Detección visual de los ácidos nucleicos múltiples en un arreglo de capilares
November 15th, 2017
Este protocolo describe la fabricación de una cinta pequeña, lista para usar que se puede aplicar para detección visual de varios ácidos nucleicos en una prueba individual, que es fácil de operar. En este enfoque, una gama capilar fue utilizada para la detección multiplex y altamente eficiente de los objetivos de la OMG.
El objetivo general de este procedimiento es fabricar un casete pequeño y listo para usar que se pueda aplicar para la detección visual de múltiples ácidos nucleicos en una sola prueba fácil de operar. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la detección de ácidos nucleicos múltiples, como los organismos modificados genéticamente o la detección de OGM. Para limpiar los capilares, póngase un uniforme de laboratorio, gafas de seguridad y guantes de protección química.
Coloque los capilares en un vaso de precipitados. Limpiar los capilares con 30 mililitros de acetona durante cinco minutos para eliminar la materia orgánica. Y luego, lavar los capilares con agua desionizada.
A continuación, prepare la solución de piraña vertiendo unos diez mililitros de peróxido de hidrógeno en el vaso de precipitados. Luego, agregue 30 mililitros de ácido sulfúrico al peróxido de hidrógeno agitando lentamente para evitar el sobrecalentamiento. Asegúrese de que la solución cubra completamente los capilares durante al menos 30 minutos.
Luego, lava la solución de piraña con una gran cantidad de agua. Lave los capilares con etanol y agua desionizada durante cinco minutos cada uno. Secar los capilares en un horno de secado.
A continuación, pesa la base del PDMS y los reactivos de engranajes con una proporción de uno a uno en un tubo de 50 mililitros. Por lo general, mezcle cinco gramos de base de elastómero con cinco gramos de agente de curado de elastómero. Revuelva bien la mezcla durante unos cinco minutos con una varilla de vidrio.
Coloque el vaso de precipitados con el PDMS en una campana de vacío durante treinta minutos para desgasificarlo. Luego, vierta el PDMS lentamente en el cilindro del molde de acero inoxidable. Deje que el PDMS se cure durante tres horas en un horno de secado a 60 grados centígrados.
Después de curar el PDMS, retire el molde tirando del molde con cylindar. Retire el PDMS del cilindro cortando el margen del molde con un bisturí. Lave el PDMS tres veces con etanol y agua desionizada.
A continuación, seque el soporte PDMS con nitrógeno. Trate la superficie inferior del soporte PDMS para que sea hidrofóbica sumergiendo el soporte PDMS en una capa súper hidrofóbica durante un segundo. Luego, sécalo durante diez minutos a temperatura ambiente.
A continuación, inserte los capilares limpios de cuatro milímetros en los orificios del soporte PDMS, dejando cero punto cinco milímetros de los capilares fuera de la superficie superior del soporte PDMS. Asegúrese de que los extremos de los capilares estén al mismo nivel. Para tratar la superficie exterior de los capilares y la superficie superior del soporte PDMS para que sean hidrofóbicas, agregue 15 microlitros de la capa súper hidrofóbica sobre la superficie del soporte PDMS.
Seque al aire la matriz capilar modificada súper hidrofóbica. A continuación, agregue un punto seis microlitros de la mezcla de fijación de cebadores de un juego de cebadores para llenar un capilar correspondiente de la matriz capilar de acuerdo con un pedido prediseñado. Ancle el conjunto en un pocillo transparente de una placa estándar de fondo plano de 96 pocillos y seque el conjunto a 60 grados centígrados durante al menos dos horas.
Para ensamblar el casete, coloque un adaptador de carga en la parte superior de la matriz anclada. Asegúrese de que el plato del adaptador solo cubra las partes expuestas de los diez capilares. Para preparar la mezcla de reacción LAMP, agregue reactivos a la mezcla de acuerdo con el protocolo de texto y agite la mezcla de reacción durante cinco segundos después de agregar calcina.
Invierta suavemente el tubo veinte veces después de agregar la polimerasa Bst. Las trazas de ADN que existen en el medio ambiente se pueden eliminar limpiando antes con un mol por litro de ácido clorhídrico antes de entregar la mezcla LAMP. Aspire 20 microlitros de la mezcla de reacción LAMP con una punta estándar de 100 microlitros.
Inserte la punta en la entrada del adaptador de carga para bloquearlo. Inyecte suavemente la mezcla de reacción en el plato del adaptador. La mezcla de reacción llenará rápidamente el plato y luego cargará los capilares automáticamente a través de la fuerza capilar.
Retire el adaptador con la punta de bloqueo y selle el pozo con una película de sellado transparente compatible con PCR. A continuación, incube la matriz capilar en una incubadora a 63 grados centígrados durante una hora. Para adquirir imágenes de la emisión de fluorescencia, utilice una linterna UV para excitar la calcina disociada para que emita fluorescencia.
Capture imágenes desde la parte superior de la matriz capilar con una cámara digital o un teléfono inteligente. Al tomar una imagen, asegúrese de que la cámara se acerque al área de los capilares tanto como sea posible para obtener imágenes claras y de alta calidad. A continuación, abra la imagen mediante el software de análisis de imágenes.
Y luego seleccione imagen, molde, escala de grises, sí e imagen, molde, 16 bits, sí. Seleccione archivo, guardar como, formato, TIFF, para convertir la imagen a formato TIFF de 16 bits. Para extraer el valor de la intensidad de fluorescencia, abra el software de análisis de microarrays.
