El efecto del estrés osmótico en vesículas secretoras y exocitosis de monitoreo

El objetivo general de esta metodología analítica combinada es proporcionar información sobre cómo las vesículas secretoras en las células responden a una fuerza física, como la presión osmótica extracelular, y cómo los ajustes de estos orgánulos afectan aún más el proceso de exocitosis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como por ejemplo, ¿cómo responden directamente las vesículas secretoras a los cambios en el entorno extracelular o al tratamiento farmacológico? La principal ventaja de este enfoque es monitorizar los efectos directos sobre el contenido vesicular de las células vivas y saber distinguir la alteración en su liberación de reh-chemical-ed antes y después de tratar la exocitosis.

Para obtener una superficie de electrodo de disco plano, coloque el electrodo en el soporte de una microamoladora y bisele cada electrodo de fibra de carbono en un ángulo de 45 grados. Luego, marque el capilar para referencia futura de cómo ubicar la superficie del electrodo de disco en un ángulo de 45 grados al colocar el electrodo cerca de las celdas para la medición de exocitosis. Para realizar el registro amperométrico en celdas individuales, monte el microelectrodo de disco de fibra de carbono recién biselado y probado en el portaelectrodos de la etapa principal que se utiliza con un potenciostato.

Antes de usar, coloque cada microelectrodo de fibra de carbono en una solución de prueba para monitorear la corriente del estado de estudio mediante voltamperometría cíclica. Para un escaneo de voltamperometría cíclica, aplique una forma de onda de potencial triangular de 0,2 voltios negativos a 0,8 voltios positivos contra un electrodo de referencia de cloruro de plata-plata a 100 milivoltios por segundo para garantizar una buena cinética de reacción. Para el registro de la exocitosis por amperometría, coloque la placa de Petri con células cromafines cultivadas en tampón isotónico en un microscopio invertido en una jaula de Faraday.

Utilice una etapa de calentamiento de microscopio para mantener una temperatura de 37 grados centígrados durante los experimentos con células. A continuación, utilice un instrumento de pinza de parche de bajo ruido para aplicar un potencial constante de 700 milivoltios positivos en el electrodo de trabajo. Para registrar la exocitosis de las células cromafines, digitalice la señal a 10 kilohercios y aplique un filtro Bessel interno de paso bajo a dos kilohercios para filtrar la señal registrada.

Tenga en cuenta que el electrodo de disco ovalado debe colocarse plano sobre las celdas y paralelo a la superficie de la placa de Petri. Además, los electrodos se biselan el mismo día que los experimentos para garantizar una superficie limpia del electrodo. Para estimular la exocitosis celular, coloque una micropipeta de vidrio llena de una solución de cloruro de bario de cinco milimolares a una distancia de al menos 20 micrómetros de la célula.

Luego, aplique un pulso de inyección de cinco milimolares de solución de cloruro de bario en la superficie de la célula para estimular la exocitosis celular. Coloque la pipeta de vástago en la solución y estimule la exocitosis celular aplicando un pulso de inyección de bario mientras registra los transitorios de corriente amperométrica durante aproximadamente tres minutos. Para comparar las respuestas exocitóticas en condiciones isotónicas con las hipertónicas, incubar las células durante 10 minutos en una solución tampón hipertónica.

A continuación, aplique un pulso de inyección de bario para estimular la exocitosis y realice tres minutos de registro amperométrico. Para obtener una respuesta reversible de las células, vuelva a incubar las células durante 10 minutos en una solución tampón isotónica. Estimular las células mediante la aplicación de un pulso de inyección de bario y realizar tres minutos de registro de la respuesta exocitótica.

Para fabricar los electrodos para mediciones de tamaño cuántico vesicular, prepare un electrodo de fibra de carbono con un diámetro de cinco micrómetros. Bajo un microscopio, use un bisturí para cortar la fibra de carbono que se extiende fuera de la punta del vidrio para que solo queden de 30 a 100 micrómetros. Use una llama de butano para preparar una punta grabada con llama del electrodo de fibra de carbono.

Para lograr una punta de electrodo de forma cilíndrica grabada uniformemente, sostenga el electrodo de fibra de carbono de forma cilíndrica mientras lo gira. Y coloque la fibra de carbono que se extiende desde el vidrio hasta el borde azul de la llama de butano hasta que la punta del carbono desarrolle un color rojo. Después del grabado con llama, coloque el electrodo bajo un microscopio para evaluar la punta del electrodo.

El tamaño de la punta del electrodo grabado debe tener entre 50 y 100 nanómetros de diámetro. A continuación, inserte el microelectrodo cilíndrico de nanopunta en la solución epoxi durante tres minutos, seguido de una inmersión de 15 segundos de la punta del electrodo en la solución de acetona. Esto permite que el epoxi selle el espacio de espacio potencial entre la fibra de carbono y la pared capilar de gas aislante.

Mientras que la acetona limpia el epoxi de la superficie del electrodo de fibra de carbono grabada. Para curar el epoxi, hornee los electrodos en un horno durante la noche a 100 grados centígrados. Antes de usar, pruebe la corriente de estado estacionario de cada microelectrodo de fibra de carbono utilizando voltamperometría cíclica.

Para los experimentos, use solo electrodos que muestren una corriente de meseta de alrededor de 1,5 a 2,5 nanoamperios. Para las mediciones de amperometría intracelular, coloque las células bajo el microscopio y utilice los mismos ajustes experimentales del potenciostato. Prevenir daños físicos significativos a la célula.

Inserte el microelectrodo cilíndrico nanotip en la celda agregando una fuerza mecánica suave. Lo suficiente para empujar el electrodo a través de la membrana plasmática de la célula y dentro del citoplasma de la célula mediante un micromanipulador. Después de la inserción, y con la membrana celular sellada alrededor del electrodo cilíndrico, inicie el registro amperométrico in-situ en la celda viva.

Al potencial de oxidación aplicado al electrodo, las vesículas se adsorben a la superficie del electrodo y se rompen estocásticamente. Por lo tanto, no hay necesidad de ningún tipo de estímulo para iniciar este proceso. Para determinar el efecto osmótico sobre el tamaño cuántico vesicular, recoja las mediciones de citometría intracelular de un grupo de células que han sido incubadas en tampón isotónico e hipertónico utilizando la condición experimental.

El efecto de la osmolalidad extracelular sobre la actividad de la exocitosis se presenta como la frecuencia de eventos de exocitosis cuando las células cromafines se estimulan con una solución de bario en condiciones isotónicas, luego hipertónicas y finalmente en isotónicas. Estos datos muestran una inhibición en la actividad de exocitosis en las células que experimentan estrés osmótico y se puede lograr una recuperación parcial después de que las células regresen a un entorno isotónico. El experimento de control muestra la frecuencia de eventos de exocitosis después de tres estimulaciones consecutivas de bario en células cromafines en condiciones isotónicas.

Esto demuestra que la estimulación múltiple con bario dentro del marco de tiempo utilizado en estos experimentos está causando una reducción en la actividad de la exocitosis por estimulación celular consecutiva. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar estos métodos analíticos complementarios que le permiten comparar cómo las vesículas secretoras y el proceso de exocitosis se ven afectados por las alteraciones en el entorno extracelular.