Name: Efectos de fármacos hipolipemiantes en la modulación de la morfología de las partículas de colesterol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a evaluar los efectos de fármacos hipolipemiantes en la morfología de partículas de colesterol mediante el método de matriz de placas. Esta técnica permite visualizar alteraciones en VLDL y LDL para identificar biomarcadores de aterosclerosis.

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Este trabajo fue financiado por una investigación de Plaxgen subsidio otorgado a SM (PLX-1008). Agradecemos a Palo Alto Fundación Investigación Instituto de investigación médica para recoger las muestras de suero de ateroesclerosis sujetos aprobación del IRB.

1. preparación de fluorescente etiquetado colesterol y fármacos hipolipemiantes Nota: agregados de colesterol marcado con fluorescente y estatinas se prepararon según lo descrito en nuestro artículo anterior 21. para detalles de los reactivos, imágenes citómetro de flujo, analizadores de química y software de análisis de datos utilizados en este estudio, véase Tabla de materiales.
<ol><li>Solubilizar colesterol liofilizado marcado con fluorescente (1 mg, Ex / Em = 495 nm/507 nm) en polvo en 1 mL de alcohol al 100%.</li>
	<li>Centrifugar la muestra durante 3 min a 2.040 x g y utilice el sobrenadante que contiene agregados solubles colesterol marcado con fluorescencia en el ensayo de placa matriz.</li>
	<li>Para la preparación de medicamentos, solubilizar individualmente los polvos (2 mg) de simvastatina, lovastatina, atorvastatina, ezetimiba y ácidos grasos de omega-3 en 1 ml de alcohol al 100%.</li>
	<li>Después de la centrifugación durante 3 min a 2.040 x g, usar el sobrenadante que contiene drogas en el análisis.</li>
	<li>Asimismo, solubilizar individualmente los polvos (2 mg) de fluvastatina, rosuvastatina, niacina y fibrato en 1 mL de agua desionizada para hacer una solución de 2 mg/mL.</li>
	<li>Después de la centrifugación durante 3 min a 2.040 x g, usar el sobrenadante que contiene drogas en el análisis de matriz de la placa.</li>
</ol> 2. Placa matriz de análisis para la formación de partículas de examen In Vitro de colesterol <ol><li>analizador de la química de uso-1 (véase tabla de materiales) para configurar el análisis de la matriz de placa para la formación de partículas de colesterol. Realizar el ensayo en un fondo redondo, placa de 96 pocillos de enlace de baja proteína utilizando los reactivos preparados en la sección 1. Mantener el volumen de reacción final en cada pozo a 200 μl y realizar todos los ensayos por triplicado.
	<ol><li>Primero, carga 194.5 μl de fosfato tampón salino (PBS) a cada pocillo.</li>
		<li>a cada uno, añadir 2,5 μl (5 μg) de cada solución de drogas hipolipemiantes y agitar la placa por 30 s, colocando en la placa del analizador-1 reacción química para mezclar uniformemente el medicamento en solución. Ningún fármaco se añade a las muestras control negativo.</li>
		<li>Por último, 2 μl (2 μg) colesterol marcado con fluorescente agregada la solución en cada pocillo y agitar la placa por 30 s, colocando en la placa del analizador-1 reacción química.</li>
		<li>Incube la placa en un agitador de laboratorio durante 2 h a 37 ° C y 200 rpm.</li>
		<li>Después de la incubación, adquirir las imágenes de partículas por citometría de imagen.</li>
	</ol></li></ol> 3. Captura imágenes de colesterol partículas usando proyección de imagen citometría de flujo <ol><li>abrir la plantilla de adquisición de datos para cargar la configuración correcta del instrumento. Haga clic en " archivo ", seleccione " plantilla abierta … " y seleccione el archivo de plantilla.</li>
	<li>Haga clic en " ras, cerradura, carga " para preparar el instrumento para la carga de la muestra.</li>
	<li>Cuando la " muestra la carga " se abre la caja de diálogo, haga clic en " OK " cargar 50 μl de las muestras de cada uno bien preparado en la sección 2 en el citómetro de flujo imagen.</li>
	Haga clic <li>" Run | Configuración " para ver las partículas en el área de proyección de imagen en tiempo real.</li>
	<li>Cuando las partículas en el área de proyección de imagen son en buen foco, haga clic en " ejecutar | Adquirir " para adquirir imágenes de cada objeto al mismo tiempo en forma de alto rendimiento para campo oscuro (lado dispersión/SSC), campo claro (BF), fluorescencia verde y fluorescencia amarillo.</li>
