del tiempo de acoplamiento.</li>
	<li>Preparar la aguja de vidrio antes de la cirugía. Tire de la aguja cortada en 1/3 de su longitud y afila a un ángulo de 45° usando una amoladora de la micropipeta con un goteo de agua hasta que el poro tiene un tamaño de 50-70 μm. verificación extremidades de la aguja bajo un estereoscopio para calidad y rotura.</li>
	<li>Mantener el virus de la alícuota en el hielo. Justo antes de la cirugía, cargar la mezcla de inyección ZIKV en la aguja de inyección de vidrio preparada. Montar la jeringa de inyección gas-tight (volumen de 50 μL), conexión luer-lock y tubo y saturar la jeringa montada con el tubo con aceite mineral. Una vez saturado, conecte la aguja y dibujar ~ 6-7 μl ZIKV en la aguja (~ 1 μl es 1,7 × 106 DICT50/mL).</li>
	<li>Inyectar el C57BL/6J embarazada o ratones 129S1/SvImJ con embrionario día E14.5 embriones (para inyección intracraneal) o embriones E10.5 (por inyección intrauterina) con clorhidrato de ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (5-10 mg/kg) diluidos en solución salina estéril por vía intraperitoneal para inducir la anestesia en la madre. También puede anestesiar a las madres con isoflurano isoflurano vigilada proporcionada por inhalación, con barrido de gases residuales, si procede. Inyectar la buprenorfina-SR (0.5-1.0mg/kg) por vía subcutánea para inducir analgesia.</li>
	<li>Pinch test anestesiado las madres en la punta del dedo del pie o la cola y luego los ponen decúbito supino en una almohadilla de calefacción aprobado por animal (almohadilla térmica de 2, 5 100 x 200 mm). El fórceps del pellizco del dedo del pie no son estéril y no están acostumbrado a manejar tejidos en cirugía. Alternativamente, pueden utilizarse las manos enguantadas para poner a prueba el reflejo de retirada de pellizco del dedo del pie. Nota: Consulte a su personal veterinario institucional para el perioperatorio recomendado: método de calefacción. Una cubierta se colocó entre el animal y esta almohada.</li>
	<li>Añadir pomada oftálmica en los ojos.</li>
	<li>Afeitar la superficie del abdomen y esterilizar con yodo y alcohol tres veces. Alternan las toallitas alcohol y yodo; Limpie con un movimiento circular del sitio quirúrgico.</li>
	<li>Cubra la piel que rodea el campo quirúrgico con paños estériles para evitar la contaminación de la incisión y los instrumentos. Nota: La apertura de la cortina no debe ser mayor que el sitio quirúrgico preparado; no debe verse pelo en la abertura de la cortina.</li>
	<li>Pellizcar la piel de la madre de su abdomen con pinzas y corte la parte inferior del abdomen en una línea de 1-1,5 cm en la línea sagital medial con tijeras quirúrgicas estériles. Este cortes en la piel y más en la cavidad abdominal para que los embriones están expuestos ahora. Nota: Tijeras quirúrgicas se utilizan para incidir la piel y la capa peritoneal. Instrumentos estériles y guantes se utilizan para cada cirugía.</li>
	<li>Corte una abertura en medio de una pequeña gasa estéril y aplique en la parte superior la abertura quirúrgica. Hidratar con solución salina estéril. Tire de los embriones a través de la ranura en la gasa estéril, con cuidado para no retirar más de 4-5 embriones centrándose en un cuerno uterino al mismo tiempo.</li>
	<li>Hidratar los embriones con solución salina estéril antes de y a través de la inoculación para garantizar que no se sequen. El seguimiento de que los embriones son inyectados y su ubicación en el cuerno uterino. Los embriones así son tratados como experimentos separados, como embriones no cambian de posición mientras se desarrolla en el útero. (Seguir al 1.15 por inyección intrauterina).</li>
	<li>Coloque suavemente una espátula debajo de la cabeza del embrión. Iluminar los embriones con una lámpara para visualizar las suturas de la cabeza y el cráneo. Nota: Se sigue una técnica aséptica, incluyendo instrumentos y guantes quirúrgicos estériles. Después se manipulan elementos no estériles (como la lámpara), guantes deben cambiarse con nuevos guantes estériles antes de manipular instrumentos estériles y áreas.</li>
	<li>Posición de la cabeza mediante la manipulación del embrión con la lámpara (detrás de la cabeza de visibilidad) y los dedos libres hasta que la cabeza del embrión es empujado hacia arriba contra la pared del útero y se sujeta con la mano no dominante. Nota: Colocación del embrión es una parte fundamental y la técnica que lleva a la práctica la mayoría. Demasiada presión de los dedos puede dañar las membranas embrionario conduce a mortalidad y no hay suficiente presión puede dificultar la inyección.</li>
