Name: In Vitro Medición de la enzima a prueba chaperonas farmacológicas respuesta de Fabry y la enfermedad de Pompe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprende a evaluar la varianza alélica en enfermedades de Fabry y Pompe mediante un ensayo celular reproducible. Este método acelera el desarrollo de chaperonas farmacológicas para enfermedades de almacenamiento lisosomal.

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Los autores desean reconocer la Loebert Mandy y Tina Czajka excelente soporte técnico. Agradecemos Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) lengua ayuda de edición.

1. preparación del mutante pcDNA3.1/GLA y pcDNA3.1/GAA construcciones
Nota: Las estrategias de clonación de GLA y GAA codificación secuencias (cds) han sido reportados de15,anterior18.
<ol>
	<li>Mutagénesis sitio-dirigida mediante mutagénesis sitio-dirigida
	<ol>
		<li>Uso la referencia de las secuencias NM_000169.2 y NM_000152.4 como plantillas para la mutagénesis de los genes GLA y GAA , respectivamente. Tienen un conjunto de sal iniciadores libres de alta pureza (25-37-mers) sintetizada por un proveedor comercial, con iniciadores sentido y antisentido llevando una de las modificaciones de la secuencia respectiva central a su longitud para presentar individualmente la mutación. Utilice la herramienta de diseño de la cartilla libre para apoyar el primer diseño19.</li>
		<li>Para la mezcla de reacción, uso las condiciones estándar para la solución de reacción y condiciones PCR suministradas por el fabricante.<ol>
			<li>Mezcla 5 μl de 10 x buffer de reacción, 10 ng de plásmido de plantilla doble cadena DNA pcDNA3.1/GLA o pcDNA3.1/GAA, 125 ng de cada primer, 1 μl de la mezcla de dNTP proporcionado, 3 μl de reactivo de DMSO en un volumen adecuado de agua desionizada (volumen de reacción final : 50 ΜL). Por último, añadir 2,5 U de ADN polimerasa y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Como control negativo, llevan a lo largo de una muestra no-primer.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Iniciar la polimerización en cadena usando el siguiente programa: paso 1: 95 ° C por 1 min, paso 2: 95 ° C durante 50 s, paso 3: 60 ° C durante 50 s, paso 4: 68 ° C durante 8 min, repita el paso 2-4 18 veces y paso 5: 68 ° C durante 10 minutos.<ol>
			<li>Tras la PCR, añadir 1 μl de la DpnI enzima de la restricción (10 U/μL) y más Incube el frasco de reacción a 37 ° C durante 1 hora.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transformación y proyección para el clon deseado
	<ol>
		<li>Transformar una alícuota de células ultracompetent con arreglo a las recomendaciones del fabricante. Medio SOC de uso (triptona 2% (w/v), levadura Extracto de 0.5% (p/v), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, esterilizar a 121 ° C y luego agregar soluciones de filtrado estéril de MgCl2 y glucosa hasta concentraciones finales de 10 y 20 mM, respectivamente) en lugar del fabricante medio. Después del procedimiento, placa 250 μl de la mutagénesis de muestra en un LB de la placa que contiene ampicilina 100 de μg/mL e incubar a 37 ° C por 18 h.</li>
		<li>Asegurar que el número de transformantes es &#62; 10 y la reacción produce al menos tres veces más colonias como la reacción no-primer control, por ejemplo, usando una placa luminosa para facilitar conteo de colonias. Luego escoger 3 colonias y preparar 3 mL culturas durante la noche en medio LB caldo.</li>
		<li>Al día siguiente, llevar a cabo la preparación de plásmido con un kit estándar y analizar toda la secuencia utilizando T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) y cartillas de BGHr (TCG CAG AGG-3ʹ del GCA 5ʹ-TAG de AAG) vía estándar Sanger secuenciación.</li>
		<li>Utilice una herramienta de biología molecular adecuado para analizar la secuencia. Cuando se detecta la mutación deseada y no más la secuencia de anormalidad en comparación con el NM_000169.2 (α-galactosidasa A) o NM_000152.4 (α-glucosidasa ácida) aparece, seleccione el clon para la purificación del plásmido transfección-grado.</li>
		<li>Determine la pureza de la DNA midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro. Nota: Deje que sólo los preparados que producen una pureza de plásmido con una relación de absorbancia 260/280 de &#62; experimentos de la cultura de 1.8 para la célula.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. cultivo de células de HEK293H
<ol>
	<li>Mantener las células de la HEK293H en glucosa alta (4,5 g/L) Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina. Mantener las células una incubadora a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO2 de water-jacket.</li>
	<li>Cultivar las células a una densidad de 80-90%.</li>
	<li>Aspire el medio y lavar una vez utilizando fosfato tampón salino (PBS) sin Ca2 + y Mg2 +.</li>
	<li>Paso mediante la adición de 0.05% tripsina-EDTA e incubar 5 min a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>Dividir las células 1:15 en medio fresco y semilla en un frasco de T75 nueva para mantener la cultura permanente. No utilice las células con más de 25 pasos.</li>
</ol>
3. pcDNA3.1/GLA y pcDNA3.1/GAA transfección del plásmido y tratamiento de HEK293H
<ol>
	<li>24 h antes de la transfección, lave las células HEK293H en un frasco de cultivo celular T75 una vez con PBS con Ca2 +, Mg2 +. Cosecha de las células con el 0,05% tripsina-EDTA como indicado arriba y semilla 1.5 x 105 células en las cavidades de una placa de 24 bien cultura con 500 μl DMEM suplementado con 10% SBF sin antibióticos.</li>
	<li>Llevar a cabo un protocolo de la transfección según el manual del fabricante. Normalmente, utilizar una mezcla de 1 μg de DNA plasmídico y 2,5 μl de reactivo de transfección en 100 μl de DMEM libre de suero. Incubar por 20 min a temperatura ambiente y agregar a las células de una manera drop-wise después de eso.</li>
	<li>Retire el medio que contiene el reactivo de transfección después de un período de 4 h a 37 °C/5% CO2 y agregar 500 μl de DMEM fresco con 10% FBS / 1% de penicilina/estreptomicina. Nota: Durante este paso, clorhidrato de 1-Deoxygalactonojirimycin (DGJ) o clorhidrato de 1-Desoxinojirimicina (DNJ) puede ser añadido al medio de cultivo donde la intención (utilizar una solución acuosa de 10 mM para obtener una concentración final de 20 μm DGJ y DNJ ). 42 h se agregó fresco DGJ o DNJ después de transfección del plásmido.</li>
</ol>
4. la célula cosecha y α-galactosidasa A o medición de la actividad de α-glucosidasa ácida
<ol>
	<li>Cosecha de células
	<ol>
		<li>En el día de la cosecha, eliminar las células de la incubadora y aspirar el medio. Lave cuidadosamente las células 2 veces con PBS con Ca2 + y Mg2 +. Nota: Este paso es fundamental porque DGJ y DNJ son potentes inhibidores de la α-galactosidasa y α-glucosidasa, respectivamente, y ninguna sobra invalidaría la prueba.</li>
		<li>Añadir 200 μL de agua desionizada directamente sobre las células. Enjuague las células de la placa y transferirlas a un tubo de reacción de 1,5 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogeneización por congelación y descongelación
	<ol>
		<li>Poner las muestras en un bastidor espuma adecuada y vortex durante 5 s para hacer más eficiente la lisis. Poner las muestras que se alternan en nitrógeno líquido durante 10 s y en un baño de temperatura ambiente hasta la descongelación completa (5 min).</li>
		<li>Repetir este procedimiento 5 veces y luego centrifugar las muestras durante 5 min a 10.000 x g.</li></ol></li></ol>Conservar el sobrenadante y pipeta en un tubo de reacción nueva.
	