	<li>Repita los pasos 3.2-3.5 para adquirir 5.000-10.000 partículas de cada muestra de.</li>
	<li>Analizar todos los archivos de imagen raw utilizando el software de análisis de imagen para determinar la intensidad de la fluorescencia de objeto y variaciones morfológicas.
	<ol><li>Haz clic en el " herramientas " botón en la parte superior del software de análisis de imagen, a continuación, seleccione " archivos de datos por lotes " en el menú desplegable, que se abrirá la " lotes " ventana.</li>
		<li>En el " lotes " ventana, haga clic en el " añadir lote " botón, que abrirá sus puertas el " definir un lote " ventana.</li>
		<li>En el " definir un lote " ventana, haga clic en la " agregar archivos " el botón y seleccione los archivos de imagen raw, haga clic en la " plantilla " botón y seleccione el archivo de plantilla de análisis de los datos pertinentes y luego " OK " y " enviar lotes " para iniciar el procesamiento y análisis de los archivos de imagen raw.</li>
	</ol></li></ol> 4. Placa matriz análisis basado en evaluación de hipolipemiantes fármacos efecto sobre las partículas de colesterol purificado <ol><li>como se describe en el paso 2.1, realiza el ensayo de formación de partículas de colesterol purificado VLDL, LDL y HDL lipoproteínas/partículas. Realizar el análisis de matriz de la placa en una placa de 96 pozos.
	<ol><li>Primero, cargar todos los pocillos con PBS; utilizar un volumen final de 200 μL de cada pocillo.</li>
	</ol></li> <li>Para el control negativo, añadir 4 μg de VLDL, LDL, o las proteínas/las partículas de HDL individualmente en cada uno así sin drogas y agitar la placa por 30 s.
	<ol><li>Para examinar el efecto de drogas hipolipemiantes, agregar 4 μg de VLDL, LDL, o las proteínas/las partículas de HDL individualmente a cada uno bien y agitar la placa por 30 s.</li>
		<li>Para pozos con 4 μg VLDL, LDL y HDL, 2,5 μl (5 μg) ezetimiba, lovastatina, simvastatina y niacina solución y agitar la placa por 30 s, colocando en el analizador de la química-1.</li>
		<li>Por último, 2 μl (2 μg) colesterol marcado con fluorescencia agregada la solución a todos los pozos y agitar la placa por 30 s, colocando en la placa del analizador-1 reacción química.</li>
	</ol></li> <li>Incube la placa durante 2 h en un agitador de laboratorio a 37 ° C y 200 rpm.</li>
	<li>Adquirir las muestras mediante citometría de flujo imágenes siguiendo pasos 3.1-3.5.</li>
	<li>Analizar los archivos de imagen raw utilizando el software de análisis de imagen como se describe en el paso 3.7.</li>
	<li>En la plantilla de análisis, utilice el siguiente esquema bloquea para la identificación de subpoblaciones de partículas de colesterol.
	<ol><li>En una parcela de la cantidad de píxeles de canal verde saturado (eje x) y campo oscuro canal número de píxeles saturados (eje y), rechazar objetos con uno o más píxeles saturados en ningún canal.</li>
		<li>Parcela las partículas de los objetos sin pixeles saturados con intensidad de canal verde (eje x) y la intensidad SSC (eje y): los objetos caen en una de tres regiones (VLDL, LDL, HDL) basadas en su canal verde e intensidades SSC. 
		Nota: Estas puertas fueron creadas en base a datos generados a partir de experimentos de control llevado a cabo utilizando purificada VLDL, LDL y HDL partículas/proteínas sin la droga.</li>
	</ol></li> <li>Para determinar el efecto de drogas hipolipemiantes para cada muestra, calcular las concentraciones de partículas de lipoproteína total, así como el porcentaje de cada subpoblación (VLDL, LDL, HDL) como se describe en paso 6.5.
	Las concentraciones <ol><li>calcular las partículas (partículas/mL) utilizando la siguiente ecuación: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg"> Nota: la VLDL, LDL y HDL gating regiones en el diagrama de punto de fluorescencia detectar ~ 80% de sus subpoblaciones respectivas y el resto de ~ 20% de las partículas se superponen con otras regiones bloquea.</li>
	</ol></li></ol> 5. Medición de las concentraciones de lípidos en las muestras de suero <ol><li>para la determinación de las concentraciones de LDL, HDL, colesterol y triglicéridos por el analizador de la química-2, utilizar muestras de suero obtenidas de sujetos normales y dislipidemia pareados por edad.</li>
