Dirigida la inmovilización de la proteína ósea morfogenética 2 a superficies sólidas por química del tecleo

El objetivo general de este estudio es la producción robusta y reproducible de un andamio osteogénico mediante el acoplamiento covalente y dirigido al sitio de una variante BMP2 de nuevo diseño mediante química de clic. Este método puede ayudar a superar los problemas relacionados con las técnicas de uso común para el tratamiento de la no cicatrización de los defectos de los huesos largos. Los métodos de absorción o encapsulación requieren cantidades súper fisiológicas de BMP2 que provocan varios efectos secundarios graves.

La principal ventaja de esta técnica es utilizar cantidades más bajas de la variante BMP2 de nuevo diseño que se une covalentemente a los andamios de forma lateral. Propagar una sola colonia durante la noche en 50 mililitros de medio LB con 50 microgramos por mililitro de kanamicina y 100 microgramos por mililitro de ampicilina a 37 grados Celsius. Diluya los cultivos nocturnos del uno al 20 en 800 mililitros de un excelente medio de caldo complementado con 50 microgramos por mililitro de kanamicina y 100 microgramos por mililitro de ampicilina.

Cultive los cultivos a 37 grados centígrados hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,7. A continuación, añada propofol L-licina hasta una concentración final de 10 milimolares. Inducir la expresión génica mediante la adición de IPTG para una concentración final de un milimolar.

Cultive el cultivo a 37 grados centígrados durante 16 horas en un agitador orbital a 180 RPM. Después de la incubación, centrifugar todo el cultivo a 9.000 veces g durante 30 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet bacteriano en 30 mililitros de tampón TBSE.

Pese un vaso de precipitados centrífugo vacío y transfiera el pellet resuspendido al vaso vacío. A continuación, centrifugar el pellet resuspendido a 6,360 veces g durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y pese el vaso de precipitados con el pellet.

Reste el peso del vaso vacío para calcular el peso de la bolita. A continuación, vuelva a suspender el pellet en el tampón STE. Utilice 200 mililitros de tampón STE por cada 10 gramos de pellet.

Sonicar la suspensión en hielo antes de centrifugar a 6,360 veces g durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y pese el pellet. Después de repetir cuatro veces los pasos de sonicación y centrifugación, vuelva a suspender el pellet en 100 mililitros de tampón TBS.

Centrifugar a 6, 360 veces g durante 20 minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y pese el pellet. Vuelva a suspender el pellet en el tampón de nucleasa con nucleasa recién añadida utilizando 10 mililitros por gramo de pellet.

Incube la suspensión durante la noche a temperatura ambiente en una placa de agitación a 30 RPM. Al día siguiente, agregue Triton Buffer a la suspensión. El volumen de Triton Buffer a añadir corresponde a una parte de 0,5 volúmenes de la suspensión.

Después de incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, centrifugar la suspensión a 6, 360 veces g durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y pese el pellet. A continuación, vuelva a suspender el pellet en TE Buffer utilizando ocho mililitros por gramo de pellet.

Después de centrifugar como antes, deseche el sobrenadante y pese el pellet. Ahora vuelva a suspender el pellet agregando cuatro mililitros por gramo de acitato de sodio de 25 milimolares, PH5, y cinco mililitros por gramo de cloruro de guanidinio de seis molares con un DTT milimolar. Incubar la suspensión durante la noche a cuatro grados centígrados en una placa de agitación.

Después de la centrifugación a 75.500 veces g durante 20 minutos, el sobrenadante contiene la proteína BMP2 monomérica desplegada. Recoja el sobrenadante y concentre este extracto a una densidad óptica por mililitro de 20 utilizando una membrana de corte de peso molecular de tres kilodalton en una celda de concentración. Agregue los monómeros concentrados en gotas individuales al tampón de renaturalización mientras revuelve.

A continuación, incubar la solución a temperatura ambiente durante 120 horas en la oscuridad. Ajuste el pH de la solución a 3.0 usando ácido clorhídrico concentrado antes de dializar la solución contra un milimolar de ácido clorhídrico. Concentrar la solución dializada utilizando una membrana de corte de peso molecular de 10 kilodalton en una celda de concentración.

A continuación, cargue la solución proteica en la columna equilibrada, diluya las fracciones utilizando un gradiente lineal de tampón B, recogiendo fracciones de dos mililitros. Analice 20 microlitros de cada fracción mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS seguida de tinción con azul brillante de Coomassie para determinar las fracciones que contienen monómeros y las fracciones que contienen dímeros. A continuación, tire del dímero que contiene fracciones.