	
	<li>Determinación de la concentración de proteína usando análisis de bicinchoninic ácido (BCA)
	<ol>
		<li>Preparar un fresco tubo para cada muestra con 40 μl de desionizada H2O y añadir 10 μl de muestra. Mezcle la solución con un vórtex brevemente y transferir 10 μL en una cavidad de una placa bien 96 (cada muestra por triplicado). Diluir una solución stock de albúmina de suero bovino (BSA) de 2 mg/mL en desionizada de H2O como se indica a continuación para obtener una curva estándar: 50 μl de H2O/50 μl BSA; 60 μL H2O/40 μl BSA; 70 μl H2O/30 μL BSA; 80 μl H2O/20 μl BSA; 90 μl H2O/10 μl BSA; 100 μl de H2O.</li>
		<li>Iniciar la reacción mediante la adición de 200 μL de reactivo BCA (reactivo A y reactivo B mezclan en una proporción de 50: 1) e incubar durante 1 h en la oscuridad a 37 ° C bajo agitación leve en un agitador orbital (300 rpm). Medir la absorbancia a 560 nm en un lector de placas. Nota: Las muestras contienen típicamente entre 1 y 1,5 μg de proteína por μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Medición de la actividad de enzimas con los sustratos artificiales 4-Methylumbelliferyl (4-MUG)
	<ol>
		<li>Diluir la cantidad calculada de cada muestra y pipetear en tubos de reacción de 1,5 mL fresco para obtener 0.05 (para α-galactosidasa A) o 0.5 (para α-glucosidasa ácida) μg proteína/μl soluciones. Vórtice de las muestras por 5 s otra vez y pipetee 10 μl de esta dilución en un 96 placa bien (cada muestra).</li>
		<li>Iniciar la reacción añadiendo 20 μl de la solución sustrato respectivo: De α-galactosidasa A: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopiranosida (4-MU-gal) en 0,06 M de tampón citrato fosfato, pH 4.7. Para el ácido α-glucosidasa: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) en acetato de sodio de 0,025 M de pH 4.0.</li>
		<li>Incubar las reacciones enzimáticas para 1 h en la oscuridad a 37 ° C bajo agitación leve en un agitador orbital (300 rpm). Terminar la reacción por la adición de 200 μL de tampón de glicina-NaOH ajustado pH 10.5 de 1,0 M.</li>
		<li>Preparar una curva estándar de 4-methylumbelliferone (4-MU) de un stock de 0,01 mg/mL como sigue: 100 μl de H2O / no 4-MU; 80 μl de H2O 20 μl 4-MU; 60 μL de H2O 40 μl 4-MU; 40 μl de H2O / 60 μL 4-MU; 20 μl de H2O / 80 μl 4-MU; no de H2O 100 μl 4-MU, pipetee 10 μl de cada dilución en el 96 pozo de la placa (por duplicado) y añada 200 μL del buffer de glicina-NaOH de 1,0 M a cada pocillo para ajustar el volumen y el pH.</li>
		<li>Medida la actividad enzimática en un lector de fluorescencia equipado con el sistema de filtro apropiado y analizar los datos utilizando el software apropiado para el dispositivo de lector de fluorescencia. Nota: Ambos sustratos 4 taza se reducen a 4 MU durante la exposición a la α-galactosidasa A o α-glucosidasa ácida. Publicado 4-MU es un fluorocromo, que puede ser medida en 360 y 465 nm como las longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente, usando un lector de fluorescencia de microplacas.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Cardiff University. , 
 <a target="_blank" href="http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.">http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.</a> (2017).</li>
<li>Meiji Pharmaceutical University. , <a target="_blank" href="http://fabry-database.org">http://fabry-database.org</a> (2017).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