	<li>Definir anormal concentración de LDL, HDL, colesterol y triglicéridos en su concentración identificado más allá de los valores de referencia superior e inferior en las muestras de suero base.</li>
	<li>Seguir la recomendaciones de valor de referencia normalDED por el fabricante del reactivo: colesterol (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4-100 mg/dL) y triglicéridos (9-200 mg/dL).</li>
	<li>Identificar las muestras de suero que tienen un valor anormal por debajo del valor de referencia inferior o por encima de la referencia de mayor valor para el colesterol y los triglicéridos y utilizarlas para proyección en presencia y en ausencia de fármacos hipolipemiantes.</li>
</ol> 6. Analizar el efecto de drogas en la formación de partículas de colesterol en muestras de suero <ol><li>uso la química analizador-1 para configurar el análisis de la matriz de placa para la formación de partículas de colesterol en muestras de suero. Realizar el ensayo en un fondo redondo, placa de 96 pocillos de enlace de baja proteína. Utilizar un volumen de reacción final de 200 μL/pocillo y realizar todos los ensayos por triplicado.</li>
	<li>Preparar la placa por la carga de reactivos en una manera paso a paso.
	<ol><li>Preparar los pocillos control.</li>
		<li>Carga 193 μl de PBS a cada pocillo.</li>
		<li>Añadir 2.5% (v/v) suero (muestra de sola suero por pozo) y agitar la placa por 30 s, colocando en la placa de reacción del analizador de la química.</li>
		<li>Añadir 2 μl (2 μg) de colesterol marcado con fluorescencia total solución en cada pocillo y agitar la placa por 30 s, colocando en una placa del analizador-1 reacción química.</li>
	</ol></li> <li>Preparar los pozos con drogas.
	<ol><li>Carga 191 μl de PBS a cada pocillo.</li>
		<li>Añadir 2.5% (v/v) suero (muestra de sola suero por pozo) y agitar la placa por 30 s, colocando en una placa del analizador-1 reacción química.</li>
		<li>Añadir 2 μl ezetimiba, simvastatina y lovastatina, niacina solución (4 μg) a excepción de los pozos de control negativo. Añadir sólo un medicamento por pozo y agitar la placa por 30 s, colocando en una placa del analizador-1 reacción química.</li>
		<li>Añadir 2 μl de colesterol marcado con fluorescencia agregada solución (2 μg) en cada pocillo y agitar la placa por 30 s, colocando en la placa del analizador-1 reacción química.</li>
	</ol></li> <li>Cargar medicamentos solamente después de todos los pozos (control y tratados con drogas) han sido cargados con sus respectivos sueros y añadir colesterol marcado con fluorescencia en el final de este paso.</li>
	<li>Incube la placa durante 2 h en un agitador de laboratorio a 37 ° C y 200 rpm.</li>
	<li>Adquirir las muestras por proyección de imagen citómetro de flujo siguiendo los ajustes descritos en los pasos 3.1-3.6.</li>
	<li>Usar la imagen de análisis de software para todos los archivos de imagen utilizando la misma plantilla como se describe en pasos 3.7 de procesamiento por lotes.
	<ol><li>Realizar el análisis de datos mediante la elaboración de puertas en la parcela como se describe en los pasos 4.5 y 4.6.</li>
	</ol></li> <li>Para determinar la disminución de lípidos drogas efecto y respuesta (baja, moderada y alta) para cada muestra, calcular la concentración de partículas de lipoproteína total, así como el porcentaje de partículas totales que comprende de VLDL, LDL y HDL subpoblaciones.</li>
	<li>Trazar las poblaciones de VLDL, LDL y HDL en un histograma del objeto ' s campo brillante imagen, anchura restada de la longitud (longitud - anchura) y la puerta en las regiones ya sea globulares o lineales: objetos (longitud - anchura) ≤ μm 2 caen en el región globular para calcular el porcentaje de globular y lineal en forma de partículas.</li>
	<li>Comparar el porcentaje de globulares y lineales en forma de LDL y HDL colesterol partículas identificadas para cada muestra de suero incubado con y sin cada droga. Entre obtenidas por triplicado para cada muestra de suero, aceptar el porcentaje de lineal y globulares en forma de partículas de LDL y de HDL que caen dentro del rango de ±2 SD para determinación del efecto de drogas.</li>
</ol>