	<li>Uso de los vasos sanguíneos a lo largo de la sutura del cráneo como una guía. Inyectar el virus ZIKV (~ 1 μl, 1,7 × 106 DICT50/mL aislamiento mexicano MEX1-44) en los ventrículos laterales del cerebro de embriones E14.5 con el montado de la jeringa y la aguja. Utilizar los medios de control como una inyección simulada.</li>
	<li>Para mejorar la retención del embarazo, evitar inyección viral de los dos embriones al lado de los ovarios y los dos embriones al lado de la vagina superior (figura 1A). En general, se inyectan no más de 6 embriones por camada para reducir el tiempo de la cirugía y evitar pérdida del embrión.</li>
	<li>Coloque los embriones inyectados en las presas embarazadas y llenar la cavidad abdominal con ~ solución salina estéril 0.5 mL. Para cerrar, primero la sutura tanto el músculo abdominal peritoneal y luego en segundo lugar de la sutura la capa externa de la piel con suturas estériles 4,0. Es preferible utilizar suturas interrumpidas; hay posibilidad de dehiscencia de la herida si el ratón mastica la sutura.</li>
	<li>Coloque el ratón en una jaula parcialmente apoyado sobre una almohada para permitir que el ratón para escapar a un área sin calefacción si es necesario. Monitorear a las madres mientras se recupera (1-2 h) de la anestesia. Desarrollo de los embriones después de cirugía de variados tiempos según experimentos individuales.</li>
	<li>
Inyección intrauterina
	<ol>
<li>Con un cuerno uterino y embriones expuestos, utilizar una aguja de jeringa y 27G de 1 mL a inyectar virus de Zika de 100 μL (106 TCID50 unidades en 100 μL de DMEM), o medio de control, en el espacio intrauterino o en el tejido placentario. Tenga en cuenta que los embriones han inyectado para disecciones de fase embrionaria. Ver trabajo publicado anteriormente para más detalles18.</li>
		<li>Coloque los embriones inyectados en las presas embarazadas y llenar la cavidad abdominal con ~ solución salina estéril 0.5 mL. Para cerrar, primero la sutura del músculo abdominal peritoneal y luego en segundo lugar de la sutura la capa externa de la piel con suturas estériles 4,0. Es preferible utilizar suturas interrumpidas; hay posibilidad de dehiscencia de la herida si el ratón mastica la sutura.</li>
		<li>Coloque el ratón en una jaula parcialmente apoyado sobre una almohada para permitir que el ratón para escapar a un área sin calefacción si es necesario. Monitorear a las madres mientras se recupera (1-2 h) de la anestesia. Desarrollo de los embriones después de cirugía de variados tiempos según experimentos individuales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. neonatal inoculación Intracerebral del Virus Zika: P0/P1
<ol><li>Asegurar que las jeringas de inyección gas-tight (volumen de 10 μl) y agujas no estén obstruidas. Limpiar y probar cargando tres jeringas desechables de 20 mL con agujas calibre 26: uno con solución salina, uno con etanol al 70% y otro con aire para eliminar las soluciones. Esterilizar con 10% de lejía si previamente utilizado para la inyección de virus.</li>
	<li>Mantener el virus en el hielo. Cargar la jeringa llena con solución salina para reducir el volumen muerto de la jeringa y extraer 0,75 μl de aire para separar el material de inyección de la solución salina.</li>
	<li>Configurar una cámara de recuperación humidificado calentado para cachorros inyectados. Usando un bloque de la calefacción, coloque un recipiente cerrar (como un cuadro de punta vacía) con una gasa estéril y humedecer con solución salina. Precalentamiento antes de comenzar las inyecciones.</li>
	<li>Configurar la microinyectora incluyendo la bomba y el controlador. Determinar el código de tipo de dispositivo para la jeringa específica (es decir, para una jeringa de 10 μl, el tipo de dispositivo es "D"). Determinar la velocidad de inyección.</li>
	<li>Recoger las crías día postnatal 0 o 1 (P0/P1) cerca de la instalación quirúrgica. Cargar la jeringa de inyección con el virus. Desinfectar el Monte cabeza de cachorro con el 70% EtOH.</li>
	<li>Envuelva los cachorros en una fina capa de Gasa y enterrarlas completamente en hielo para lograr un estado anestésico. Los cachorros son cryoanesthetized por 5 minutos, asegúrese de que los cachorros son suficientemente anestesiados para inyección realizando una pizca de cola toe sin respuesta. Esto rinde aproximadamente 15 min de un estado anestésico.</li>
	<li>Colocar el cachorro sobre Monte cabeza, esterilizar la superficie de la cabeza y yodo, etanol (tres veces) y luego seque con un paño estéril (isopropanol 70% EtOH).</li>
	<li>La marca lambda con un marcador negro y grabar las coordenadas en lambda utilizando el instrumento estereotáxicas. Mida la distancia desde lambda en el borde del ojo y el comenzar de las coordenadas estereotáxicas de lambda calcular la distancia de 2/5 de lambda a ojo (para ambos hemisferios si inyectan ambos).</li>
