In Vitro Medición de la enzima a prueba chaperonas farmacológicas respuesta de Fabry y la enfermedad de Pompe

Existe una demanda para hacer clínico pruebas de una nueva clase de fármacos "huérfanos" llamadas chaperonas farmacológicas reproducible, rápida y eficiente. Desarrollamos un análisis basado en la cultura de célula simple, altamente estandarizados y versátil a pantalla para pacientes elegibles así como chaperonas farmacológicas novela drogas.

El objetivo general de este protocolo de cultivo celular modificado es proporcionar una evaluación fenotípica rápida de la varianza alélica en la enfermedad de Fabry y Pompe. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades de depósito lisosomal, como los resultados pronósticos y las decisiones terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente reproducible y que puede ayudar en el desarrollo de nuevos fármacos, como las farmacochaperonas.

Para llevar a cabo la mutagénesis dirigida al sitio, comience utilizando las secuencias de referencia NM 00169.2 y NM 00152.4 como plantillas para la mutagénesis de los genes GLA y GAA, respectivamente. Utilice la herramienta gratuita Diseño de imprimación para respaldar el diseño de imprimación. A continuación, se hace sintetizar un conjunto de cebadores de alta pureza y sin sal por un proveedor comercial, con cebadores de sentido y antisentido que llevan una de las respectivas modificaciones de secuencia, en función de su longitud, para introducir individualmente la mutación.

Prepare la mezcla de reacción en un volumen de 50 microlitros y ejecute el programa de PCR utilizando las condiciones estándar proporcionadas por el fabricante y enumeradas en el protocolo de texto. Después de la PCR, agregue un microlitro de la enzima de restricción Dpn1 y continúe incubando los viales de reacción a 37 grados Celsius durante una hora. Después de transformar el ADN plasmático en células E. coli competentes y preparar plásmidos de la transformancia deseada de acuerdo con el protocolo de texto, utilice una herramienta de biología molecular adecuada para analizar la secuencia.

Cuando se detecta la mutación deseada y no se observa ninguna otra anomalía en la secuencia en comparación con NM 000169.2 para la alfa-galactosidasa A o NM 000152.4 para la alfa-galactosidasa ácida, seleccione el clon para la purificación del plásmido de grado de transfección. Determine la pureza del ADN midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro. Después del cultivo de HEK293H células en un matraz de cultivo T75 según el protocolo de texto, 24 horas antes de la transfección, use PBS sin calcio o magnesio para lavar las células una vez.

Con 0,05% de tripsina-EDTA, coseche las células y en las cavidades de una placa de cultivo de 24 pocillos use 500 microlitros de DMEM suplementado con 10% de FBS para sembrar 1,5 veces 10 a las cinco células. Realice la transfección celular de acuerdo con el manual del fabricante. Utilizando una mezcla de un microgramo de ADN plasmídico disuelto en 100 microlitros de DMEM sin suero y 2,5 microlitros de reactivo de transfección.

Incube la solución durante 20 minutos a temperatura ambiente, luego agréguela a las celdas gota a gota. Después de un período de cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% de CO2, retire el medio que contiene el reactivo de transfección y agregue 500 microlitros de DMEM fresco con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Como opción durante este paso, agregue DGJ o DNJ al medio de cultivo donde se desee.

El día de la cosecha, retire las células de la incubadora. Luego aspire el medio y use PBS con calcio y magnesio para lavar cuidadosamente las células dos veces. Este paso es crítico porque DGJ y DNJ son inhibidores de ambas enzimas y, por lo tanto, cualquier resto invalidaría la prueba.

Después del lavado, agregue 200 microlitros de agua desionizada directamente sobre las celdas. A continuación, enjuague las células de la placa y transfiéralas a un tubo de reacción de 1,5 mililitros. Coloque las muestras en una rejilla de espuma adecuada y vértelalas durante cinco segundos para que la lisis sea más eficiente.

A continuación, alterne las muestras entre nitrógeno líquido durante 10 segundos y un baño de agua a temperatura ambiente hasta que se complete la descongelación. Después de repetir el procedimiento de homogeneización cinco veces, centrifugar las muestras durante cinco minutos a 10.000 g. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de reacción.

