Caracterización de extensiones de la membrana de la célula y estudiar sus funciones en la dinámica de adherencia celular cáncer

El objetivo general es determinar el efecto de las alteraciones experimentales en el repertorio de extensión celular y cómo se relaciona con la función de adhesión celular en el cáncer. Este método puede ayudar a identificar las funciones clave del repertorio de extensión de la membrana celular en la modulación del comportamiento celular, como la adhesión celular, la motilidad y la invasión. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente sencilla de realizar y se puede adaptar fácilmente a diversas condiciones experimentales.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a nuestra terapia o diagnóstico de cánceres localmente avanzados o metastásicos, ya que ayuda a cuantificar con precisión los cambios en el repertorio de extensión celular asociados a alteraciones en las células tumorales con capacidades adhesivas e invasivas. También se puede aplicar a otros sistemas, como la regulación de los canales iónicos, que se sabe que desempeña un papel importante en la formación de extensiones celulares y los procesos fisiológicos normales. La demostración visual y el registro de este método es fundamental, ya que el recuento de los pasos de extensión celular es difícil de aprender debido a las sutilezas de su apariencia a veces.

Un día antes de la toma de imágenes, cuente las células SW 13, SW Neo y SW DKK3 cultivadas en una incubadora de 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono utilizando un hemocitómetro. Coloque cubreobjetos de vidrio estéril en pocillos individuales de tres placas de seis pocillos. Utilice una placa separada para cada línea celular y coloque las tres líneas celulares a una densidad de 5.000 células por pocillo en estas seis placas de pocillos.

Coloque las células en una incubadora a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, de cada pocillo aspira el medio de crecimiento. Luego, lave las células en un mililitro de PBS tibio.

Posteriormente, agregue un mililitro de formaldehído al 3,7 por ciento en cada pocillo para fijar las celdas. Deje las células en el fijador durante 10 minutos. Una vez realizada la fijación, aspire el formaldehído.

Añade un mililitro de violeta cristalino al 0,05 por ciento en cada pocillo para teñir las células durante 30 minutos. A continuación, limpie el exceso de mancha lavando las celdas con un mililitro de agua desionizada por pozo tres veces. A continuación, coloque una gota de reactivo de montaje transparente en un portaobjetos de vidrio etiquetado.

A continuación, con unas pinzas de punta fina, recupere suavemente los cubreobjetos y colóquelos boca abajo sobre los reactivos de montaje. Después de montar todos los cubreobjetos teñidos en portaobjetos, bajo un microscopio óptico, elija 20 vistas aleatorias de células no superpuestas de cada cubreobjetos. Tome micrografías fotográficas de 400 aumentos de fuerza para cada campo de visión.

A continuación, observe y cuente el número de tipos de extensión en cada una de las 20 celdas representativas. Utilice las definiciones y el protocolo de texto para guiar su clasificación de la extensión de la membrana como filopodios, lobopodios o lamelipodios. Al contar por primera vez los tipos de extensiones de celda, puede ser útil mantener una imagen de referencia disponible para su revisión.

Si es posible, contar de manera ciega con respecto a sus muestras experimentales proporcionará objetividad adicional. Determine el número promedio de extensiones de cada tipo por celda en cada una de las tres líneas celulares examinadas. Utilice el anova de una vía para probar que la diferencia en el porcentaje promedio de extensiones de membrana celular entre los diferentes tipos de células es estadísticamente significativa.

Un día antes del ensayo, con un hemocitómetro, se cuentan las células SW 13, SW Neo y SW DKK3. Coloque estas células a una densidad de 100.000 células por pocillo en seis placas de pocillos, utilizando una placa para cada uno de los seis puntos de tiempo designados que se van a probar. Coloque las células en una incubadora a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante la noche.

Al día siguiente, retire la placa de la incubadora y lave las celdas una vez con PBS tibio. A continuación, añada 0,5 mililitros de solución de disociación de células no enzimáticas de concentración única en cada pocillo. Agite suavemente las placas para esparcir uniformemente la solución agregada.

Incubar las placas con la solución durante tiempos definidos. Aspire la placa designada al final de cada punto de tiempo. Poco después de cada aspiración, lave las células con un mililitro de PBS tibio.

A continuación, golpee suavemente la placa para separar las celdas sueltas. Repita el lavado junto con el golpeteo intermitente dos veces más. Por último, aspire el PBS restante y fije las células que hayan quedado en la placa con un mililitro de formaldehído al 3,7 por ciento.

Una vez realizada la fijación, aspire el formaldehído. Luego, agregue un mililitro de 0.05 por ciento de violeta cristalino en cada pocillo para teñir las células. Una vez que se complete la tinción, elimine el exceso de mancha lavando las celdas con un mililitro de agua desionizada por pozo tres veces.

Usando un microscopio óptico con un aumento de 100 grados, cuente las células adheridas restantes en cada pocillo para cada placa. A continuación, determine el porcentaje de células que han permanecido separadas durante los diferentes puntos de tiempo para las tres líneas celulares que se probaron. Utilizando un anova de dos vías, la prueba de las diferencias y las tasas de desprendimiento celular entre las tres líneas celulares son estadísticamente significativas.

Las células SW 13 y SW Neo de control teñidas con violeta cristalino formaron principalmente filopodios y lamelipodios. Por el contrario, las células que expresan DKK3 formaron más lobopodios con una ausencia casi completa de lamelipodios y muy pocos filopodios. Además, observe las diferencias de polaridad entre las células que expresan DKK3 y las líneas celulares de control.

El gráfico muestra la proporción de diferentes extensiones celulares en las tres líneas celulares probadas. Nótese la proporción significativamente mayor de lobopodios en las células que expresan DKK3. Los gráficos de líneas muestran el porcentaje de células que permanecieron adheridas a la placa después del tratamiento con la solución de disociación para los puntos de tiempo indicados en el eje X.

En todos los puntos de tiempo de hasta 10 minutos, las células que expresan DKK3 mostraron una fuerza de unión celular significativamente mayor en comparación con las células de control. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un período de tiempo de uno a dos días, dependiendo de su configuración experimental, si se realiza correctamente. Al realizar este procedimiento, es importante recordar evaluar cómo los cambios en la morfología de la extensión celular afectan la capacidad adhesiva.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar con precisión las extensiones celulares en relación con los cambios en las características de adhesión de las células cancerosas. Buena suerte y gracias por mirar.