	<li>Vuelva a comprobar la profundidad anestésica antes de crear un agujero para el sitio de inyección. Usar una aguja de calibre 26 para superficialmente y cuidadosamente perforar el cuero cabelludo y el cráneo en el sitio de inyección (el cráneo es muy suave en los recién nacidos) para crear una abertura para la aguja de inyección.</li>
	<li>Baje la aguja de inyección en el lugar pinchado y una vez que la aguja ha infringido a la piel, calcula una profundidad de 1 mm para el sitio de inyección (ventrículo lateral) utilizando el instrumento estereotáxicas.</li>
	<li>Una vez que la aguja se baja a la profundidad de la inyección, programa la microinyectora para inyectar: 1 μl de virus, a una velocidad de 10 nL/s, inyectando aproximadamente 1 μl sobre 1,5 minutos (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV).</li>
	<li>Cuando termine la inyección, esperar 30 s y retraer la aguja en incrementos de 0,5 mm, girando el tornillo (dorsal), esperar 30 s después de cada incremento. Nota: Esto reduce la salida del virus inyectado.</li>
	<li>Una vez retirado, ya sea rápidamente cargar la jeringa y aguja con más virus (virus diferentes o controles de simulacros se deben cargar en distintas jeringas/agujas) o quitar el cachorro desde el Monte de cabeza a la cámara de vapor precalentada. Supervisar el cachorro cada pocos minutos para medir la recuperación. Vuelva a colocar los cachorros con su camada.</li>
</ol>3. adulta inoculación Intracerebral del Virus Zika
<ol><li>Inyectar a ratones adultos por vía intraperitoneal con clorhidrato de ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (5-10 mg/kg) diluidos en solución salina estéril para inducir la anestesia. Inyectar la buprenorfina-SR (0.5-1.0mg/kg) por vía subcutánea para inducir analgesia. Pies y cola pellizcar el ratón para garantizar su estado anestésico y posteriormente montar el instrumento estereotáctica (con una almohada) para inmovilizar la cabeza durante la cirugía.</li>
	<li>Añadir pomada oftálmica en los ojos para evitar que los ojos del ratón se seque durante la cirugía. Afeitado del cuero cabelludo a partir detrás de los ojos hasta el comienzo de las orejas. Esteriliza la piel con yodo y el 70% EtOH tres veces. Alternan las toallitas alcohol y yodo; Limpie con un movimiento circular del sitio quirúrgico.</li>
	<li>Vuelva a comprobar la profundidad anestésica antes de la incisión de la piel. Con un bisturí, hacer una incisión de 0.5 cm a lo largo de la línea sagital medial de la cabeza en la ubicación esterilizada, exponiendo el bregma. Usando un movimiento de balanceo con un aplicador con punta de algodón, limpiar la superficie del cráneo de los tejidos meníngeos, mientras que simultáneamente empuja la piel lejos de los sitios de inyección.</li>
	<li>A partir de bregma, alinee la broca quirúrgica e identificar los sitios de inyección utilizando las coordenadas siguientes: AP mm-0,50, ML: +-1,5 mm. con el pedal de control, perforar el cráneo lentamente como sólo perforar hueso hasta que se ha borrado un agujero para la aguja.</li>
	<li>Reemplazar el taladro con la microinyectora bomba y estanqueidad jeringa (volumen de 10 μl) en el estereotáxicas. Dejando una burbuja pequeña del aire entre la solución salina y el virus, dibujar ~ 4-5 μl de virus. Determinar el código de tipo de dispositivo para el volumen de la jeringa específica (es decir, D para jeringa de volumen de 10 μL). Baje la aguja a DV:-1,50 mm de la superficie del cerebro. Para inyectar 1 μl del virus, el programa un índice de 10 nL/s, aproximadamente 1 μl más de 1,5 min de la inyección.</li>
	<li>Cuando termine la inyección, esperar 30 s y retire la aguja en incrementos de 0,5 mm, esperar 30 s después de cada vuelta. Esto reduce el reflujo y la salida del virus inyectado.</li>
	<li>Cuando el injection(s) terminado, utilice pinzas para aflojar la piel y recuperar el cráneo expuesto. Sutura el cuero cabelludo de nuevo con 4,0 suturas y quitar el mouse del instrumento estereotáxicas. Coloque el ratón en una jaula parcialmente apoyado sobre una almohada para permitir que el ratón para escapar a un área sin calefacción si es necesario y vigilar mientras se recupera (1-2 h) de la anestesia.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe aquí es un método de inoculación intracerebral de la ZIKV en etapas embrionarias, neonatales y adultos para la investigación de los daños inducidos por ZIKV en el desarrollo cerebral. Si bien sencilla, hay algunas consideraciones que los investigadores deben tomar para asegurar la calidad del estudio y la seguridad de los involucrados.
DENV está estrechamente relacionado con ZIKV del género flavivirus. DENV no ha sido causalmente vinculado con trastornos cerebrales pediátricos en l...

