Name: Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprende a preparar cromatina de calidad ChIP a partir de músculo esquelético de ratón adulto mediante homogeneización mecánica. Este protocolo optimizado facilita el estudio de la regulación génica y los mecanismos moleculares de la atrofia muscular.

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Agradecemos a todo el personal de la planta de secuenciación de alto rendimiento IGBMC, miembro del consorcio "Francia Génomique" (ANR10-INBS-09-08) y todos los servicios generales de IGBMC en particular el personal de la instalación animal IGBMC. Este trabajo fue financiado por becas del CNRS, INSERM, la AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, los franceses del estado fondo a través de la ANR en el programa Investissements Avenir con ANR-10-IDEX-0002-02, la empresa Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 y la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. S.J fue apoyado por la Ligue Nationale contre le cáncer de la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 y V.U por el Ministère de l ' enseignement et de la Recherche. ID es un 'équipe labellisée' de la Ligue Nationale contre le cáncer.

ratones fueron mantenidos de conformidad con las directrices institucionales sobre el uso y cuidado de animales de laboratorio y de acuerdo con directrices nacionales de cuidado Animal (Comisión Directiva 86/609/CEE; El francés decreto no.87-848). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Nacional de ética francés.
 1. aislamiento de tejido muscular <ol><li>sacrificio adultos 6 a 8 semanas de edad ratón por dislocación cervical. Sterlise la extremidad por lavado con etanol al 70% y disecar los músculos de extremidades (gastrocnemio, tibial Anterior, cuadriceps) utilizando tijeras de punta fina y fórceps. 
	Nota: Un ratón debe generar alrededor de 500 mg de tejido.</li>
	<li>Pique los músculos en un tubo de ensayo 2 mL que contiene 1 mL de tampón hipotónico helada a una preparación homogénea de pequeño (&#60; 2-3 mm 3) piezas finas tijeras y dejar el tubo de agitación en un agitador de Banco superior a 4 ° C durante 5-10 min</li>
</ol> 2. Lisis de tejido Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.
<ol><li>Traslado el homogenizado a un tubo de fondo redondo de 14 mL y resuspender en tampón hipotónico frío (libre de EDTA inhibidor de la proteasa cóctel y PMSF) de 5 mL.
	<ol><li>Homogenise tejido muscular picada mediante un flojo dounce (20-30 movimientos dentro de 3 minutos) o un homogeneizador de tejidos mecánicos para 15-30 s en tubos de fondo redondo 14 mL. 
		Nota: La eficiencia de la lisis puede evaluarse en esta etapa por microscopia ligera, y si es necesario, puede realizarse la interrupción adicional.</li>
	</ol></li> <li>Traslado el homogeneizado en tubos de 15 mL y completar volumen a 10 mL con tampón hipotónico frío. Fijar el homogeneizado como se describe a continuación antes de proceder con el ratón siguiente.</li>
</ol> 3. Fijación <ol><li>añadir formaldehído a concentración final de 1% y agitar durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir glicina a una concentración final de 0,125 M en cada tubo para detener la fijación y agitar durante 5-10 min a temperatura ambiente.</li>
</ol> 4. Preparación de núcleos Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.
<ol><li>Homogenise fijo lisado usar un flojo dounce (5-10 movimientos).
	<ol><li>Transferencia a un tubo de 15 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C para obtener núcleos y ruina celular.</li>
	</ol></li> <li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en tampón hipotónico fresco 5 mL. Filtrar el lisado a través de un tamiz celular de 70 μm en un tubo de 50 mL. Volver a filtrar el líquido filtrado a través de un tamiz de 40 μm celular.</li>
	<li>Transferir el filtrado a un tubo de 15 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos a 4 ° C para obtener el pellet nuclear. 
	Nota: En esta etapa, los núcleos pueden ser sonicados inmediatamente, o el rápido congelado como una pelotilla seca en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C.</li>
</ol> 5. Sonicación <ol><li>evaluar el volumen de la pastilla nuclear (alrededor de 50 μL para homogeneización mecánica y dounce) y resuspender en tampón de sonicación hasta 3 a 4 veces del volumen nuclear lleno y someter a ultrasonidos durante 10-15 min a 4 ° C utilizando un sonicador . 
	Nota: La cromatina puede ser analizada inmediatamente como se describe a continuación (6) o congelada y almacenada a -80 ° C.</li>
</ol> 6. Evaluar el tamaño del fragmento de la cromatina tras sonicación Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.
<ol><li>Para de-reticular, 30 μl de la cromatina en un tubo de ensayo de 1,5 mL y añadir 20 μl 5 M NaCl. El volumen a 500 μl e incubar a 65 ° C durante la noche.