El protocolo descrito en el presente documento ofrece resultados robustos para la evaluación de daños de la enzima en enfermedades lisosomales hereditarias del metabolismo. Este manuscrito es que una enmienda al protocolo publicado anterior15. Las modificaciones más importantes implican rigor (es decir, en el proceso de preparación de construcción de vector mutante), normalización del Protocolo de la cultura de célula (es decir, las condiciones de mantenimiento y transfección de ...

Hay más de una docena trastornos de lysosomal del almacenaje (LSDs) relacionados con la disfunción glucosidasa como resultado de mutaciones en el gen primario. Fabry (OMIM #301500) y la enfermedad de Pompe (OMIM #232300), más de 500 y 200 mutaciones sin sentido ha informado de1,2,3 , respectivamente, que corresponde a cerca del 60% de la cuenta total mutación. Numerosas nuevas variantes de genes todavía están siendo identificadas, muchos de los cuales tienen desconocido significado. Estudios bioquímicos revelaron que ciertos genotipos no conducen a una pérdida de función completa del gen GLA (OMIM * 300644) en la enfermedad de Fabry, pero hacer que la enzima correspondiente para no llegar a un estado plegado termodinámicamente favorecido4 . Esto resulta en retención de ER y degradación prematura de la enzima funcional de lo contrario. Conclusiones similares han sido elaborados en otras LSDs como Pompe enfermedad5. Por otra parte, la caracterización molecular de las variantes de la enzima puede facilitar la interpretación clínica de las mutaciones en el momento del diagnóstico6, sugiriendo que la progresión de la LSD es un proceso individual basado en la naturaleza de la mutación. Por lo tanto, la clasificación convencional en diferentes tipos clínicos típicamente de 2 a 3 debe ser reevaluada para optimizar el asesoramiento clínico y decisiones terapéuticas.
La terapia de reemplazo de la enzima (ERT) está disponible para ambas enfermedades. ERT, sin embargo, ha limitado eficacia en tejidos/órganos afectados como cerebro y músculo esquelético. Además, ERT puede provocar una respuesta inmunogénica que ponga en peligro sus beneficios terapéuticos. Chaperonas farmacológicas (PC) son una alternativa de tratamiento atractiva para los pacientes con mutaciones sensibles supuestos. PC sirve como un andamio molecular para el plegamiento de la proteína correcta y estabilización que a su vez impide la retención del retículo endoplásmico (ER) y ER-asociados de degradación de la enzima. Además, el PC puede administrarse por vía oral y es potencialmente capaces de cruzar la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, la PCT puede ser una opción más viable para el tratamiento de pacientes con ciertos genotipos. Una extensa revisión sobre la aplicación de PC en LSDs, consulte la excelente revisión por Parenti7.
El descubrimiento de cientos de enfermedades que causan alelos del mutante desafía a pruebas de drogas clínico previo y requiere una evaluación sencilla, rápida y altamente estandarizada de pacientes susceptibles de un enfoque de la medicina personalizada. Con el fin de evaluar los efectos perjudiciales de las mutaciones de gene de LSD y probar mutaciones del candidato para predecir a pacientes susceptibles para el PCT, era un sistema altamente estandarizados sobreexpresión en células HEK293H que permite la medición de la actividad enzimática rápida y fiable desarrollado. Sistemas de expresión similares se han descrito previamente para la enfermedad de Fabry y Pompe con COS-78,9,10,11, HeLa células12o HEK29313 ,14,15,16 células para el gen de la glucosidasa.
Un método muy similar incluso ha sido patentado como "Método para predecir la respuesta al tratamiento farmacológico acompañante de enfermedades"17 que indica la relevancia de una célula sistema capaz de integrarse a la práctica clínica de la cultura.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit&nbsp;</td><td>Stratagene, La Jolla, CA, USA</td><td>#200522</td><td></td></tr><tr><td>Primer GLA[R301Q]-frw: 5&agudo;- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[R301Q]-rev: 5&agudo;- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&agudo;-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-rev: 5&acute;-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&agudo;-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A143T]-rev: 5&acute;-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-frw: 5&agudo;-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-rev: 5&acute;-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-frw: 5&acute;-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&agudo;-CCA ACC ACC AGC ACG TAG GGT G-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[L552P]-frw: 5&agudo;-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&agudo;-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>T7: 5&agudo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3&agudo;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>BGHrev: 5&acute;-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemania</td><td>n.a.Triptona</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>103.753</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1.064.041.000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1.049.360.500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x 6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1.058.330.250</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Glucosa monohidrato</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1.083.422.500</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1.064.980.500</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>3908.2</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>X863.3</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato disódico</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1.065.860.500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1.062.640.050</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma Aldrich, Múnich, Alemania</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB Medio</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmido</td><td>Zyppy ZymoResearch, Friburgo, Alemania</td><td>D4020</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Kit midi de plásmido</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>12245</td><td></td></tr><tr><td>línea celular de HEK293H</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Alemania</td><td>11631-017&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&agudo; s Águila Modificada Medium&nbsp;</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Alemania</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>HyClone suero fetal bovino&nbsp;</td><td>GE Healthcare, South Logan, Utah, EE. UU.</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Alemania</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular estándar CELLSTAR, Greiner Bio One</td><td>VWR International GmbH, Hannover, Alemania</td><td>82050-854</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular (24 pocillos)</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>831.836</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos Cellstar</td><td>Greiner bio one, Frickenhausen, Alemania</td><td>655185</td><td></td></tr><tr><td>tubos de reacción SafeSeal, 1,5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Alemania</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de 1-desoxigalactonojirimicina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, Múnich, Alemania</td><td>D9641</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de 1-desoxigalactonojirimicina&nbsp;</td><td>Toronto Research Chemicals, Toronto, Canadá</td><td>D236500</td><td></td></tr><tr><td>1-Desoxinojirimicina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, Múnich, Alemania</td><td>D9305</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco sin calcio, sin magnesio</td><td>Biochrom, Berlín, Alemania</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo de fenol</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Alemania</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Alemania</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>4-metilobelifelona</td><td>Sigma Aldrich, Múnich, Alemania</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilumbeliferilo &alfa;-D-galactopiranósido</td><td>Sigma Aldrich, Múnich, Alemania</td><td>M7633</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilumbeliferol &alfa;-D-glucopiranósido</td><td>Sigma Aldrich, Múnich, Alemania</td><td>M9766</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo </td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubadora tipo T6</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Alemania</td><td>n.a.Placa</td><td></td></tr> <tr><td>luminosa Gr. 2 E</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>P265.1</td><td></td></tr><tr><td>3130 xl Analizador genético&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania</td><td>n.a.GFL-3032</td><td></td></tr> <tr><td>agitador bacteriano</td><td>GFL, Burgwedel, Alemania&nbsp;</td><td>n.a.Centrífuga</td><td></td></tr> <tr><td>Avanti J-25</td><td>Beckman/Coulter, Krefeld, Alemania</td><td>n.a.Ultraspec</td><td></td></tr> <tr><td>3100 pro Espectrofotómetro</td><td>Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido</td><td>n.a.incubadora</td><td></td></tr> <tr><td>con camisa de agua&nbsp;</td><td>Binder, Tuttlingen, Alemania</td><td>n.a.Mezclador</td><td></td></tr> <tr><td>táctil Vortex Genie 1</td><td>Scientific Industries, Bohemia, NY, EE. UU</td>. <td>N.A.Z</td><td></td></tr> <tr><td>233 MK-2 centrífuga microtubular refrigerada</td><td>Hermle, Tuttlingen, Alemania&nbsp;</td><td>n.a.LaboStar</td><td></td></tr> <tr><td>dispositivo de agua ultrapura</td><td>Siemens, Berlín, Alemania</td><td>n.a.Thermo</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker PST-60HL-4 agitador orbital</td><td>Biosan, Riga, Letonia</td><td>n.a.Tecan</td><td></td></tr> <tr><td>GENios Reader</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf, Suiza</td><td>n.a.HI</td><td></td></tr> <tr><td>223 Medidor de pH con microprocesador</td><td>HANNA Instruments, Arvore, Portugal</td><td>n.a.CASY</td><td></td></tr><<tr><td>br/> Sistema de Contador de Células + Analizador Modelo TT</td><td>Innovatis AG, Cham/Zug, Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magellan software de análisis de datos v6.6</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf, Suiza</td><td>n.a.GraphPad</td><td></td></tr> <tr><td>Prism 5.04</td><td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; EE.UU</td><td>. n.a.Microsoft</td><td></td></tr> <tr><td>Office 2010</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, EE.UU</td><td>. n.a.BioEdit</td><td></td></tr> <tr><td>Alignment Editor, V7.0.1</td><td>http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html</td><td>n.a.<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Abreviaturas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>frw = adelante; rev = reverso</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>n.a. = no aplicable</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro medición de la enzima a prueba chaperonas farmacológicas respuesta de fabry y la enfermedad de pompe

