Detección visual de los ácidos nucleicos múltiples en un arreglo de capilares
15 de noviembre de 2017
Este protocolo describe la fabricación de una cinta pequeña, lista para usar que se puede aplicar para detección visual de varios ácidos nucleicos en una prueba individual, que es fácil de operar. En este enfoque, una gama capilar fue utilizada para la detección multiplex y altamente eficiente de los objetivos de la OMG.
El objetivo general de este procedimiento es fabricar un casete pequeño y listo para usar que se pueda aplicar para la detección visual de múltiples ácidos nucleicos en una sola prueba fácil de operar. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la detección de ácidos nucleicos múltiples, como los organismos modificados genéticamente o la detección de OGM. Para limpiar los capilares, póngase un uniforme de laboratorio, gafas de seguridad y guantes de protección química.
Coloque los capilares en un vaso de precipitados. Limpiar los capilares con 30 mililitros de acetona durante cinco minutos para eliminar la materia orgánica. Y luego, lavar los capilares con agua desionizada.
A continuación, prepare la solución de piraña vertiendo unos diez mililitros de peróxido de hidrógeno en el vaso de precipitados. Luego, agregue 30 mililitros de ácido sulfúrico al peróxido de hidrógeno agitando lentamente para evitar el sobrecalentamiento. Asegúrese de que la solución cubra completamente los capilares durante al menos 30 minutos.
Luego, lava la solución de piraña con una gran cantidad de agua. Lave los capilares con etanol y agua desionizada durante cinco minutos cada uno. Secar los capilares en un horno de secado.
A continuación, pesa la base del PDMS y los reactivos de engranajes con una proporción de uno a uno en un tubo de 50 mililitros. Por lo general, mezcle cinco gramos de base de elastómero con cinco gramos de agente de curado de elastómero. Revuelva bien la mezcla durante unos cinco minutos con una varilla de vidrio.
Coloque el vaso de precipitados con el PDMS en una campana de vacío durante treinta minutos para desgasificarlo. Luego, vierta el PDMS lentamente en el cilindro del molde de acero inoxidable. Deje que el PDMS se cure durante tres horas en un horno de secado a 60 grados centígrados.
Después de curar el PDMS, retire el molde tirando del molde con cylindar. Retire el PDMS del cilindro cortando el margen del molde con un bisturí. Lave el PDMS tres veces con etanol y agua desionizada.
A continuación, seque el soporte PDMS con nitrógeno. Trate la superficie inferior del soporte PDMS para que sea hidrofóbica sumergiendo el soporte PDMS en una capa súper hidrofóbica durante un segundo. Luego, sécalo durante diez minutos a temperatura ambiente.
A continuación, inserte los capilares limpios de cuatro milímetros en los orificios del soporte PDMS, dejando cero punto cinco milímetros de los capilares fuera de la superficie superior del soporte PDMS. Asegúrese de que los extremos de los capilares estén al mismo nivel. Para tratar la superficie exterior de los capilares y la superficie superior del soporte PDMS para que sean hidrofóbicas, agregue 15 microlitros de la capa súper hidrofóbica sobre la superficie del soporte PDMS.
Seque al aire la matriz capilar modificada súper hidrofóbica. A continuación, agregue un punto seis microlitros de la mezcla de fijación de cebadores de un juego de cebadores para llenar un capilar correspondiente de la matriz capilar de acuerdo con un pedido prediseñado. Ancle el conjunto en un pocillo transparente de una placa estándar de fondo plano de 96 pocillos y seque el conjunto a 60 grados centígrados durante al menos dos horas.
Para ensamblar el casete, coloque un adaptador de carga en la parte superior de la matriz anclada. Asegúrese de que el plato del adaptador solo cubra las partes expuestas de los diez capilares. Para preparar la mezcla de reacción LAMP, agregue reactivos a la mezcla de acuerdo con el protocolo de texto y agite la mezcla de reacción durante cinco segundos después de agregar calcina.
Invierta suavemente el tubo veinte veces después de agregar la polimerasa Bst. Las trazas de ADN que existen en el medio ambiente se pueden eliminar limpiando antes con un mol por litro de ácido clorhídrico antes de entregar la mezcla LAMP. Aspire 20 microlitros de la mezcla de reacción LAMP con una punta estándar de 100 microlitros.