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</ol>

Dr. Madasamy recibió el apoyo de la beca de Plaxgen, Inc y tiene un interés financiero que compiten. Otros autores tienen intereses financieros que compiten a revelar.

En general, la distribución y propiedades funcionales de las partículas de colesterol de VLDL, LDL y HDL en la circulación de la sangre están determinados principalmente por celulares metabólicos, genéticos, epidemiológicos y factores de plasma22,23. En el presente estudio, examinando los efectos de la modificación de lípidos drogas en el tampón de revelaron que drogas altamente lipofílicas como el ezetimibe, simvastatina, lovastatina y atorvastatina inducida por una complejidad de nivel más alto en la morfología de las partículas de colesterol Comparado con el efecto de nivel más baja observado con drogas altamente hidrofílicas de rosuvastatina y fluvastatina. Estos resultados están en acuerdo con nuestro estudio anterior describiendo un mecanismo no enzimático basado en efecto de statins en la modulación de la formación de partículas de colesterol LDL y HDL en el suero y tampón de muestras21. En consecuencia, los resultados del presente estudio revelaron un mecanismo no enzimático de acción de la ezetimiba, niacina, fibrato y drogas de ácido graso omega-3 que pueden desempeñar un papel directo en la modulación de la formación de partículas de colesterol. Es posible que las interacciones entre medicamentos y agregados de colesterol conduce a la Asamblea de las partículas de colesterol de gran tamaño que son 2 a 60 μm2, exhibiendo morfologías globulares y lineal del filamento.
Además, los resultados obtenidos con las partículas de lipoproteína purificada sugieren interacciones entre agregados de colesterol y factores de plasma incluidas proteínas VLDL, LDL y HDL que pueden alterar las propiedades morfológicas del colesterol y composiciones partículas. Los resultados de tratamiento de drogas que involucra partículas de lipoproteína purificado indican un mayor efecto de nivel de drogas en la formación de partículas de VLDL en comparación con su efecto en la formación de partículas de colesterol LDL. Los medicamentos, lovastatina, simvastatina y ezetimiba fueron utilizados como pro-fármacos y sus dosis en los ensayos pueden ser superiores a las concentraciones fisiológicas.
Curiosamente, cribado de muestras de suero mostraron variaciones del efecto de la droga de alterar los perfiles de formación de partículas de colesterol VLDL, LDL y HDL, particularmente sus efectos sobre las formaciones de lineal en forma partículas de LDL y HDL. Estos fármacos inducida por reducción lineal en forma de formación de partículas de colesterol LDL y HDL en muestras de suero normales pareados por edad y dislipidemia. Los efectos de drogas observados en la reducción de formación de partículas en forma lineal fue mayor en simvastatin ezetimibe, lovastatina y niacina. La identificación de las partículas de colesterol con morfologías globulares y lineal de la cadena en las muestras de suero normal y dislipemia sugiere que partículas con morfologías similares pueden formar en condiciones de en vivo . Estudios previos han identificado la presencia de disco y cristales como agujas de colesterol en las placas ateroscleróticas de ApoE- / - humanos y LDLR- / - ratones modelos24,25,26 ,27,28.
Las partículas de HDL circulante en la sangre existen como una mezcla heterogénea y el nivel de las partículas de HDL de pequeño y gran tamaño con actividad funcional son factores importantes para ejercer su efecto cardio-protector por el transporte reverso de colesterol Ruta29,30. Estudios recientes han puesto de relieve la importancia de identificar subfracciones de partículas de colesterol de HDL para dilucidar su papel en múltiples funciones biológicas como el eflujo del colesterol, antiinflamatorio, antitrombótico y antioxidante31 . Además, varios estudios han reportado el efecto del tratamiento hipolipemiante en el aumento de un punto bajo para moderar el nivel de HDL en el plasma1,5,21. En consecuencia, los resultados de este estudio proporcionan nuevos conocimientos sobre las características morfológicas de las partículas de colesterol. En particular, la detección de un mayor nivel de partículas de colesterol HDL en forma lineales en las muestras de suero de dislipemia asignaturas sugiere que puede ser el biomarcador fiable para el diagnóstico y evaluación de efectos de la modificación de lípidos fármacos en pacientes. Sin embargo, más investigación es necesaria utilizando muestras clínicas grandes para entender mejor las partículas de colesterol con diferentes morfologías y su asociación a enfermedades cardiovasculares.
En el análisis de matriz de placa para examinar el efecto de la droga en conjunto de partículas de colesterol, utilizamos 2 μg de fluorescencia etiquetada agregados de colesterol y 5 µgof de drogas porque: (1) medicamentos competitivos se unen a ambos fluorescencia etiquetada colesterol y lípidos endógenos presentes en las muestras de suero; (2) de cada muestra, hemos adquirido 5.000 a 10.000 partículas de colesterol que se montan en grandes tamaños y formas que van desde 60 ~ 2 μ2; (3) observamos amplias variaciones de la respuesta de la droga entre las muestras de suero incubado con los medicamentos (dosis 300 ng 5 μg) y ~ 1-5% de ellos se incubaron con altas dosis no demostraron ningún cambio perceptible en el perfil de formación de partículas de colesterol; y (4) la interacción entre los agregados de colesterol y fármacos hipolipemiantes es mediada por un proceso no-enzimático. Por lo tanto, las concentraciones de los reactivos utilizados en el ensayo pueden ser superiores a su nivel fisiológico.
En conclusión, hemos demostrado con éxito las ventajas de una en vitro de método descrito en este estudio para determinar el efecto de un amplio espectro de fármacos hipolipemiantes en modulación de morfología y composición de colesterol partículas. El enfoque de visualizar y cuantificar la morfología de las partículas lipídicas mediante el empleo de una constelación de algoritmos de análisis de imagen puede ayudar a ambos el diagnóstico de aterosclerosis y para evaluar los resultados del tratamiento hipolipemiante en pacientes.