	<ol><li>Al día siguiente, realizar un tratamiento con proteinasa K de 1 μl (stock de 20 mg/mL), 10 μl 2 M Tris pH 6.8 y 10 μl de EDTA de 0,5 M por 1 h a 42 º C. Realice un fenol-cloroformo/cloroformo la extracción y precipitar el ADN con 1 volumen de sodio acetat e (3 M) y 2 volúmenes de etanol al 100% para una h a-80 ° C o durante la noche-20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>De la pelotilla de la DNA por centrifugación a 13.500 x g durante 15 minutos decantar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70% frío y centrifugar nuevamente por 5 min, decantar el sobrenadante y secar el pellet.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en el volumen original (30 μL) de tampón TE. Medir la concentración de ADN en un espectrofotómetro la absorbancia a 260 nm/280 nm. Pipetear 500-1.000 ng de ADN junto con una escala de tamaño de DNA en carriles separados de un gel de agarosa al 1,5% y realizar la electroforesis para determinar el tamaño de fragmento de cromatina. 
	Nota: Tamaño del fragmento debe estar entre 200-500 pares de bases y no debe ser fragmentos de peso molecular perceptible corresponde a no - o mal-fragmentación ADN. Si es necesario, la solución de la cromatina (paso 5) puede volver a sonicada durante más tiempo y entonces volvieron a analizar como se describe anteriormente hasta obtener el tamaño óptimo es.</li>
</ol> 7. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.
<ol><li>Abalorios de sepharose del bloque G de la proteína por tomar 1 mL de la mezcla de 50% en etanol. Pellets de los granos por centrifugación a 400 x g durante 1 min en una sobremesa centrifugar y lavan con 1 mL de la centrifugadora de buffer TE a 400 x g y repetición el Washington
	<ol><li>Después de la segunda centrifugación, resuspender en 1 mL de tampón de dilución de ChIP con 25 μl de BSA (stock 20 mg/mL) y 20 μl de levadura tRNA (stock 10 mg/mL). Bloquear las cuentas de al menos 2 h antes de su uso por rotación (40-60 rpm) a 4 ° C.</li>
		<li>Diluir 50 μg de la cromatina (paso 5) 8 a 10 veces con tampón de dilución de la viruta. Añadir 50 μl de mezcla de grano bloqueado e incubar por 2 h giratoria (40-60 rpm) a 4 ° C. Centrifugar a 400 x g a 4 ° C para obtener previamente despejado de la cromatina y transferirlo a un tubo nuevo.</li>
	</ol></li> <li>Para la inmunoprecipitación, añadir la cantidad apropiada de anticuerpo primario (p. ej., 1-2 μg por 10 μg de cromatina) e incubar durante una noche con giro en 4 ° C. 
	Nota: La cantidad óptima de anticuerpo puede ser recomendada por el proveedor o se puede determinar empíricamente mediante la realización de ChIP-qPCR con diferentes cantidades de anticuerpo hasta enriquecimiento óptima se observa. También sepharose proteína G puede ser reemplazado por proteína A sefarosa según el subtipo de anticuerpo usado.</li>
	<li>Añadir las cuentas bloqueadas al día siguiente e incubar durante 1 h con rotación (40-60 rpm) a 4 ° C. Centrifugar a 400 x g por 20-30 s los granos de la pelotilla, eliminar el sobrenadante, y empezar el ChIP lava.</li>
	<li>ChIP lavados: realice los siguientes lavados con los almacenadores intermediarios: una vez con tampón salino de baja y luego dos veces con tampón salino alto, dos veces con tampón de LiCl y finalmente dos veces con Buffer TE.
	<ol><li>Realizar cada lavado durante 10 min con rotación (40-60 rpm) a 4 ° C y de la pelotilla de las cuentas entre cada colada por centrifugación a 400 x g por 20-30 s en una centrífuga de mesa.</li>
	</ol></li> <li>La elución, quite el último lavado y resuspender los granos en 250 μl de tampón de elución (recién preparado) por 15 min a temperatura ambiente agitando.</li>
	<li>Centrifugar a 400 x g y recoger el eluido en un tubo nuevo. Realizar este paso dos veces y luego de-reticulación el efluente durante la noche con 20 μl de NaCl 5 M y 1 μl Rnasa A (10 mg/mL), tratamiento con proteinasa K y fenol-cloroformo/cloroformo extractuar como en el paso 6.</li>
	<li>Resuspender en 50 μl de buffer TE y utilizar alícuotas para qPCR ChIP según protocolos estándar 15 para comprobar la calidad de la viruta de.</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li>
<li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAF4%2C+a+subunit+of+transcription+factor+II+D%2C+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613(2014).</li>
<li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530(2010).</li>
<li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).</li>
<li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOhkawa%2C+Y+%22Myogenesis%3A+Methods+and+protocols%22">Myogenesis: Methods and protocols</a>. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).</li>
<li>Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+the+subcellular+fractionation+of+skeletal+muscle+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue.</a> BMC Res Notes. 5, 513(2012).</li>
<li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li>
<li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li>
<li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Aquí describimos un nuevo protocolo para la preparación de cromatina de músculo esquelético de ratón adulto y muestran que esta cromatina es conveniente para los experimentos de ChIP que detectan modificaciones covalentes de la histona y atascamiento del factor de transcripción en los núcleos de la fibra muscular. Este protocolo implica varios pasos críticos. El primero es tejido que se pueden realizar por corte mecánico o dounce. Corte mecánico es más rápido y más reproducible y por lo tanto es el método de elección. Si...