Inserte la punta en la entrada del adaptador de carga para bloquearlo. Inyecte suavemente la mezcla de reacción en el plato del adaptador. La mezcla de reacción llenará rápidamente el plato y luego cargará los capilares automáticamente a través de la fuerza capilar.
Retire el adaptador con la punta de bloqueo y selle el pozo con una película de sellado transparente compatible con PCR. A continuación, incube la matriz capilar en una incubadora a 63 grados centígrados durante una hora. Para adquirir imágenes de la emisión de fluorescencia, utilice una linterna UV para excitar la calcina disociada para que emita fluorescencia.
Capture imágenes desde la parte superior de la matriz capilar con una cámara digital o un teléfono inteligente. Al tomar una imagen, asegúrese de que la cámara se acerque al área de los capilares tanto como sea posible para obtener imágenes claras y de alta calidad. A continuación, abra la imagen mediante el software de análisis de imágenes.
Y luego seleccione imagen, molde, escala de grises, sí e imagen, molde, 16 bits, sí. Seleccione archivo, guardar como, formato, TIFF, para convertir la imagen a formato TIFF de 16 bits. Para extraer el valor de la intensidad de fluorescencia, abra el software de análisis de microarrays.
Arrastre la imagen en formato TIFF de 16 bits a la interfaz del software y, a continuación, seleccione la longitud de onda de 532 nanómetros y un color verde para mostrar la imagen. A continuación, cree un nuevo bloque para localizar la señal de fluorescencia de los capilares. Seleccione herramientas, nuevos bloques y, a continuación, coloque el número de columnas y filas como uno a uno y dos a cinco en las interfaces de bloques y características por separado.
Haga clic con el botón derecho y seleccione el modelo de características. A continuación, ajuste la ubicación y el diámetro para que se ajusten al área de fluorescencia de los capilares. Seleccione analizar para extraer el valor de la intensidad de fluorescencia.
Por último, seleccione archivo, guardar configuración como, para guardar los documentos del bloque. Luego, seleccione, archive, guarde los resultados como para guardar los resultados de la intensidad de fluorescencia. Aquí se muestra el diseño de la matriz capilar.
Capilares del uno al ocho, prefijados con juegos de cebadores LAMP. Los capilares nueve y diez representan dos, sin controles de cebador. Aquí se muestra la fotografía fluorescente para la detección de maíz genéticamente modificado, MON863, donde el color verde representa la amplificación positiva de LAMP.
Amplificación exitosa, solo se presenta en los capilares esperados uno, seis, siete y ocho, sin contaminación entre capilares en blanco. Esta fotografía fluorescente es para la detección de la mezcla de OGM. El color verde presentó la amplificación positiva de LAMP.
La amplificación exitosa solo se presentó en los capilares esperados uno, cuatro, cinco, seis, siete y ocho sin contaminación entre los capilares en blanco. La fotografía fluorescente que se muestra aquí es para la detección de maíz no modificado genéticamente, con el color verde que presenta la amplificación LAMP positiva. La amplificación exitosa solo se presenta en los ocho capilares esperados, y sin contaminación entre los capilares en blanco.
Una vez dominado, este procedimiento de detección se puede realizar en un punto cinco horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar un casete basado en capilares para realizar la detección de múltiples ácidos nucleicos.
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Descripción general
Este protocolo describe la fabricación de un pequeño cassette listo para usar, destinado a la detección visual de múltiples ácidos nucleicos en una única prueba de fácil operación. Este método es especialmente útil para detectar organismos modificados genéticamente (GMOs) utilizando un arreglo capilar para detección múltiple.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biotecnología
- Biología molecular
- Ingeniería genética
Antecedentes
- La detección de múltiples ácidos nucleicos es fundamental en diversos campos.
- Los organismos modificados genéticamente (OGM) representan desafíos significativos en la seguridad alimentaria.
- Se necesitan métodos de detección eficientes para análisis rápidos.
- Los arreglos capilares pueden mejorar las capacidades de detección multiplex.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una caja registradora de fácil uso para la detección de ácidos nucleicos.
- Mejorar la eficiencia de la detección de organismos modificados genéticamente (OMG).