Numerosos estudios clínicos han demostrado efectos beneficiosos de los fármacos hipolipemiantes en la reducción de niveles plasmáticos de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y un bajo a moderado nivel de aumento en el colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL), que evita incidencias tanto primarias como secundarias de eventos cardiovasculares adversos relacionados con la aterosclerosis1,2,3,4,5. Estatinas, un grupo de inhibidores de HMG-CoA reductasa enzima, bloquean la síntesis de colesterol endógeno en el hígado que en turno pueda bajar circulando los niveles de colesterol LDL en la sangre6,7. Asimismo, el hipolipemiante de efecto de la niacina es mediada por su inhibición no competitiva y directa del hepatocito diacilglicerol Aciltransferasa-2, una enzima hepática clave involucrados en la síntesis de triglicéridos8. Comparativamente, ezetimiba reduce el nivel de plasma de LDL al limitar la absorción de colesterol exógeno por Unión a proteína de Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) localizada en las células epiteliales del intestino delgado9. Fenofibrato, otro fármaco hipolipemiante, reduce las concentraciones plasmáticas de triglicéridos y también moderado disminuye el colesterol LDL a través de receptores proliferator-activado peroxisome vía10. Además, ácido graso omega-3 se divulga para tener el efecto anti-aterosclerótico debido a su capacidad para reducir los niveles plasmáticos de LDL11.
Los medicamentos reductores de lípidos, además de su efecto primario sobre bajar el LDL colesterol, tienen una serie de efectos pleiotrópicos beneficiosos como mejorar el nivel de HDL, mejorando funciones endoteliales, reducción de la inflamación e inhibición plaquetaria agregados12,13,14. Sin embargo, el mecanismo subyacente de estos fármacos en el aumento de las partículas de colesterol HDL y modificar sus características estructurales no se entienden completamente. Ya que estos medicamentos son prescritos ampliamente para tratar la aterosclerosis relacionada con las enfermedades cardiovasculares (ECV), es esencial para investigar su posible papel en la determinación de las características morfológicas y la distribución de las partículas de lípidos. El lipidome plasma humano consta de aproximadamente 600 distintos lípidos y 22 tipos moleculares de colesterol que se encuentran en varios tamaños, formas, densidades y composiciones15,16,17 . Métodos analíticos como la ultra centrifugación, NMR y electroforesis del gel del gradiente son utilizados para caracterizar las partículas LDL y HDL y sus subfracciones18,19. Sin embargo, la aplicación de estos métodos se limita a estudios tendientes a determinar el efecto de las drogas en la modulación de morfología y ensamblaje de las partículas de lípidos. El conjunto de placa base de citómetro de flujo es un análisis bioquímico funcional desarrollado para la detección y visualización de suero había derivado lipídico y amiloide placa partículas20. Las ventajas de en vitro método descrito en este estudio de imagen permiten identificación de lípidos moduladores drogas efectos en la alteración de la morfología y distribución de las partículas de colesterol en muestras de suero y buffer.