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se han convertido en los métodos de elección para el estudio de transcripción y regulación epigenética de la expresión génica en distintos tejidos y tipos de la célula1. Esta técnica permite perfiles de genoma de modificaciones covalentes de la cromatina, ocupación variante de la histona y transcripción factor vinculante2,3.
Mientras que realizar ChIP de células cultivadas está bien establecida, ChIP de tejidos mamíferos sigue siendo más difícil. Preparación de cromatina chip implica varios pasos críticos que necesitan ser optimizados para todo tipo de tejidos y células. La cromatina puede ser preparada de los lisados celulares de las células cultivadas o purificación siguiente de sus núcleos. En el caso de tejidos mamíferos, lisis eficiente fijación formaldehído y purificación de núcleos son críticos para asegurar la óptima recuperación de la cromatina. Por otra parte, la elección de fijar los núcleos antes o después de su purificación debe determinarse experimentalmente. A pesar de estos obstáculos, el ChIP se ha realizado con éxito de tejidos como el hígado, testículo, cerebro4,5,6. En el caso del músculo esquelético, la interrupción de un tejido resistente físicamente, que exhibe un alto contenido de proteínas estructurales y el aislamiento de sus núcleos es particularmente desafiante. Dada esta especificidad, protocolos optimizados para otros tejidos no dan resultados satisfactorios para los músculos esqueléticos.
Aquí se describe un protocolo para aislar la cromatina ChIP-grado de tejido de músculo esquelético de ratón que consiste en alterar físicamente el tejido, fijación de formaldehído y el aislamiento de núcleos y sonicación. La eficacia de este método para preparar conveniente para el ChIP de este tejido la cromatina fue demostrada realizando qPCR ChIP y ChIP-seq para varios factores de transcripción, ARN polimerasa II y de modificaciones covalentes de histonas7.
Esta nueva técnica es mucho más rápida que un protocolo previamente divulgados8 que comprende largos pasos de digestión colagenasa durante ese tiempo, cambios en la localización genómica de factores de transcripción y pueden ocurrir alteraciones en la expresión génica. La rapidez con que los núcleos son aislados y fijo hace que el método descrito aquí particularmente atractiva para preparar cromatina que refleja más fielmente el estado nativo ocupación genómica. Por otra parte, aunque tienen otros métodos para la extracción de proteína o aislamiento de cromatina de tejido muscular han sido descrito8,9,10 y utilizado para los experimentos de ChIP-qPCR en genes seleccionados, sin ChIP-seq se ha reportado datos usarlos. El método aquí es conveniente para la transcripción factor e histona modificación ChIP-seq y por lo tanto debe ser también adecuado para 3 / 4C o aplicaciones de captura de conformación de la cromatina de HiC.