Microcefalia es una condición que resulta del desarrollo defectuoso del cerebro caracterizado por más pequeño que el tamaño promedio de la cabeza en los recién nacidos. Los niños con microcefalia muestran un rango de síntomas que pueden incluir el retraso en el desarrollo, convulsiones, discapacidad intelectual, pérdida de la audición, problemas de visión y problemas con el movimiento y el equilibrio, entre otros, dependiendo de la severidad de la enfermedad y causar1,2,3. Esta condición es multifactorial en la naturaleza, con el agente infeccioso, genético y factores ambientales relacionados con causando microcefalia4,5,6,7,8, 9. Antes del estallido de 2015-2016 ZIKV, 8 niños de cada 10.000 nacimientos fueron diagnosticados con microcefalia en los Estados Unidos según la CDC10. 1 de febrero enst de 2016 la Organización Mundial de la salud declaró el virus Zika emergencia salud pública de preocupación internacional debido al alarmante aumento de diagnósticos de microcefalia asociada a infección por ZIKV en madres11, 12. Un estudio reciente de los CDC sobre casos ZIKV en los Estados Unidos sugiere que materna ZIKV infección resulta en un 20-fold riesgo para un niño desarrollar microcefalia en comparación con individuos no infectados y 4% de las madres ZIKV infectado de los Estados Unidos ha resultado en niños con microcefalia11. La tasa de defectos de nacimiento asociados microcefalia durante el embarazo de la infección por ZIKV en Brasil se han divulgado para haber afectado hasta un 17% de los bebés de madres infectadas, indicando que otros factores en América Latina pueden contribuir a un mayor riesgo 13. Si bien sabemos que el ZIKV puede causar microcefalia y patogenesia en progenitoras neurales celular (NPC) población7,8,14, la patogenesia completa de ZIKV en el desarrollo del cerebro sigue siendo elusiva. Es importante desarrollar modelos animales para investigar los mecanismos de la enfermedad que las anomalías cerebrales asociadas con infección por ZIKV.
Para estudiar directamente el efecto que la ZIKV tiene en el desarrollo del cerebro, primero desarrollamos un modelo de ratón con inoculación intracerebral del cerebro de (E14.5) 14,5 día embrionario ZIKV7. Esta etapa fue elegida ya que se considera a representante del final del primer trimestre de gestación humana14. Los cachorros pueden sobrevivir hasta día postnatal 5 (P5) con este método de inyección intracerebral embrionario (~ 1 μl de 1.7 x 106 cultivo de tejidos dosis infectiva (DICT50/mL)). Estos cachorros postnatales muestran un rango de fenotipos similar observado en neonatos humanos infectados incluyendo ventrículos agrandados, pérdida neuronal, axonal vacuo, astrogliosis y microglial activación12,15. El cerebro de un ratón recién nacido es relativamente inmaduro, similar a la etapa de desarrollo del cerebro humano en mitad de la gestación16, y el desarrollo del cerebro del ratón incluye un importante componente postnatal. Para estudiar más adelante infecciones de etapa de gestación, también se describe un método de infección postnatal. Los recién nacidos infectados por ZIKV en P1 son capaces de sobrevivir hasta que después de la inyección 13 días. Infección de la sangre-llevado de la etapa adulta se ha descrito en el ratón previamente17 pero requiere el uso de factores de la transcripción del factor regulador (IRF) de interferón (IFN) IRF-3, -5, cepa-7 triple nocaut. Este protocolo describe un método de inoculación ZIKV intraventricularly para evitar la desactivación de la respuesta antiviral del modelo murino en el adulto. Mientras que esto evita el sistema inmune murino, esta ruta de inyección no directamente mímico la ruta típica de la infección. Para resolver esta discrepancia directamente, el experimentador puede llevar a cabo una infección intrauterina de ZIKV en lugar de la vía intracraneal. Adoptado del anterior trabajo18, hemos descrito brevemente esta técnica en el presente Protocolo de infección embrionaria.
Las cepas de virus Zika implementadas con esta técnica incluyen la cepa mexicana 44 MEX17,19 y el africano aislar Señor-766 aislado en 194720. Zika MEX1-44 fue aislado en Chiapas, México en enero de 2016 de un infectado Aedes aegypti mosquito. Obtuvimos este virus con permiso a través de la rama médica de la Universidad de Texas en Galveston (UTMB). Además, se inoculó el virus del Dengue serotipo 2 (DENV2) utilizando esta técnica en un estudio de comparación. DENV2, cepa S16803 (secuencia de GenBank GU289914), fue aislada de una muestra de paciente de Tailandia en 1974 y pasados en células C6/36. El virus fue pasado dos veces en células Vero por el centro de referencia mundial de virus emergentes y arbovirus (WRCEVA) antes de las inyecciones de ratón. Esto demuestra que esta técnica funciona igualmente bien para diversas cepas de ZIKV y otros flaviviruses que puede tener un impacto en el desarrollo del cerebro.