<table><tbody><tr><td>TopFluor colesterol fluorescente</td><td>Avanti Polar tienda de lípidos</td><td></td><td>100 &micro; l alícuotas en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>simvastatina (pro-droga)Tienda de</td> <td>productos químicos</td><td></td> de Caimán <td>100 y micro; l alícuotas en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>lovastatina (pro-droga)Tienda de</td> <td>productos químicos</td><td></td> de Caimán <td>100 y micro; l alícuotas en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>rosuvastatina</td><td>Tienda de productos químicos</td><td></td> de las Islas Caimán <td>100 y micro; l alícuotas en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>atorvastatina</td><td>Tienda de productos químicos</td><td></td> de las Islas Caimán <td>100 y micro; l alícuotas en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>fluvastatina</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>tienda 100 y micro; l alícuotas en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>ezetimiba (pro-droga)</td><td>Tienda de productos químicos</td><td></td> de Caimán <td>100 y micro; l alícuotas en -20 &deg; C</td></tr><tr><td></td><td>Niacina MilliporeSigma</td><td></td><td>tienda 100 &micro; l alícuotas en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>fibrate</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 &micro; l alícuotas en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>ácido graso omega-3</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 &micro; l alícuotas en -20 &deg; </td></tr><tr><td>Proteínas/partículas VLDL purificadas C Proteínas/partículas</td><td></td> LDL purificadas Lee Bio <td></td><td></td></tr><tr><td>Proteínas/partículas HDL purificadas</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero humano adaptado a la edad Dx</td><td>Biosamples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero de aterosclerosis humana Suero</td> normal <td>Bioserve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human</td><td>Stanford Paquete</td> de reactivos para medición de LDL para centros <td></td><td></td>sanguíneos</tr><tr><td></td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paquete de reactivos para medición de HDL</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medición del colesterol total</td><td>Roche Diangostics</td> Placas de microtitulación de 96 pocillos <td></td><td></td></tr><tr><td>Roche</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amnis Imaging Citómetro de flujo</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes IDEAS</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902</td><td>Awarness Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemistry Analyzer-2, Intergra 400</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

efectos de fármacos hipolipemiantes en la modulación de la morfología de las partículas de colesterol

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Tratamiento de la dislipemia pacientes con fármacos hipolipemiantes conduce a una reducción significativa en el nivel de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y un bajo a moderado nivel de aumento en el colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL) en plasma. Sin embargo, un posible papel de estos fármacos en la alteración de la morfología y distribución de las partículas de colesterol es mal entendido. Aquí, describimos la evaluación en vitro de los efectos de drogas hipolipemiantes en la modulación de las características morfológicas de las partículas de colesterol con el método de matriz de la placa en combinación con imágenes de citometría de flujo. Análisis de imagen de las partículas de colesterol indican que atorvastatina, lovastatina, simvastatina y ezetimiba inducen la formación de partículas en forma de filamento globulares y lineales, mientras que la niacina, fibratos, fluvastatina y rosuvastatina inducen el formación de partículas sólo con forma globular. Próxima, muy purificada lipoproteína de baja densidad (VLDL) y las partículas de LDL incubadas con estos fármacos demostraron cambios en la morfología y la imagen de textura de colesterol subpoblaciones de partículas. Además, la investigación de 50 muestras de suero reveló la presencia de un mayor nivel de partículas de colesterol HDL en forma lineales en sujetos con dislipidemia (media de 18,3%) en comparación con las muestras normales de edad comparable (media de 11,1%). También se observaron variaciones considerables en los efectos de drogas hipolipemiantes en la reducción lineal en forma de formación de partículas de colesterol LDL y HDL en muestras de suero. Estos resultados indican que los fármacos hipolipemiantes, además de sus efectos hipolipidémicos mediada por células, pueden modular directamente morfología de partículas de colesterol por un mecanismo no enzimático de acción. Los resultados de estos resultados tienen potencial para informar el diagnóstico de la ateroesclerosis y predecir óptima terapia hipolipemiante.