<table><tbody><tr><td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel Inhibidor de la Proteasa-Libre de EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G Perlas de Sefarosa</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído Grado EM</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Scientific 12091039</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>LEVADURA TRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Azul de Glucógeno</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II Anticuerpo ChIP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac Anticuerpo ChIP</td><td>Motivo activo</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 Anticuerpo ChIP</td><td>Aviva Biología de Sistemas</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 Ultrasonido Enfocado</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Artículos adicionales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loose Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml y 50 ml tubos falcon 14</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ml tubos redondos de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml y 2 ml tubos Eppendorf 70</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&mu; m y 40 &mu; Filtros de células m (Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Se describe un protocolo eficiente y reproducible para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto, un tejido resistente físicamente con un alto contenido de proteínas estructurales. Disecada extremidades músculos de ratones adultos físicamente se interrumpen por homogeneización mecánica, o una combinación de picado y douncing, en un tampón hipotónico antes de fijación formaldehído de la célula lisada. Los núcleos fijos son purificados por más ciclos de homogeneización mecánica o douncing y filtraciones secuenciales para eliminar restos celulares. Los núcleos purificados pueden ser sonicados inmediatamente o en una etapa posterior después de congelar. La cromatina puede ser sonicada eficientemente y es conveniente para los experimentos de inmunoprecipitación de cromatina, como lo demuestran los perfiles obtenido para factores de transcripción, ARN polimerasa II y modificaciones covalentes de histonas. Los eventos de enlace detectados con cromatina preparada por este protocolo son predominantemente aquellos que toman lugar en los núcleos de la fibra muscular a pesar de la presencia de cromatina de otro satélite de fibra-asociada y las células endoteliales. Este protocolo, por tanto, se adapta para estudiar la regulación de los genes en el músculo esquelético de ratón adulto.

Para aislar los núcleos, realizamos la homogeneización mecánica del tejido muscular disecado y picada para 15 o 45 s, en 18.000 y 22.000 rpm (véase Tabla de materiales). En todas las condiciones, los núcleos podrían ser separados de los desechos de tejido, pero el rendimiento fue óptimo con la velocidad más baja (figura 1A-B). Núcleos también pueden ser preparados por douncing 3-5 minutos (figura 1A</stro...

Se presenta un nuevo protocolo para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto adaptado al estudio de la regulación de los genes en las fibras musculares por inmunoprecipitación de cromatina.

Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar la cromatina a partir del músculo esquelético de un ratón adulto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la regulación génica y las fibras del músculo esquelético. La principal ventaja de esta técnica es que permite la preparación de cromatina de grado ChIP a partir de músculo esquelético de ratón.Un tejido físicamente resistente con un alto contenido de proteínas estructurales. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando buscábamos caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a la atrofia muscular por uso glucoarticulado, que requiere la identificación de receptores glucoarticulados, sitios de unión al ADN en las fibras del músculo esquelético del ratón. La demostración del procedimiento estará a cargo de Shilpy Joshi, un postdoctorado de nuestro laboratorio.Para comenzar este procedimiento, recupere los músculos de las extremidades posteriores congelados o recién disecados. Posteriormente, picar los músculos en un tubo de ensayo de dos mililitros, que contiene un mililitro de tampón hipotónico helado para una preparación homogénea de trozos pequeños, utilizando tijeras finas. Después, deje el tubo agitando en un agitador de sobremesa a cuatro grados centígrados durante cinco a 10 minutos.A continuación, transfiera el tejido diseccionado a un tubo de fondo redondo de 14 mililitros que contenga cuatro mililitros de tampón hipotónico frío. Homogeneizar el tejido picado, utilizando un homogeneizador mecánico de tejido durante 15 a 30 segundos. Después, transfiera el homogeneizado a un tubo de 15 mililitros.Agregue tampón hipotónico frío para obtener 10 mililitros de la muestra y fije el homogeneizado antes de continuar con el siguiente ratón. En este procedimiento, agregue formaldehído a la muestra para obtener una concentración final del 1%. Y luego agitar durante 10 minutos a temperatura ambiente.A continuación, agregue glicina para obtener una concentración final de 0,125 molar en cada tubo para detener la fijación. Y agite durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, homogeneice el lisado fijo, usando un dounce suelto.Luego, transfiéralo a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 1000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para obtener núcleos y desechos celulares. Después de cinco minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón hipotónico fresco. Filtre el lisado a través de un colador de células de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros.Con la ayuda de una punta de pipeta, lavar el filtro con un mililitro de tampón hipotónico frío. Después de eso, vuelva a filtrar el filtrado a través de un colador de celdas de 40 micrómetros. Posteriormente, transfiera el filtrado a un tubo de 15 mililitros.Y centrifugar a 1000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para obtener la pellet nuclear. Después de desechar el sobrenadante, use un mililitro de tampón hipotónico para agrupar los tres gránulos y transfiéralos a un tubo de 1,5 a dos mililitros. Centrifugar a 1000 g durante cinco minutos.A continuación, evalúe el volumen de la pelletización nuclear comparándola con tubos que contengan un volumen conocido de líquido y vuelva a suspenderla en un tampón de sonicación hasta tres o cuatro veces el volumen nuclear empaquetado. A continuación, sonique la suspensión durante 10 a 15 minutos a cuatro grados centígrados, utilizando un sonicador. Centrifugar la muestra sonicada y transferir el sobrenadante de cromatina a un tubo nuevo de 1,5 mililitros.Para desreticular, tome 30 microlitros de cromatina en un tubo de ensayo de 1,5 mililitros y agregue 20 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares y 450 microlitros de agua. Complete el volumen a 500 microlitros e incube a 65 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, realizar un tratamiento con un microlitro de Proteinasa K, 10 microlitros de dos tris molares a pH 6,8 y 10 microlitros de EDTA 0,5 molar durante una hora a 42 grados centígrados.Luego, realice una extracción regular de fenol-cloroformo cloroformo y precipite el ADN con un volumen de acetato de sodio y dos volúmenes de etanol al 100% durante una hora a 80 grados centígrados negativos o durante la noche a 20 grados centígrados negativos. A continuación, granule el ADN por centrifugación a 13.500 g durante 15 minutos. Decantar el sobrenadante y lavar bien el pellet con etanol frío al 70% y volver a centrifugar durante cinco minutos.A continuación, decantar el sobrenadante y secar al aire el pellet. Después de eso, vuelva a suspender el pellet en el volumen original de tampón tris HCl EDTA. Mida la concentración de ADN en un espectrofotómetro por absorbentes a 260 nanómetros, 280 nanómetros.Posteriormente, pipeteó de 500 a 1000 nanogramos de ADN junto con una escalera del tamaño de ADN en carriles separados de un gel de agarosa al 1,5%. Y realizar electroforesis para evaluar el tamaño del fragmento de la cromatina. Para optimizar, la homogeneización se realizó durante 15 segundos o 45 segundos a dos velocidades, 18.000 y 22.000 RPM.En todas las condiciones, los núcleos pudieron separarse de los restos de tejido, pero el rendimiento fue óptimo utilizando una velocidad más baja. Los núcleos también se pueden preparar dando vueltas durante tres a cinco minutos. Pero la homogeneización mecánica es el método de elección, ya que los rendimientos óptimos de los núcleos se pueden lograr en tan solo 15 segundos, lo que permite una importante ganancia de tiempo, especialmente si se deben procesar varias muestras.Con este protocolo, se pueden aislar hasta 2,7 veces 10 a los siete núcleos de 500 miligramos de tejido para generar 100 microgramos de cromatina. La cromatina preparada de esta manera da resultados limpios y de alta calidad en los experimentos de secuenciación de ChIP. Como lo ilustran los altos niveles de K27 acetilada de la histona H3 y la ARN polimerasa 2 en el locus de Desmond expresado muscularmente.La especificidad de la fibra muscular se muestra por una señal baja o ausente en los loci Pecam1 y Vcam1 que no se expresan en el músculo. Al intentar este procedimiento, es importante sumergir correctamente la sonda homogeneizadora en la muestra para evitar la formación de espuma, limpiar la sonda entre muestras y optimizar la fragmentación de la cromatina. La cromatina preparada de esta manera se ha utilizado con éxito por el bien de ChIP para mapear la ocupación del factor de transcripción en todo el genoma y también debería ser adecuada para las técnicas de captura de confirmación de cromatina.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para la investigación en el campo de la genómica, para explorar la regulación génica en el músculo esquelético de ratones. El procedimiento también se puede aplicar a músculo de rata y biopsias de pacientes humanos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la homogeneización mecánica, seguida de la purificación de núcleos fijados en formaldehído para preparar la cromatina del músculo esquelético para la inmunoprecipitación.No olvide que trabajar con formaldehído, fenol, cloroformo y proteinasa K puede ser peligroso. Se deben tomar precauciones como el uso de guantes y gafas. Los pasos que involucran estos reactivos deben realizarse bajo un capó.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