In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease

El uso de la medicina personalizada para tratar enfermedades monogénicas raras como trastornos de depósito lisosomal (LSDs) es desafiado por diseños de ensayos clínicos, altos costos y bajo número de pacientes. Cientos de alelos del mutante están implicados en la mayoría de los LSDs. Las enfermedades se clasifican típicamente en 2 a 3 diferentes tipos clínicos según la gravedad. Por otra parte, la caracterización molecular del genotipo puede ayudar a predecir los resultados clínicos e informar a la atención de los pacientes. Por lo tanto, hemos desarrollado un ensayo de cultivo de célula simple basado en HEK293H las células con heterologously sobreexpresión las mutaciones identificadas en la enfermedad de Fabry y Pompe. Un análisis similar se ha introducido recientemente como prueba preclínica para identificar mutaciones susceptibles de terapia farmacológica de acompañante (PCT) en la enfermedad de Fabry. Este manuscrito describe un ensayo de cultivo de células modificadas que permiten una rápida evaluación fenotípica de variantes alélicas en la enfermedad de Fabry y Pompe a identificar a los pacientes elegibles para el PCT y puede ayudar en el desarrollo de nuevos pharmacochaperones.

El procedimiento de mutagénesis Para evaluar la eficiencia de mutagénesis GLA gen, las mutaciones se clasificaron en una de las siguientes categorías. Este enfoque para generar mutaciones reveló que cerca de 66,5% de las mutaciones de GLA se obtuvieron en el primer intento. Un 25% podría obtenerse después de un PCR de segunda ligeramente modificada.
Categoría 1: La mutagénesis PCR fue efecti...

Existe una demanda para hacer clínico pruebas de una nueva clase de fármacos "huérfanos" llamadas chaperonas farmacológicas reproducible, rápida y eficiente. Desarrollamos un análisis basado en la cultura de célula simple, altamente estandarizados y versátil a pantalla para pacientes elegibles así como chaperonas farmacológicas novela drogas.

In Vitro Medición de la enzima a prueba chaperonas farmacológicas respuesta de Fabry y la enfermedad de Pompe

The use of personalized medicine to treat rare monogenic diseases like lysosomal storage disorders (LSDs) is challenged by complex clinical trial designs, ...

El objetivo general de este protocolo de cultivo celular modificado es proporcionar una evaluación fenotípica rápida de la varianza alélica en la enfermedad de Fabry y Pompe. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades de depósito lisosomal, como los resultados pronósticos y las decisiones terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente reproducible y que puede ayudar en el desarrollo de nuevos fármacos, como las farmacochaperonas.Para llevar a cabo la mutagénesis dirigida al sitio, comience utilizando las secuencias de referencia NM 00169.2 y NM 00152.4 como plantillas para la mutagénesis de los genes GLA y GAA, respectivamente. Utilice la herramienta gratuita Diseño de imprimación para respaldar el diseño de imprimación. A continuación, se hace sintetizar un conjunto de cebadores de alta pureza y sin sal por un proveedor comercial, con cebadores de sentido y antisentido que llevan una de las respectivas modificaciones de secuencia, en función de su longitud, para introducir individualmente la mutación.Prepare la mezcla de reacción en un volumen de 50 microlitros y ejecute el programa de PCR utilizando las condiciones estándar proporcionadas por el fabricante y enumeradas en el protocolo de texto. Después de la PCR, agregue un microlitro de la enzima de restricción Dpn1 y continúe incubando los viales de reacción a 37 grados Celsius durante una hora. Después de transformar el ADN plasmático en células E. coli competentes y preparar plásmidos de la transformancia deseada de acuerdo con el protocolo de texto, utilice una herramienta de biología molecular adecuada para analizar la secuencia.Cuando se detecta la mutación deseada y no se observa ninguna otra anomalía en la secuencia en comparación con NM 000169.2 para la alfa-galactosidasa A o NM 000152.4 para la alfa-galactosidasa ácida, seleccione el clon para la purificación del plásmido de grado de transfección. Determine la pureza del ADN midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro. Después del cultivo de HEK293H células en un matraz de cultivo T75 según el protocolo de texto, 24 horas antes de la transfección, use PBS sin calcio o magnesio para lavar las células una vez.Con 0,05% de tripsina-EDTA, coseche las células y en las cavidades de una placa de cultivo de 24 pocillos use 500 microlitros de DMEM suplementado con 10% de FBS para sembrar 1,5 veces 10 a las cinco células. Realice la transfección celular de acuerdo con el manual del fabricante. Utilizando una mezcla de un microgramo de ADN plasmídico disuelto en 100 microlitros de DMEM sin suero y 2,5 microlitros de reactivo de transfección.Incube la solución durante 20 minutos a temperatura ambiente, luego agréguela a las celdas gota a gota. Después de un período de cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% de CO2, retire el medio que contiene el reactivo de transfección y agregue 500 microlitros de DMEM fresco con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Como opción durante este paso, agregue DGJ o DNJ al medio de cultivo donde se desee.El día de la cosecha, retire las células de la incubadora. Luego aspire el medio y use PBS con calcio y magnesio para lavar cuidadosamente las células dos veces. Este paso es crítico porque DGJ y DNJ son inhibidores de ambas enzimas y, por lo tanto, cualquier resto invalidaría la prueba.Después del lavado, agregue 200 microlitros de agua desionizada directamente sobre las celdas. A continuación, enjuague las células de la placa y transfiéralas a un tubo de reacción de 1,5 mililitros. Coloque las muestras en una rejilla de espuma adecuada y vértelalas durante cinco segundos para que la lisis sea más eficiente.A continuación, alterne las muestras entre nitrógeno líquido durante 10 segundos y un baño de agua a temperatura ambiente hasta que se complete la descongelación. Después de repetir el procedimiento de homogeneización cinco veces, centrifugar las muestras durante cinco minutos a 10.000 g. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de reacción.Para llevar a cabo el ensayo de BCA, prepare un tubo nuevo para cada muestra que contenga 40 microlitros de H20 desionizado y agregue 10 microlitros de muestra. Mezcle cada solución mediante un breve vórtice y transfiera 10 microlitros de cada muestra por triplicado a las cavidades de una placa de 96 pocillos. Para preparar una curva estándar, diluya una solución madre de BSA de 2 miligramos por mililitro y H2O desionizado de acuerdo con el protocolo de texto.Después de combinar el reactivo A y el reactivo B, inicie la reacción añadiendo 200 microlitros de la solución de reactivo BCA e incube las muestras en la oscuridad a 37 grados centígrados y 300 rpm en un agitador orbital durante una hora. A continuación, mida la absorbancia a 560 nanómetros en un lector de placas. Las muestras suelen contener entre uno y 1,5 microgramos de proteína por microlitro.Diluir la cantidad calculada de cada muestra y pipetearla en tubos de reacción nuevos de 1,5 mililitros para obtener 0,05 microgramos de alfa-galactosidasa A o 0,5 microgramos de alfa-glucosidasa ácida por microlitro de solución. Vuelva a vorexear las muestras durante cinco segundos y pipetee 10 microlitros de esta dilución por duplicado en una placa de 96 pocillos. Inicie las reacciones agregando 20 microlitros de la solución de sustrato respectiva.Para la alfa-galactosidasa A, agregue dos milimolares de 4-metilumbeliferol alfa-D galactopiranósido, o 4-MU-gal, en tampón de fosfato-citrato 0.06 molar, pH 4.7. Para la alfa-glucosidasa ácida, agregue 2 milimolares de glucopiranósido 4-metilumbeliferol alfa-D, o 4-MU-glu, en acetato de sodio 0,025 molar, pH 4,0. Incubar las reacciones enzimáticas durante una hora en la oscuridad a 37 grados centígrados y 300 rpm en un agitador orbital.A continuación, finalice la reacción añadiendo 200 microlitros de tampón de hidróxido de sodio de glicina ajustado a 1,0 pH molar 10,5. Prepare una curva estándar de 4-MU a partir de un stock de 0,01 miligramos por mililitro de acuerdo con el protocolo de texto y pipetee 10 microlitros de las soluciones por duplicado en una placa de 96 pocillos. Agregue 200 microlitros del tampón de hidróxido de sodio de glicina 1.0 molar a cada pocillo para ajustar el volumen y el pH.Finalmente, mida la actividad enzimática en un lector de florescencia equipado con el juego de filtros adecuado. Y analizar los datos utilizando el software adecuado para el dispositivo lector de fluorescencia. Para evaluar la eficiencia de la mutagénesis del gen GLA, las mutaciones se clasificaron en tres categorías y revelaron que alrededor del 66,5% se obtuvieron en el primer intento.Un 25% adicional podría obtenerse después de una segunda PCR ligeramente modificada. En la categoría tres, se tuvieron que realizar más esfuerzos, como el rediseño de la imprimación, para obtener el clon deseado. Esta tabla se refiere a los resultados de la medición de la actividad enzimática para tres mutaciones de la alfa-galactosidasa A y tres mutaciones de la alfa-glucosidasa ácida que no se trataron o se trataron con DGJ y DNJ.Los datos se muestran como valores absolutos para el recambio de sustrato y tienen valores relativos normalizados a la enzima de tipo salvaje. Los datos de actividad enzimática absoluta se corrigieron para la actividad enzimática endógena de las células HEK293H utilizando células transfectadas con un vector vacío de pcDNA 3.1. Los valores de actividad enzimática se normalizaron a la enzima de tipo salvaje de los experimentos correspondientes, lo que explica la desviación de los valores relativos entre los diferentes mutantes.Una vez dominada, la fracción posterior al cultivo celular de este experimento, que representa la mayor parte del tiempo de práctica, se puede realizar en cuatro horas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades de almacenamiento lisosomal exploraran las correlaciones genotipo-fenotipo en la enfermedad de Fabry y Pompe. Este protocolo puede ayudar en el desarrollo de nuevos fármacos en enfermedades de almacenamiento lisosomal.

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Investigación

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Medicine

Medicina

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