Arrastre la imagen en formato TIFF de 16 bits a la interfaz del software y, a continuación, seleccione la longitud de onda de 532 nanómetros y un color verde para mostrar la imagen. A continuación, cree un nuevo bloque para localizar la señal de fluorescencia de los capilares. Seleccione herramientas, nuevos bloques y, a continuación, coloque el número de columnas y filas como uno a uno y dos a cinco en las interfaces de bloques y características por separado.
Haga clic con el botón derecho y seleccione el modelo de características. A continuación, ajuste la ubicación y el diámetro para que se ajusten al área de fluorescencia de los capilares. Seleccione analizar para extraer el valor de la intensidad de fluorescencia.
Por último, seleccione archivo, guardar configuración como, para guardar los documentos del bloque. Luego, seleccione, archive, guarde los resultados como para guardar los resultados de la intensidad de fluorescencia. Aquí se muestra el diseño de la matriz capilar.
Capilares del uno al ocho, prefijados con juegos de cebadores LAMP. Los capilares nueve y diez representan dos, sin controles de cebador. Aquí se muestra la fotografía fluorescente para la detección de maíz genéticamente modificado, MON863, donde el color verde representa la amplificación positiva de LAMP.
Amplificación exitosa, solo se presenta en los capilares esperados uno, seis, siete y ocho, sin contaminación entre capilares en blanco. Esta fotografía fluorescente es para la detección de la mezcla de OGM. El color verde presentó la amplificación positiva de LAMP.
La amplificación exitosa solo se presentó en los capilares esperados uno, cuatro, cinco, seis, siete y ocho sin contaminación entre los capilares en blanco. La fotografía fluorescente que se muestra aquí es para la detección de maíz no modificado genéticamente, con el color verde que presenta la amplificación LAMP positiva. La amplificación exitosa solo se presenta en los ocho capilares esperados, y sin contaminación entre los capilares en blanco.
Una vez dominado, este procedimiento de detección se puede realizar en un punto cinco horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar un casete basado en capilares para realizar la detección de múltiples ácidos nucleicos.
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Visión general
Este protocolo describe la fabricación de un pequeño casete listo para usar para la detección visual de múltiples ácidos nucleicos en una sola prueba fácil de operar. Este método es particularmente útil para detectar organismos genéticamente modificados (OGM) utilizando un conjunto capilar para la detección múltiple.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biotecnología
- Biología molecular
- Ingeniería genética
Antecedentes
- La detección de múltiples ácidos nucleicos es crucial en varios campos.
- Los organismos genéticamente modificados (OGM) plantean desafíos significativos en la seguridad alimentaria.
- Se necesitan métodos de detección eficientes para un análisis rápido.
- Los conjuntos capilares pueden mejorar las capacidades de detección múltiple.
Propósito del estudio
- Desarrollar un casete fácil de usar para la detección de ácidos nucleicos.
- Mejorar la eficiencia de la detección de OGM.
- Facilitar la investigación en la detección múltiple de ácidos nucleicos.
Métodos utilizados
- Fabricación de un pequeño casete para la detección de ácidos nucleicos.
- Uso de conjuntos capilares para la detección múltiple.
- Limpieza de capilares con acetona y agua desionizada.
- Métodos de detección visual para facilidad de uso.
Principales resultados
- El casete permite la detección de múltiples ácidos nucleicos simultáneamente.
- Los conjuntos capilares mejoran la eficiencia del proceso de detección.
- El método es sencillo y fácil de usar.
- Aplicaciones potenciales en la detección de OGM y otros campos.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un enfoque novedoso para la detección de ácidos nucleicos.
- El casete desarrollado es efectivo para pruebas múltiples.
- La investigación futura puede expandir sus aplicaciones en biotecnología.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This platform enables multiplex nucleic acid detection in a single cassette, supporting high-throughput screening needs in GMO testing and microbial monitoring. By combining capillary array technology with LAMP amplification, it reduces assay complexity and resource requirements while maintaining specificity and sensitivity. The visual readout via UV illumination allows rapid, instrument-free results, aligning with decentralized testing demands in biopharma and agricultural biotechnology workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables simultaneous interrogation of multiple genetic targets for hypothesis testing in pathway analysis.
- Operational Value: Reduces reagent consumption and hands-on time through capillary-force-driven sample loading.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized, isolated reaction chambers for reproducible amplification across targets.
- Operational Value: Supports parallel processing of up to eight assays with internal controls for assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates detection of genetically modified elements in complex matrices, supporting GMO safety assessment.
- Operational Value: Enables field-deployable testing with minimal equipment, suitable for process monitoring in biomanufacturing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where rapid nucleic acid profiling informs target selection and assay readiness.
- Discovery Biology: Allows parallel testing of gene variants or constructs to clarify functional roles in biological pathways.
- Screening: Generates quantitative fluorescence intensity data for hit confirmation and cross-capillary comparison.
- Analytics: Outputs enable signal threshold setting and contamination assessment via blank capillary controls.
- Translational Research: Supports continuity from target identification to preclinical validation through consistent nucleic acid readouts.
- Enterprise Reuse: Cassette design allows reuse across multiple nucleic acid panels with reconfiguration of primer sets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in multiplex assays by minimizing cross-talk and false positives.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized capillary preparation and isolated reaction volumes.
- Strategic Value: Reduces time-to-result for critical decision points in GMO detection and microbial monitoring.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on simultaneous multi-parameter readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface treatment and capillary array assembly for hydrophobic/hydrophilic patterning.
- Depends on access to vacuum degassing and thermal curing equipment for PDMS microfluidic fabrication.
- Necessitates standardization of primer fixation protocols across capillary arrays for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending beyond eight targets due to capillary array limitations.
- Relies on user training for consistent UV excitation and image capture to ensure fluorescence quantification accuracy.