El objetivo de este estudio fue evaluar en vitro hipolipemiantes efectos de la droga en la modulación de la morfología de las partículas de colesterol. Comparación de fármacos hipolipemiantes reveló variaciones en su efecto en la modulación de las características morfológicas de las partículas de colesterol.

Efectos de fármacos hipolipemiantes en la modulación de la morfología de las partículas de colesterol

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

El objetivo general de este estudio es evaluar el efecto de los fármacos hipolipemiantes en la modulación de las características morfológicas de las partículas de colesterol utilizando un método de matriz de placas, e identificar posibles biomarcadores para el diagnóstico de la aterosclerosis y determinar los efectos de los fármacos. El papel de los fármacos hipolipemiantes en la modulación de la formación de partículas de colesterol es poco conocido. Aquí demostramos que los fármacos hipolipemiantes desempeñan un papel directo en la alteración de los perfiles y las características morfológicas de la formación de partículas de colesterol.La principal ventaja del método de imagen in vitro basado en la matriz de placas sobre otros métodos de detección de partículas es que permite la visualización de las partículas de colesterol para evaluar el efecto de los fármacos hipolipemiantes en el suero. Jason Lundry, técnico de laboratorio de Plaxgen, demostrará cómo configuramos el ensayo de matriz de placas utilizando un analizador químico. Raymond Kong, científico sénior de Millipore Sigma, demostrará cómo se procesan las muestras mediante citometría de flujo por imágenes.Por último, David Liu, técnico de laboratorio de Plaxgen, demostrará el análisis de datos para imágenes de partículas de colesterol. Utilice un analizador químico-1 para configurar el ensayo de matriz de placas para la formación de partículas de colesterol. A lo largo del ensayo, mantenga el volumen de reacción final en cada pocillo a 200 microlitros y realice todos los ensayos por triplicado.Primero, cargue 194 punto cinco microlitros de solución salina tamponada con fosfato, o PDS, en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo y baja unión a proteínas. A cada pocillo, agregue dos coma cinco microlitros de cada solución de fármaco reductor de lípidos, no se agrega ningún medicamento a las muestras de control negativas. A continuación, agite la placa durante 30 segundos, colocándola sobre la placa de reacción del analizador químico-1 para mezclar uniformemente el fármaco en la solución.Finalmente, agregue dos microlitros de solución agregada de colesterol marcada con fluorescencia a cada pocillo. Agite la placa durante 30 segundos colocándola en la placa de reacción del analizador químico-1 como antes. Luego, incube la placa en un agitador de laboratorio durante dos horas a 37 grados centígrados y 200 rpm.Después de la incubación, adquiera las imágenes de las partículas mediante citometría de flujo por imágenes. Abra la plantilla de adquisición de datos para cargar la configuración correcta del instrumento. Haga clic en Archivo, luego seleccione Cargar plantilla y seleccione el archivo de plantilla.Haga clic en Cargar para preparar el instrumento para la carga de muestras. Cuando se abra el cuadro de diálogo Cargar muestra, haga clic en Aceptar para cargar 50 microlitros de las muestras en el citómetro de flujo de imágenes. Espere hasta que las partículas se puedan ver en el área de imágenes en tiempo real.Cuando las partículas en el área de imagen estén bien enfocadas, haga clic en Adquirir para adquirir imágenes de cada objeto simultáneamente de una manera de alto rendimiento para campo oscuro, campo claro, fluorescencia verde y fluorescencia amarilla. Al final de la adquisición, haga clic en el botón Devolver para devolver la muestra. Repita estos pasos para adquirir de 5.000 a 10.000 partículas de cada muestra.Analice todos los archivos de imagen sin procesar utilizando el software de análisis de imágenes para determinar la intensidad de fluorescencia del objeto y las variaciones morfológicas, como se describe en el protocolo de texto. Prepare una placa de 96 