Para llevar a cabo el ensayo de BCA, prepare un tubo nuevo para cada muestra que contenga 40 microlitros de H20 desionizado y agregue 10 microlitros de muestra. Mezcle cada solución mediante un breve vórtice y transfiera 10 microlitros de cada muestra por triplicado a las cavidades de una placa de 96 pocillos. Para preparar una curva estándar, diluya una solución madre de BSA de 2 miligramos por mililitro y H2O desionizado de acuerdo con el protocolo de texto.

Después de combinar el reactivo A y el reactivo B, inicie la reacción añadiendo 200 microlitros de la solución de reactivo BCA e incube las muestras en la oscuridad a 37 grados centígrados y 300 rpm en un agitador orbital durante una hora. A continuación, mida la absorbancia a 560 nanómetros en un lector de placas. Las muestras suelen contener entre uno y 1,5 microgramos de proteína por microlitro.

Diluir la cantidad calculada de cada muestra y pipetearla en tubos de reacción nuevos de 1,5 mililitros para obtener 0,05 microgramos de alfa-galactosidasa A o 0,5 microgramos de alfa-glucosidasa ácida por microlitro de solución. Vuelva a vorexear las muestras durante cinco segundos y pipetee 10 microlitros de esta dilución por duplicado en una placa de 96 pocillos. Inicie las reacciones agregando 20 microlitros de la solución de sustrato respectiva.

Para la alfa-galactosidasa A, agregue dos milimolares de 4-metilumbeliferol alfa-D galactopiranósido, o 4-MU-gal, en tampón de fosfato-citrato 0.06 molar, pH 4.7. Para la alfa-glucosidasa ácida, agregue 2 milimolares de glucopiranósido 4-metilumbeliferol alfa-D, o 4-MU-glu, en acetato de sodio 0,025 molar, pH 4,0. Incubar las reacciones enzimáticas durante una hora en la oscuridad a 37 grados centígrados y 300 rpm en un agitador orbital.

A continuación, finalice la reacción añadiendo 200 microlitros de tampón de hidróxido de sodio de glicina ajustado a 1,0 pH molar 10,5. Prepare una curva estándar de 4-MU a partir de un stock de 0,01 miligramos por mililitro de acuerdo con el protocolo de texto y pipetee 10 microlitros de las soluciones por duplicado en una placa de 96 pocillos. Agregue 200 microlitros del tampón de hidróxido de sodio de glicina 1.0 molar a cada pocillo para ajustar el volumen y el pH.

Finalmente, mida la actividad enzimática en un lector de florescencia equipado con el juego de filtros adecuado. Y analizar los datos utilizando el software adecuado para el dispositivo lector de fluorescencia. Para evaluar la eficiencia de la mutagénesis del gen GLA, las mutaciones se clasificaron en tres categorías y revelaron que alrededor del 66,5% se obtuvieron en el primer intento.

Un 25% adicional podría obtenerse después de una segunda PCR ligeramente modificada. En la categoría tres, se tuvieron que realizar más esfuerzos, como el rediseño de la imprimación, para obtener el clon deseado. Esta tabla se refiere a los resultados de la medición de la actividad enzimática para tres mutaciones de la alfa-galactosidasa A y tres mutaciones de la alfa-glucosidasa ácida que no se trataron o se trataron con DGJ y DNJ.

Los datos se muestran como valores absolutos para el recambio de sustrato y tienen valores relativos normalizados a la enzima de tipo salvaje. Los datos de actividad enzimática absoluta se corrigieron para la actividad enzimática endógena de las células HEK293H utilizando células transfectadas con un vector vacío de pcDNA 3.1. Los valores de actividad enzimática se normalizaron a la enzima de tipo salvaje de los experimentos correspondientes, lo que explica la desviación de los valores relativos entre los diferentes mutantes.

Una vez dominada, la fracción posterior al cultivo celular de este experimento, que representa la mayor parte del tiempo de práctica, se puede realizar en cuatro horas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades de almacenamiento lisosomal exploraran las correlaciones genotipo-fenotipo en la enfermedad de Fabry y Pompe. Este protocolo puede ayudar en el desarrollo de nuevos fármacos en enfermedades de almacenamiento lisosomal.