Fraccionamiento subcelular para la activación de ERK a péptidos derivados de mitocondrial tratamiento

El objetivo general de este experimento es identificar la cascada de señalización descendente involucrada en las células estimuladas con péptidos derivados de las mitocondriales. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de los péptidos derivados de las mitocondrias, como qué vías de señalización están involucradas y dónde ocurre esto. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla y relativamente fácil de realizar.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando examinamos la señalización de ERK mediada por humanos, que nos proporcionó información limitada sobre los hechos posteriores. El método de Kersher de subescala nos dio una mejor idea del papel de la señalización mediada por humanos. Al tercer día después de enchapar y lavar dos veces diez al sexto, celdas SH-SY5Y o HEK293 según el protocolo de texto.

Disuelva los péptidos de humanina S14G en agua destilada filtrada de dos micras de punto cero. Y reconstituirlos como una solución madre de un milimolar. Alicuente el medio precalentado que contiene suero o sin suero en un tubo cónico de 15 mililitros y agregue una solución madre de péptido de humanina a temperatura ambiente para hacer una concentración de trabajo.

Reemplace inmediatamente el medio en las células con seis mililitros de la solución peptídica. E incubar las células durante el tiempo adecuado. Use 10 mililitros de PBS helado para lavar las celdas dos veces.

A continuación, raspe las células del plato en cinco mililitros de PBS helado. Y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar las células a 500 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de tampón de fraccionamiento helado e incube en hielo durante 15 minutos. Centrifugar el tubo a 250 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, recoja el sobrenadante como fracción citoplasmática y guarde la bolita para la fracción nuclear.

Centrifugar el sobrenadante para eliminar los restos celulares y otros contaminantes a 18000 veces G y cuatro grados centígrados durante diez minutos. Y luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Esta es la fracción de citisol.

Vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de tampón de lavado helado y centrifugue la solución a 250 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y use 100 microlitros de tampón de extracción nuclear helado para volver a suspender el pellet. A continuación, sonique la muestra sobre hielo 10 veces.

Vuelva a centrifugar la muestra. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Para aislar la fracción mitocondrial cruda, use 10 mililitros de PBS helado para lavar las células en cada plato de 10 centímetros.

Luego agregue cinco mililitros de PBS helado y use un raspador de celdas para separar las celdas. Transfiera las suspensiones celulares a un solo tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, centrifugar las células a 600 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Aspire el PBS y use un mililitro de tampón de aislamiento mitocondrial helado para volver a suspender el pellet. Luego, con un mortero recubierto de politetrafluoroetileno sobre hielo, homogeneice las células con 25 golpes de un homogeneizador de dos mililitros. Transfiera el homogeneizado a un tubo de microcentrífuga y centrifugue la muestra a 600 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para eliminar los núcleos y las células intactas.

A continuación, recoja el sobrenadante, transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga y centrifugue la solución a 7000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet con 200 microlitros de tampón de aislamiento de mitocondrias helado y transfiera la solución a un nuevo tubo de microcentrífuga. Centrifugar el tubo a 7000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Después de repetir el lavado, use 15 microlitros de tampón RIPA para volver a suspender el pellet e incubar la suspensión en hielo durante 10 minutos. A continuación, centrifugar la muestra a 16000 veces G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Transfiera el sobrenadante, que es la fracción mitocondrial, a un tubo nuevo.

Cuantificar y llevar a cabo el western blot según el protocolo de texto. Usando el procedimiento demostrado en este video, las células HEK293 y SH-SY5Y se retiraron con una y 100 micromolares de humanina S14 G, un potente análogo de la humanina. Y se analizó la forma total y fosforilada de ERK12 en teanina 202, tirosina 204 de extractos de proteínas totales.

Como se ve aquí, el tratamiento con humanina S14G mostró un aumento en la fosforilación de ERK12 y su sitio regulador de teanina-202, tirosina-204. Para comprender el objetivo de la activación de ERK12 mediada por S14G humanina, se analizó la localización subcelular de ERK12 total y fosforilada después del tratamiento con S14G humanina. Como se muestra en estos Western blots, en las células HEK293, la ERK fosforilada aumentó tanto en el citoplasma como en el núcleo, pero no en las mitocondrias.

Sin embargo, en las células SH-SY5Y, la ERK fosforilada disminuyó en el núcleo del citoplasma y las mitocondrias. Lo que sugiere que la fosforilación de ERK mediada por humanos S14G puede desempeñar un papel diferente en diferentes tipos de células y diferentes condiciones. Una vez dominado, el fraccionamiento nuclear celular se puede hacer en una hora y el fraccionamiento mitocondrial se puede hacer en una hora y 30 minutos, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todas las muestras en hielo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la precipitación coinmune y la espectrometría de masas, con el fin de comprender los objetivos posteriores de las moléculas de señalización.