Demostramos una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para identificar las interacciones factor en genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de expresión génica en el tejido embrionario del ratón. Este protocolo debe ser ampliamente aplicable para el estudio de la activación de genes específicos de tejido, como ocurre durante el desarrollo embrionario normal.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Se describe un método robusto para la inmunoprecipitación de la cromatina utilizando células T primarias. El método se basa en los enfoques estándar, pero utiliza un conjunto específico de condiciones y reactivos que mejoran la eficiencia de unas cantidades limitadas de células. Es importante destacar que, se presenta una descripción detallada de la fase de análisis de datos.

Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

Este trabajo describe un protocolo para la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) utilizando una línea de células T de ratón madura. Este protocolo es adecuado para investigar la distribución de marcas de histonas específicas en sitios específicos del promotor o en todo el genoma.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón

Presentamos un protocolo basado en la filtración para aislar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético de ratón reticulado en el que eliminamos la necesidad de ultracentrifugación, haciéndolo fácilmente aplicable. Mostramos que la cromatina preparada a partir de los núcleos es adecuada para la inmunoprecipitación de la cromatina y probables estudios de secuenciación con inmunoprecipitación de la cromatina.

Un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina

Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) - una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.

Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

Aquí, describimos un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina de histonas modificadas de la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated ADN se utiliza posteriormente para PCR cuantitativa para interrogar la abundancia y localización de modificaciones post-traduccionales de las histonas por todo el genoma.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae

Aquí se describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina eficiente (ChIP), seguido por secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) de tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. Este protocolo es conveniente para el mapeo de modificaciones de las histonas e investigar localización de genoma no histona proteínas de interés en vivo.

Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

La inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética. Sin embargo, el método implica dificultades para obtener fragmentación de cromatina reproducible mediante cizallamiento mecánico. Aquí, proporcionamos un protocolo mejorado para un ensayo ChIP usando digestión enzimática.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

Este protocolo se centra en la preparación de cromatina a partir de tejidos congelados a presión y es adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina reticulada (X-ChIP) seguida de un análisis cuantitativo de PCR (X-ChIP-qPCR) o enfoques de secuenciación de próxima generación (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

Se presenta aquí un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón con aislamiento de células satélite de células satélite de células satélite de músculo de extremidades de ratón adaptado al estudio de la regulación de la transcripción en fibras musculares por escisión bajo dianas y liberación mediante nucleasa (CUT&amp;RUN).

Un protocolo eficiente para el análisis CUT&amp;RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

Los investigadores nuevos en el campo de la epigenética encontrarán en CUT&amp;Tag una alternativa significativamente más fácil que los ensayos ChIP. CUT&amp;Tag ha beneficiado enormemente a los estudios epigenéticos en poblaciones de células raras y primarias, generando datos de alta calidad a partir de muy pocas células. Este protocolo describe la realización de ensayos H3K4me1 CUT&amp;Tag en mioblastos de ratón aislados de músculos de las extremidades posteriores de ratón.

Uso del ensayo de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&#38;Tag) en la investigación de mioblastos de ratón

Aprende a preparar cromatina de calidad ChIP a partir de músculo esquelético de ratón adulto mediante homogeneización mecánica. Este protocolo optimizado facilita el estudio de la regulación génica y los mecanismos moleculares de la atrofia muscular.

Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

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