pocillos de base redonda y baja unión a proteínas cargando reactivos de manera escalonada, utilizando un volumen de reacción final de 200 microlitros por pocillo. Primero, prepare los pozos de control.Cargue 193 microlitros de PBS en cada pocillo. Añadir un 2,5% de suero paciente, cargando solo una muestra de suero por pocillo. Luego, agite la placa durante 30 segundos colocándola en la placa de reacción del analizador químico.A continuación, agregue dos microlitros de solución agregada de colesterol marcada con fluorescencia en cada pocillo. Nuevamente, agite la placa durante 30 segundos colocándola en la placa de reacción del analizador químico-1. Para preparar los pocillos con medicamentos, cargue 191 microlitros de PBS en cada pocillo.A continuación, añada un 2,5% de cada suero del paciente por pocillo y agite la placa durante 30 segundos, colocándola sobre una placa de reacción del analizador químico-1. Agregue dos microlitros de solución de ezetimiba, lovastatina, simvastatina o niacina a todos los pocillos, excepto a los pocillos de control negativo. Añadiendo solo un fármaco por pocillo.Proceda a agitar el plato durante 30 segundos como antes. A continuación, agregue dos microlitros de solución agregada de colesterol marcada con fluorescencia en cada pocillo antes de agitar el plato durante 30 segundos. Luego, incube la placa durante dos horas en un agitador de laboratorio, ajustado a 37 grados centígrados y 200 rpm.Después de la incubación, adquiera las muestras mediante citometría de flujo por imágenes siguiendo los mismos ajustes que antes. Utilice el software de análisis de imágenes para procesar por lotes todos los archivos de imagen como se describe en el protocolo de texto. Aquí se muestran resultados representativos que muestran la identificación de partículas de colesterol en forma de hebra globular y lineal, inducidas por estatinas, por un mecanismo no enzimático.Se muestra la confirmación de dos morfologías distintas de formación de partículas de colesterol, inducidas por otros fármacos hipolipemiantes. Incluyendo ezetimiba, niacina, fibrato y ácidos grasos omega-3. Aquí se muestran diagramas de puntos, donde el eje X muestra un espectro de partículas de colesterol detectadas en el canal de fluorescencia verde.Y el eje Y muestra la dispersión lateral, la compuerta muestra regiones de lipoproteínas de muy baja densidad, lipoproteínas de baja densidad y partículas de lipoproteínas de alta densidad, detectadas en los gráficos de puntos de fluorescencia. Estos resultados demuestran cómo el efecto hipolipemiante altera los perfiles de las partículas de colesterol VLDL y LDL purificadas, en presencia de ningún fármaco, ezemida, lovastatina, simvastatina y niacina. Aquí se muestra una pantalla de tres muestras de suero diferentes para la identificación de un efecto diferencial de varios fármacos hipolipemiantes, que modulan los perfiles de formación de partículas de colesterol VLDL, LDL y HDL.Estos perfiles indican que también hay una variación en los niveles de respuesta entre las tres muestras de suero diferentes. El cribado de la muestra de suero uno para detectar partículas de colesterol globulares y de forma lineal formadas sin el fármaco y en presencia de varios fármacos hipolipemiantes, confirma dos morfologías distintas de partículas de colesterol derivadas del suero, que muestran formas de hebras globulares y lineales. Por lo tanto, hemos demostrado con éxito un enfoque de imagen in vitro para la identificación del efecto del fármaco hipolipemiante, que modula la relación con la formación de partículas de colesterol y su significado clínico.Nuestros resultados preliminares son prometedores y estamos en el proceso de validar aún más este ensayo de matriz de placas utilizando muestras clínicas a gran escala. Su panel de lípidos estándar mide los niveles de colesterol LDL y HDL en suero. Nuestro ensayo de matriz de placas espera mejorar la precisión del riesgo de aterosclerosis y predice la respuesta a los fármacos hipolipemiantes mediante el uso de suero.

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Investigación

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