<table><tbody><tr><td>Eje de transmisión flexible Taladro Motor de suspensión</td><td>Leica</td><td>39416001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Stereotax</td><td>Kopf</td><td>04557R</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 Microjeringa Controlador de bomba</td><td>WPI</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 UltraMicroPump</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Modulamp</td><td></td> Schott-Luer-lock <td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo (calibre 19)</td><td>Hamilton</td><td>90619</td><td></td></tr><tr><td>Punto de fusión capilar</td><td>Kimble</td><td>34500-99</td><td>Aguja de vidrio</td></tr><tr><td>Fluoro-Max: Microesferas fluorescentes rojas</td><td>Thermo Scientific</td><td>R25</td><td>Sin dilución; Uso para inyecciones de práctica</td></tr><tr><td>10 y micro; L, modelo 1701 LT SYR</td><td>Hamilton</td><td>80001</td><td>para inoculación embrionaria</td></tr><tr><td>10 y micro; L, modelo 1701 RN SYR, NDL extraíble pequeño, calibre 26s, 2 pulgadas, estilo de punta 2</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td>para neonatos/adultos</td></tr><tr><td>4-0 Suturas de nailon Ethilon</td><td></td> <td>Ethicon-Aceite</td><td></td></tr> <tr><td>mineral</td><td>Extractor</td> <td>de</td> micropipetas VWR Amoladora de <td></td></tr><tr><td>micropipetas</td><td>P-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de Sutter Instruments</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Fastgreen FCF Dye</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td>inyecta con un 0,5%</td></tr> <tr><td>de anti<cuerpo de antígeno >del grupo <</td> > <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fuerte</td><td>Millipore</td><td>MAB10216</td><td>ms IgG2a 1:400 (Figura 2, Figura 3)</td></tr><tr><td>Pax6</td><td>DBHB</td><td>Pax6-s</td><td>ms IgG1 1:20</td></tr></tbody></table>

establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el virus zika utilizando estrategias de inyección intracerebral: embrionario, neonatal y adulto

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

El virus Zika (ZIKV) es un flavivirus actualmente endémico en Norte, centro y Sudamérica. Ahora se ha establecido que el ZIKV puede causar microcefalia y anomalías cerebrales adicionales. Sin embargo, el mecanismo subyacente a la patogenesia de ZIKV en el cerebro en desarrollo sigue siendo confuso. Métodos quirúrgicos intracerebrales se utilizan con frecuencia en la investigación de la neurociencia para responder preguntas sobre desarrollo normal y anormal del cerebro y la función cerebral. Este protocolo utiliza técnicas quirúrgicas clásicas y describe métodos que permiten modelo ZIKV-asociado humano enfermedad neurológica en el sistema nervioso del ratón. Mientras que la inoculación directa del cerebro no modelo el modo normal de transmisión del virus, el método permite a los investigadores a hacer preguntas específicas sobre la consecuencia después de la infección ZIKV del cerebro en desarrollo. Este protocolo describe etapas embrionarias, neonatales y adulto de la inoculación intraventricular de ZIKV. Una vez dominado, este método puede convertirse en una técnica sencilla y reproducible que sólo tiene unas horas para llevar a cabo.

Imágenes representativas de nuestros métodos de inyección para la inoculación de ZIKV del cerebro embrionario se muestran en diagramas que representan las inyecciones intracerebrales (figura 1A) e intrauterina y intraplacental inyecciones (figura 1B), ilustrando el manera la presa embarazada y embriones deben ser vistos y orientada a la cirugía (Protocolo de inoculación embrionario). Figura 2A presen...

Aquí se describe un método para el establecimiento de un modelo de microcefalia inducida por virus Zika en ratón. Este protocolo incluye métodos para embrionario, neonatal y adulto etapa inoculación intracerebral del virus Zika.

Establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el Virus Zika utilizando estrategias de inyección Intracerebral: embrionario, Neonatal y adulto

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

El objetivo general de los métodos quirúrgicos presentados aquí es establecer modelos in vivo de infección intracraneal por el virus del Zika. Este método puede ayudar a abordar las preguntas clave en el campo, como la patología y el mecanismo de la infección por el virus del Zika en el cerebro, tanto en la etapa temprana y tardía del desarrollo como en la etapa adulta. La principal ventaja de esta técnica es que la infección de la dirección del cerebro se puede lograr fácilmente.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las terapias o diagnósticos de la microcefalia inducida por el virus del Zika u otros trastornos del desarrollo neurológico. Si bien este método puede proporcionar información sobre la patogénesis del virus del Zika, también se puede aplicar para estudiar otras infecciones por flavivirus en el cerebro, como el virus del dengue. Justo antes de la cirugía, cargue la mezcla inyectable para el virus del Zika en una aguja de inyección de vidrio preparada ensamblando primero la jeringa de inyección hermética de 50 microlitros, el accesorio Luer-lock y el tubo.Sature la jeringa y el tubo ensamblados con aceite mineral. Una vez saturado, coloque la aguja y extra

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra la generación de un modelo experimental de ratón de malaria cerebral. Los esporozoítos aislados de mosquitos hembra infectados con Plasmodium berghei se inyectan en las venas de la cola de un ratón restringido, lo que provoca la ruptura de la barrera hematoencefálica y la inflamación del cerebro, causando malaria cerebral. Este modelo de ratón infectado ofrece una valiosa herramienta para estudiar in vivo la patología microvascular asociada a la malaria cerebral.

Generación de un modelo murino de malaria cerebral experimental utilizando esporozoítos derivados de mosquitos huéspedes

Este video muestra el establecimiento de un modelo in vitro de infección por el virus del Zika en un cerebro en desarrollo. Los organoides cerebrales humanos que contienen rosetas de células madre, células progenitoras neurales (NPC) y neuronas están infectados con el virus del Zika. El virus infecta a las NPC y desencadena la apoptosis, interrumpiendo el desarrollo de los organoides.

