Efectos de fármacos hipolipemiantes en la modulación de la morfología de las partículas de colesterol

El objetivo general de este estudio es evaluar el efecto de los fármacos hipolipemiantes en la modulación de las características morfológicas de las partículas de colesterol utilizando un método de matriz de placas, e identificar posibles biomarcadores para el diagnóstico de la aterosclerosis y determinar los efectos de los fármacos. El papel de los fármacos hipolipemiantes en la modulación de la formación de partículas de colesterol es poco conocido. Aquí demostramos que los fármacos hipolipemiantes desempeñan un papel directo en la alteración de los perfiles y las características morfológicas de la formación de partículas de colesterol.

La principal ventaja del método de imagen in vitro basado en la matriz de placas sobre otros métodos de detección de partículas es que permite la visualización de las partículas de colesterol para evaluar el efecto de los fármacos hipolipemiantes en el suero. Jason Lundry, técnico de laboratorio de Plaxgen, demostrará cómo configuramos el ensayo de matriz de placas utilizando un analizador químico. Raymond Kong, científico sénior de Millipore Sigma, demostrará cómo se procesan las muestras mediante citometría de flujo por imágenes.

Por último, David Liu, técnico de laboratorio de Plaxgen, demostrará el análisis de datos para imágenes de partículas de colesterol. Utilice un analizador químico-1 para configurar el ensayo de matriz de placas para la formación de partículas de colesterol. A lo largo del ensayo, mantenga el volumen de reacción final en cada pocillo a 200 microlitros y realice todos los ensayos por triplicado.

Primero, cargue 194 punto cinco microlitros de solución salina tamponada con fosfato, o PDS, en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo y baja unión a proteínas. A cada pocillo, agregue dos coma cinco microlitros de cada solución de fármaco reductor de lípidos, no se agrega ningún medicamento a las muestras de control negativas. A continuación, agite la placa durante 30 segundos, colocándola sobre la placa de reacción del analizador químico-1 para mezclar uniformemente el fármaco en la solución.

Finalmente, agregue dos microlitros de solución agregada de colesterol marcada con fluorescencia a cada pocillo. Agite la placa durante 30 segundos colocándola en la placa de reacción del analizador químico-1 como antes. Luego, incube la placa en un agitador de laboratorio durante dos horas a 37 grados centígrados y 200 rpm.

Después de la incubación, adquiera las imágenes de las partículas mediante citometría de flujo por imágenes. Abra la plantilla de adquisición de datos para cargar la configuración correcta del instrumento. Haga clic en Archivo, luego seleccione Cargar plantilla y seleccione el archivo de plantilla.

Haga clic en Cargar para preparar el instrumento para la carga de muestras. Cuando se abra el cuadro de diálogo Cargar muestra, haga clic en Aceptar para cargar 50 microlitros de las muestras en el citómetro de flujo de imágenes. Espere hasta que las partículas se puedan ver en el área de imágenes en tiempo real.

Cuando las partículas en el área de imagen estén bien enfocadas, haga clic en Adquirir para adquirir imágenes de cada objeto simultáneamente de una manera de alto rendimiento para campo oscuro, campo claro, fluorescencia verde y fluorescencia amarilla. Al final de la adquisición, haga clic en el botón Devolver para devolver la muestra. Repita estos pasos para adquirir de 5.000 a 10.000 partículas de cada muestra.

Analice todos los archivos de imagen sin procesar utilizando el software de análisis de imágenes para determinar la intensidad de fluorescencia del objeto y las variaciones morfológicas, como se describe en el protocolo de texto. Prepare una placa de 96 pocillos de base redonda y baja unión a proteínas cargando reactivos de manera escalonada, utilizando un volumen de reacción final de 200 microlitros por pocillo. Primero, prepare los pozos de control.

Cargue 193 microlitros de PBS en cada pocillo. Añadir un 2,5% de suero paciente, cargando solo una muestra de suero por pocillo. Luego, agite la placa durante 30 segundos colocándola en la placa de reacción del analizador químico.

A continuación, agregue dos microlitros de solución agregada de colesterol marcada con fluorescencia en cada pocillo. Nuevamente, agite la placa durante 30 segundos colocándola en la placa de reacción del analizador químico-1. Para preparar los pocillos con medicamentos, cargue 191 microlitros de PBS en cada pocillo.

A continuación, añada un 2,5% de cada suero del paciente por pocillo y agite la placa durante 30 segundos, colocándola sobre una placa de reacción del analizador químico-1. Agregue dos microlitros de solución de ezetimiba, lovastatina, simvastatina o niacina a todos los pocillos, excepto a los pocillos de control negativo. Añadiendo solo un fármaco por pocillo.

Proceda a agitar el plato durante 30 segundos como antes. A continuación, agregue dos microlitros de solución agregada de colesterol marcada con fluorescencia en cada pocillo antes de agitar el plato durante 30 segundos. Luego, incube la placa durante dos horas en un agitador de laboratorio, ajustado a 37 grados centígrados y 200 rpm.

Después de la incubación, adquiera las muestras mediante citometría de flujo por imágenes siguiendo los mismos ajustes que antes. Utilice el software de análisis de imágenes para procesar por lotes todos los archivos de imagen como se describe en el protocolo de texto. Aquí se muestran resultados representativos que muestran la identificación de partículas de colesterol en forma de hebra globular y lineal, inducidas por estatinas, por un mecanismo no enzimático.

Se muestra la confirmación de dos morfologías distintas de formación de partículas de colesterol, inducidas por otros fármacos hipolipemiantes. Incluyendo ezetimiba, niacina, fibrato y ácidos grasos omega-3. Aquí se muestran diagramas de puntos, donde el eje X muestra un espectro de partículas de colesterol detectadas en el canal de fluorescencia verde.

Y el eje Y muestra la dispersión lateral, la compuerta muestra regiones de lipoproteínas de muy baja densidad, lipoproteínas de baja densidad y partículas de lipoproteínas de alta densidad, detectadas en los gráficos de puntos de fluorescencia. Estos resultados demuestran cómo el efecto hipolipemiante altera los perfiles de las partículas de colesterol VLDL y LDL purificadas, en presencia de ningún fármaco, ezemida, lovastatina, simvastatina y niacina. Aquí se muestra una pantalla de tres muestras de suero diferentes para la identificación de un efecto diferencial de varios fármacos hipolipemiantes, que modulan los perfiles de formación de partículas de colesterol VLDL, LDL y HDL.

Estos perfiles indican que también hay una variación en los niveles de respuesta entre las tres muestras de suero diferentes. El cribado de la muestra de suero uno para detectar partículas de colesterol globulares y de forma lineal formadas sin el fármaco y en presencia de varios fármacos hipolipemiantes, confirma dos morfologías distintas de partículas de colesterol derivadas del suero, que muestran formas de hebras globulares y lineales. Por lo tanto, hemos demostrado con éxito un enfoque de imagen in vitro para la identificación del efecto del fármaco hipolipemiante, que modula la relación con la formación de partículas de colesterol y su significado clínico.

Nuestros resultados preliminares son prometedores y estamos en el proceso de validar aún más este ensayo de matriz de placas utilizando muestras clínicas a gran escala. Su panel de lípidos estándar mide los niveles de colesterol LDL y HDL en suero. Nuestro ensayo de matriz de placas espera mejorar la precisión del riesgo de aterosclerosis y predice la respuesta a los fármacos hipolipemiantes mediante el uso de suero.