- Facilitar la investigación en detección multiplex de ácidos nucleicos.
Métodos Utilizados
- Elaboración de un pequeño cassette para la detección de ácidos nucleicos.
- Uso de matrices capilares para detección multiplex.
- Limpieza de los capilares con acetona y agua desionizada.
- Métodos de detección visual para facilitar su uso.
Resultados principales
- El casete permite la detección simultánea de múltiples ácidos nucleicos.
- Los arreglos capilares mejoran la eficiencia del proceso de detección.
- El método es sencillo y fácil de usar.
- Aplicaciones potenciales en la detección de organismos modificados genéticamente y otros campos.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un enfoque novedoso para la detección de ácidos nucleicos.
- El cassette desarrollado es eficaz para pruebas multiplex.
- La investigación futura puede ampliar sus aplicaciones en biotecnología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta plataforma permite la detección multiplex de ácidos nucleicos en un solo cartucho, satisfaciendo las necesidades de cribado de alto rendimiento en pruebas de OMG y monitoreo microbiano. Al combinar la tecnología de matriz capilar con la amplificación LAMP, reduce la complejidad del ensayo y los requisitos de recursos, manteniendo la especificidad y sensibilidad. La lectura visual mediante iluminación UV permite obtener resultados rápidos sin necesidad de instrumentos, adecuándose a las demandas de pruebas descentralizadas en los flujos de trabajo de biofarmacia y biotecnología agrícola.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación simultánea de múltiples objetivos genéticos para la prueba de hipótesis en el análisis de vías.
- Valor operativo: Reduce el consumo de reactivos y el tiempo de manipulación mediante la carga de muestras impulsada por fuerzas capilares.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Proporciona cámaras de reacción estandarizadas y aisladas para la amplificación reproducible entre diferentes dianas.
- Valor operativo: Permite el procesamiento paralelo de hasta ocho ensayos con controles internos para la validación del ensayo.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Valor Científico: Facilita la detección de elementos modificados genéticamente en matrices complejas, lo que apoya la evaluación de la seguridad de organismos modificados genéticamente (OMG).
- Valor Operativo: Permite pruebas implementables en campo con equipo mínimo, adecuadas para el monitoreo de procesos en la biofabricación.
Integración de la Secuencia de Trabajo y Flujo de Trabajo
El método se integra en flujos de trabajo de descubrimiento temprano a preclínicos, donde el perfilado rápido de ácidos nucleicos orienta la selección de dianas y la preparación de ensayos.
- Biología del Descubrimiento: Permite la prueba paralela de variantes o constructos génicos para aclarar sus funciones en vías biológicas.
- Selección: Genera datos cuantitativos de intensidad de fluorescencia para la confirmación de resultados positivos y la comparación entre capilares.
- Análisis: Las salidas permiten establecer umbrales de señal y evaluar contaminación mediante controles de capilares en blanco.
- Investigación Traducional: Facilita la continuidad desde la identificación del blanco hasta la validación preclínica mediante lecturas consistentes de ácidos nucleicos.
- Reutilización Empresarial: El diseño del casete permite su reutilización en múltiples paneles de ácidos nucleicos mediante la reconfiguración de conjuntos de cebadores.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en ensayos multiplex al minimizar la interferencia cruzada y los falsos positivos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante la preparación estandarizada de capilares y volúmenes de reacción aislados.
- Valor estratégico: Reduce el tiempo hasta el resultado en puntos de decisión críticos para la detección de organismos modificados genéticamente y el monitoreo microbiano.
- Impacto en el portafolio: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en lecturas simultáneas de múltiples parámetros.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en tratamientos superficiales y ensamblaje de matrices de capilares para el diseño hidrofóbico/hidrofílico.
- Depende del acceso a equipos de desgasificación al vacío y curado térmico para la fabricación de microfluidos de PDMS.
- Necesita la estandarización de protocolos de fijación de cebadores en las matrices de capilares para obtener resultados reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse más allá de ocho dianas debido a las limitaciones de la matriz de capilares.
- Requiere capacitación del usuario para garantizar una excitación con luz UV y una captura de imágenes consistentes, asegurando así la precisión en la cuantificación de fluorescencia.