Desarrollo de un modelo in vitro de la infección por el virus del Zika en organoides cerebrales

Este video muestra la generación de un modelo de ratón con una infección en el SNC. A una cría lactante se le inyecta el virus tanto por vía intracraneal como intraperitoneal. El virus se propaga, infectando el SNC causando la muerte de las células neuronales y la inflamación. El cachorro es evaluado para detectar síntomas de infección a medida que la enfermedad progresa.

Generación de un modelo murino con una infección del sistema nervioso central

El video muestra la inyección intracerebral de suspensión del virus del Zika en un ratón adulto para inducir neurodegeneración. Un ratón anestesiado se asegura en un marco estereotáxico y se perfora un orificio en el cráneo expuesto para la inyección. Se inyecta una suspensión del virus del Zika en el tejido cerebral. La infección viral causa inflamación, lo que lleva a la neurodegeneración.

Establecimiento de un modelo de neurodegeneración inducida por el virus del Zika en un ratón adulto

Este video muestra un procedimiento para infectar células madre neurales fetales humanas con el virus del Zika. Las células infectadas se pueden utilizar para estudios posteriores.

Infección por el virus del Zika de células madre neurales fetales

Aquí demostramos una técnica para la transducción neuronal generalizada mediante inyección intraventricular de virus adenoasociados en el cerebro de ratón neonatal.  Este método proporciona una manera rápida y fácil de lograr la expresión de por vida de los transgenes administrados viralmente.

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

Este protocolo describe una técnica que se utiliza para modelar la infección del virus Zika del cerebro humano en desarrollo. Wildtype o líneas de células madre diseñadas, los investigadores pueden utilizar esta técnica para descubrir los diferentes mecanismos o tratamientos que puedan afectar principios infección cerebral y microcefalia resultante en embriones infectados por el virus Zika.

Modelado de la infección del Virus Zika del desarrollo cerebro humano In Vitro usando células madre derivado Cerebral organitas

Este artículo detalla los métodos que se utilizan para expandir células madre neurales de cerebro fetal humano en la cultura, así como distinguir diferentes subtipos neuronales y astrocitos, con énfasis en el uso de células madre neurales para el estudio de la infección del virus Zika.

Infección por el Virus Zika de células madre neurales de cerebro Fetal humano cultivadas para análisis de Immunocytochemical

Se describe un protocolo para evaluar las respuestas de células T antígeno específicas en los órganos de immunoprivileged del Ifnar1- / - modelo murino para la infección del virus (ZIKV) Zika. Este método es fundamental para la investigación de los mecanismos celulares de la protección y la inmunopatogénesis de las vacunas ZIKV y también es valiosa para la evaluación de su eficacia.

Evaluación de respuestas de células T Zika Virus-específica en Immunoprivileged órganos de ratones- / - Ifnar1 infectados

Aquí, presentamos un protocolo para crear un modelo murino irevolucionario inmunocompetente (Instituto de Investigación del Cáncer) de infección del sistema nervioso central para mostrar el desarrollo de la neuropatía. El control de trastornos encefalíticos víricos agudos por puntuaciones idénticas de enfermedad podría realizarse para mostrar in vivo la neuropatía inducida por el virus del dengue.

Un modelo murino de enfermedad similar a la encefalitis vírica aguda inducida por el virus del dengue

El objetivo del protocolo es demostrar las técnicas utilizadas para investigar la enfermedad viral aislándose y cuantificando el virus del Zika, a partir de múltiples órganos en un ratón después de la infección.

Aislamiento y cuantificación del virus del Zika de múltiples órganos en un ratón

Aprende a establecer modelos de ratón para infección cerebral por Virus Zika mediante inyección intracerebral en etapas embrionaria, neonatal y adulta. Este método permite estudiar la patogénesis viral y microcefalia inducida.

Establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el Virus Zika utilizando estrategias de inyección Intracerebral: embrionario, Neonatal y adulto (Video) | JoVE Journal

Establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el Virus Zika utilizando estrategias de inyección Intracerebral: embrionario, Neonatal y adulto

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