Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

El objetivo general de este procedimiento es preparar la cromatina a partir del músculo esquelético de un ratón adulto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la regulación génica y las fibras del músculo esquelético. La principal ventaja de esta técnica es que permite la preparación de cromatina de grado ChIP a partir de músculo esquelético de ratón.

Un tejido físicamente resistente con un alto contenido de proteínas estructurales. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando buscábamos caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a la atrofia muscular por uso glucoarticulado, que requiere la identificación de receptores glucoarticulados, sitios de unión al ADN en las fibras del músculo esquelético del ratón. La demostración del procedimiento estará a cargo de Shilpy Joshi, un postdoctorado de nuestro laboratorio.

Para comenzar este procedimiento, recupere los músculos de las extremidades posteriores congelados o recién disecados. Posteriormente, picar los músculos en un tubo de ensayo de dos mililitros, que contiene un mililitro de tampón hipotónico helado para una preparación homogénea de trozos pequeños, utilizando tijeras finas. Después, deje el tubo agitando en un agitador de sobremesa a cuatro grados centígrados durante cinco a 10 minutos.

A continuación, transfiera el tejido diseccionado a un tubo de fondo redondo de 14 mililitros que contenga cuatro mililitros de tampón hipotónico frío. Homogeneizar el tejido picado, utilizando un homogeneizador mecánico de tejido durante 15 a 30 segundos. Después, transfiera el homogeneizado a un tubo de 15 mililitros.

Agregue tampón hipotónico frío para obtener 10 mililitros de la muestra y fije el homogeneizado antes de continuar con el siguiente ratón. En este procedimiento, agregue formaldehído a la muestra para obtener una concentración final del 1%. Y luego agitar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue glicina para obtener una concentración final de 0,125 molar en cada tubo para detener la fijación. Y agite durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, homogeneice el lisado fijo, usando un dounce suelto.

Luego, transfiéralo a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 1000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para obtener núcleos y desechos celulares. Después de cinco minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón hipotónico fresco. Filtre el lisado a través de un colador de células de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros.

Con la ayuda de una punta de pipeta, lavar el filtro con un mililitro de tampón hipotónico frío. Después de eso, vuelva a filtrar el filtrado a través de un colador de celdas de 40 micrómetros. Posteriormente, transfiera el filtrado a un tubo de 15 mililitros.

Y centrifugar a 1000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para obtener la pellet nuclear. Después de desechar el sobrenadante, use un mililitro de tampón hipotónico para agrupar los tres gránulos y transfiéralos a un tubo de 1,5 a dos mililitros. Centrifugar a 1000 g durante cinco minutos.

A continuación, evalúe el volumen de la pelletización nuclear comparándola con tubos que contengan un volumen conocido de líquido y vuelva a suspenderla en un tampón de sonicación hasta tres o cuatro veces el volumen nuclear empaquetado. A continuación, sonique la suspensión durante 10 a 15 minutos a cuatro grados centígrados, utilizando un sonicador. Centrifugar la muestra sonicada y transferir el sobrenadante de cromatina a un tubo nuevo de 1,5 mililitros.

Para desreticular, tome 30 microlitros de cromatina en un tubo de ensayo de 1,5 mililitros y agregue 20 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares y 450 microlitros de agua. Complete el volumen a 500 microlitros e incube a 65 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, realizar un tratamiento con un microlitro de Proteinasa K, 10 microlitros de dos tris molares a pH 6,8 y 10 microlitros de EDTA 0,5 molar durante una hora a 42 grados centígrados.

Luego, realice una extracción regular de fenol-cloroformo cloroformo y precipite el ADN con un volumen de acetato de sodio y dos volúmenes de etanol al 100% durante una hora a 80 grados centígrados negativos o durante la noche a 20 grados centígrados negativos. A continuación, granule el ADN por centrifugación a 13.500 g durante 15 minutos. Decantar el sobrenadante y lavar bien el pellet con etanol frío al 70% y volver a centrifugar durante cinco minutos.

A continuación, decantar el sobrenadante y secar al aire el pellet. Después de eso, vuelva a suspender el pellet en el volumen original de tampón tris HCl EDTA. Mida la concentración de ADN en un espectrofotómetro por absorbentes a 260 nanómetros, 280 nanómetros.

Posteriormente, pipeteó de 500 a 1000 nanogramos de ADN junto con una escalera del tamaño de ADN en carriles separados de un gel de agarosa al 1,5%. Y realizar electroforesis para evaluar el tamaño del fragmento de la cromatina. Para optimizar, la homogeneización se realizó durante 15 segundos o 45 segundos a dos velocidades, 18.000 y 22.000 RPM.

En todas las condiciones, los núcleos pudieron separarse de los restos de tejido, pero el rendimiento fue óptimo utilizando una velocidad más baja. Los núcleos también se pueden preparar dando vueltas durante tres a cinco minutos. Pero la homogeneización mecánica es el método de elección, ya que los rendimientos óptimos de los núcleos se pueden lograr en tan solo 15 segundos, lo que permite una importante ganancia de tiempo, especialmente si se deben procesar varias muestras.

Con este protocolo, se pueden aislar hasta 2,7 veces 10 a los siete núcleos de 500 miligramos de tejido para generar 100 microgramos de cromatina. La cromatina preparada de esta manera da resultados limpios y de alta calidad en los experimentos de secuenciación de ChIP. Como lo ilustran los altos niveles de K27 acetilada de la histona H3 y la ARN polimerasa 2 en el locus de Desmond expresado muscularmente.

La especificidad de la fibra muscular se muestra por una señal baja o ausente en los loci Pecam1 y Vcam1 que no se expresan en el músculo. Al intentar este procedimiento, es importante sumergir correctamente la sonda homogeneizadora en la muestra para evitar la formación de espuma, limpiar la sonda entre muestras y optimizar la fragmentación de la cromatina. La cromatina preparada de esta manera se ha utilizado con éxito por el bien de ChIP para mapear la ocupación del factor de transcripción en todo el genoma y también debería ser adecuada para las técnicas de captura de confirmación de cromatina.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para la investigación en el campo de la genómica, para explorar la regulación génica en el músculo esquelético de ratones. El procedimiento también se puede aplicar a músculo de rata y biopsias de pacientes humanos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la homogeneización mecánica, seguida de la purificación de núcleos fijados en formaldehído para preparar la cromatina del músculo esquelético para la inmunoprecipitación.

No olvide que trabajar con formaldehído, fenol, cloroformo y proteinasa K puede ser peligroso. Se deben tomar precauciones como el uso de guantes y gafas. Los pasos que involucran estos reactivos deben realizarse bajo un capó.