Diálisis la piscina de dímero que contiene fracciones durante la noche a cuatro grados centígrados frente a cinco litros de ácido clorhídrico milimolar. Concentre el producto utilizando una unidad de filtro centrífugo concentrador de 10 kilodalton antes de analizar el producto final mediante tinción SDS-PAGE y Coomassie Brilliant Blue. Combine 20 micromolares del tipo BMP2-K3Plk o BMP2-while que se utiliza como control negativo con 20 microlitros de perlas de agarosa activadas con azida en tampón de reacción a un volumen total de 500 microlitros.

Incubar durante dos horas a temperatura ambiente en una mezcla rotativa a 20 RPM. Detenga la reacción añadiendo una concentración final de cinco milimolares de EDTA. Incubar la solución a temperatura ambiente durante 15 minutos en un mezclador giratorio a 20 RPM.

A continuación, centrifugar las muestras a 20.000 veces g durante un minuto a temperatura ambiente y recoger los sobrenadantes. A continuación, lave el pellet que contiene las perlas con 1.000 microlitros de HBS 500 Buffer. Centrifugar la muestra a 20.000 veces g durante un minuto a temperatura ambiente y recoger el sobrenadante.

Repita este procedimiento de lavado dos veces más con HBS 500 Buffer, tres veces con cloruro de magnesio de cuatro molares y dos veces con PBS, recogiendo el sobrenadante cada vez. Almacene las perlas acopladas en 1.000 microlitros de PBS a cuatro grados centígrados. Realice el ensayo ALP como se describe en el protocolo de texto.

Para realizar la tinción de ALP, se cultivaron células promioblásticas C2C12 en DMEM con un 10% de suero fetal de ternero, así como 100 unidades por mililitro de penicilina G y estreptomicina a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada al 5% de dióxido de carbono. Alimente células C2C12 a una densidad de 30.000 células por pocillo en una microplaca de 96 pocillos. Después de dejar que las celdas se adhieran durante la noche, retire el medio y agregue 20 microlitros por pocillo de perlas acopladas PMB2-K3PLK.

A continuación, añada 20 microlitros de agarosa de bajo punto de fusión al 0,4% en cada pocillo. Centrifugar la microplaca de 96 pocillos a 2.000 veces g durante cinco minutos a 20 grados centígrados. Luego agregue 80 microlitros del mismo medio.

Incubar a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada al 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. Después de la incubación, retire el medio teniendo cuidado de no desprender la agarosa solidificada al 0,4%. Agregue 100 microlitros por pocillo de una solución subrecta MBT-BCIP de un paso.

Analice la tinción de fosfatidato alcalino utilizando microscopía óptica inmediatamente después de que la tinción púrpura se haga evidente. Utilice la microscopía de campo claro y tome fotografías. La bioactividad de la variante BMP2-K3Plk recién producida se valida mediante la inducción de la expresión génica de la fosfatasa alcalina en células C2C12.

La prueba in vitro muestra niveles similares de expresión génica de fosfatasa alcalina inducidos por el tipo BMP2 o BMP2-K3Plk. Las perlas recubiertas con BMP2-K3Plk a través de la adición de ciclocíclico alquino de azida catalizada por cobertura produjeron fluorescentes cuando se incubaron con el ecodominio 1A del receptor BMP dimarcado. La unión del receptor BMP 1A al BMP2-K3Plk confirma la retención de la bioactividad después del acoplamiento.

La bioactividad de las perlas funcionalizadas BMP2-K3Plk se demostró mediante tinción mediada por ALP. La tinción se produjo solo en aquellas células que estaban en contacto directo con las perlas funcionalizadas BMP2-K3Plk, lo que confirma que la proteína está efectivamente unida covalentemente a las perlas y no solo se absorbe. Si la proteína se hubiera liberado en la situación de absorción, se habría observado una tinción más dispersa a distancias mayores, como se observa aquí para la tinción de fosfatasa alcalina tras el tratamiento con BMP2-K2Plk soluble.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar y producir proteínas biológicamente activas por expansión genética y cómo acoplar covalentemente una proteína ficticia a microesferas mediante una reacción química de clic. La generación de varianza proteica por expansión genética permite, en principio, la introducción de aminoácidos artificiales en cualquier posición de la secuencia proteica primaria. La introducción de una mutación en la secuencia BMP2 puede afectar la eficiencia del repliegue y también puede cambiar los parámetros de la proteína.

La producción de BMP2-K3Plk requirió una modificación del método establecido para la expresión del tipo BMP2. La BMP2-K3Plk producida mostró una actividad biológica comparable a la de la proteína de tipo while. Nuestro enfoque para acoplar covalentemente la variante BMP2 a una perla de agarosa ficticia por química de clic pudo realizarse con alta eficiencia, lo que resultó en perlas ficticias, figurando una diferenciación genética in vitro.

Debe garantizarse una protección estándar de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio.