In Vitro Ensayo de la sumoilación estudiar SUMO E3 ligasa actividad
29 de enero de 2018
A diferencia de ligasas de ubiquitina ligasas E3 SUMO algunos han sido identificados. Este modificado en vitro protocolo de sumoilación es capaz de identificar nuevos SUMO E3 ligasas por un ensayo de reconstitución en vitro .
El objetivo general de este experimento es verificar una proteína de interés que pueda ser SUMOilada o que sea una lygasa SUMO E3. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la SUMOilación, como la identificación de la lygasa SUMO E3. La principal ventaja de esta técnica es que podría utilizarse para la investigación de la especificidad de la ligasa SUMO E3 hacia diferentes formas iso de SUMO.
El demostrador del procedimiento será Wan-Shan Young, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para purificar la etiqueta K-bZIP, primero incube 10 mililitros de lisado celular con 50 microlitros de perlas magnéticas marcadas con anticuerpos en un tubo de polipropileno de 14 mililitros. Luego gire el tubo a 50 revoluciones por minuto a cuatro grados centígrados durante tres horas en un mezclador de suspensión.
Una vez capturada la proteína, centrifugar la muestra a 800 veces g durante 30 segundos a cuatro grados centígrados para pellet las perlas. Deseche todo menos un mililitro de sobrenadante para volver a suspender las cuentas. Y transfiera las perlas disueltas a un tubo de 1,5 mililitros.
Para lavar las proteínas capturadas, coloque el tubo con las perlas en un soporte magnético. Espere unos tres segundos para que las cuentas se adhieran a las paredes laterales del tubo y luego retire el sobrenadante. Para lavar las perlas, agregue un mililitro de tampón de lisis en el tubo de 1,5 mililitros.
A continuación, invierta el tubo diez veces. A continuación, coloque el tubo de 1,5 mililitros en el soporte magnético y retire el sobrenadante una vez que las cuentas se adhieran a las paredes. Para volver a lavar las perlas, agregue un mililitro de solución salina tamponada con fosfato al tubo de 1,5 mililitros e inviértalo diez veces.
A continuación, transfiera el tubo al soporte magnético y retire el sobrenadante una vez que las cuentas se hayan adherido a las paredes laterales. Para eluir las proteínas marcadas con K-bZIP de las perlas magnéticas marcadas con anticuerpos, agregue 100 microlitros a 150 microgramos por mililitro de octapéptido diluido en solución salina tamponada con fosfato en el tubo de 1,5 mililitros. Luego gire el tubo en un mezclador de suspensión a 50 revoluciones por minuto durante diez minutos a temperatura ambiente.
Transfiera el tubo al soporte magnético. Y luego recoja el K-bZIP que contiene sobrenadante. A continuación, para analizar la etiqueta K-bZIP purificada, someta de uno a cinco microlitros de la proteína purificada a la página SDS, seguida de la tinción con azul de Coomassie.
Cargue 0,5, 1 y 2 microgramos de albúmina sérica bovina como patrones en el gel para cuantificar la concentración de K-bZIP. Mientras procesa la imagen en la imagen J.Next, diluya el K-bZIP purificado en solución salina tamponada con fosfato. Para alcanzar una concentración final de 100 nanogramos por microlitro.
Y almacenar a menos 80 grados centígrados en pequeñas alícuotas. Agregue tres microlitros de 100 nanogramos por microlitro de K-bZIP marcado purificado en la reacción de mezcla maestra de SUMOilation in vitro. A continuación, mezcle suavemente el contenido de la mezcla maestra e incube a 30 grados centígrados durante tres horas.
A continuación, agregue 20 microlitros de página SDS 2X con tampón de carga para detener la reacción. A continuación, calienta las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos para desnaturalizar la proteína. A continuación, cargue 20 microlitros de la muestra en un gel de página 10%SDS.
Y haz funcionar el gel a 80 voltios durante unos 120 minutos hasta que el tinte llegue al fondo del gel. Una vez finalizada la electroparesia, desconecte el aparato de gel. Y transfiera el gel en un tampón de transferencia semiseco durante cinco minutos.
A continuación, remoje la membrana de PVDF en otro recipiente lleno de metanol durante un minuto. Retire la membrana de PVDF del metanol y sumérjala en un tampón de transferencia semiseco. A continuación, agite suavemente la membrana durante cinco minutos.
Retire la cubierta de seguridad del aparato electroforético semiseco. Humedece previamente un papel de filtro. Y prepare un sándwich de gel en la parte inferior del ánodo de platino.
Después de asegurar la placa del cátodo en la cubierta de seguridad, haga funcionar el blot a 15 voltios de corriente constante durante 90 minutos. A continuación, apague la fuente de alimentación y extraiga la membrana de PVDF después de desconectar el aparato semiseco. Ahora bloquee la membrana de PVDF con tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente en un agitador orbital a 30 revoluciones por minuto.
A continuación, hibridar la membrana de PVDF con el anticuerpo anti-p53 y el tampón de bloqueo durante 12 a 16 horas a cuatro grados centígrados en un mezclador de suspensión a 30 revoluciones por minuto. A continuación, saque la membrana de PVDF y transfiérala a un recipiente lleno de solución salina tamponada con Tris tween 20. A continuación, sumerja la membrana de PVDF en solución salina tween 20 tamponada con Tris durante 30 minutos en el agitador orbital a 45 revoluciones por minuto.
A continuación, hibridar la membrana de PVDF con el anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente en el mezclador de suspensión a 30 revoluciones por minuto. A continuación, lave la membrana de PVDF con solución salina tamponada Tris 20 veces antes. Después del lavado, remoje la membrana de PVDF en solución salina tamponada Tris tween 20 durante 30 minutos en el mezclador de suspensión a 45 revoluciones por minuto.
A continuación, sustituya la solución salina tamponada Tris tween 20 por solución salina tamponada con fosfato. Para conservar la membrana de PVDF a cuatro grados centígrados durante un máximo de 12 horas. A continuación, mezcle los reactivos de sustrato quimioluminiscente mejorados uno y dos en una proporción de uno a uno.
A continuación, retire la membrana de PVDF de la solución salina tamponada con fosfato y seque brevemente con las cavidades de perforación para absorber el exceso de humedad. Agregue inmediatamente 400 microlitros del reactivo quimioluminiscente a la superficie de la membrana y espere de tres a cinco minutos. Seque brevemente para drenar el exceso de reactivo quimioluminiscente, evitando que la membrana se seque por completo.
Utilice el sistema de imágenes de Luminescent para exponer la mancha. En este caso, se realizó un análisis de inmunotransferencia para mostrar la concentración de la enzima Ubc9 necesaria para SUMOilar los objetivos de p53. Esto demuestra que 1/2 y 1/5 de la concentración de la enzima Ubc9 puede SUMOilar suficientemente la enzima p53 en un ensayo de SUMOilación in vitro utilizando péptidos SUMO 1 y SUMO 2.
Para analizar el p53 SUMOilado, la membrana se probó con el anticuerpo anti-p53. Se realizó un análisis de inmunotransferencia similar para mostrar que se requiere la mitad de E1 y una concentración de 1/10 de las enzimas Ubc9 para SUMOilar el objetivo p53 en un ensayo de SUMOilación in vitro utilizando péptidos SUMO 1, SUMO 2 y SUMO 3. Aquí, la membrana se tiñó con Coomassie para mostrar la proteína K-bZIP purificada.
Se utilizó el sistema de expresión de Baculovirus para expresar el K-bZIP purificado que se analizó en la página SDS con albúmina sérica bovina como estándar para la comparación. También se realizó un análisis adicional de inmunotransferencia que mostró que al aumentar la concentración de K-bZIP se cataliza la SUMOilación de p53 en presencia de la mitad de la cantidad de E1 y 1/10 de la cantidad de enzimas Ubc9, respectivamente. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todo el reactivo para el ensayo de SUMOilación in vitro en hielo, y hacer la dilución en serie en lugar de en una dilución gigante. Encuentre este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la sobreexpresión de SUMOlygase, para verificar la SUMOilación in vitro. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la SUMOilación exploraran más SUMOlygase y validaran su poder de especificidad.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar una lygasa SUMO e3 utilizando un ensayo de simulación in vitro.
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Descripción general
Este estudio presenta un protocolo modificado de SUMOilación in vitro diseñado para identificar nuevas ligasas SUMO E3. El método permite investigar la especificidad de las ligasas SUMO E3 hacia diferentes isoformas de SUMO.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Modificación de proteínas
Antecedentes
- La SUMOilación es un proceso de modificación postraduccional.
- Se han identificado pocas ligasas SUMO E3 en comparación con las ligasas de ubiquitina.
- La identificación de las ligasas SUMO E3 es crucial para comprender sus funciones biológicas.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar los métodos de identificación de estas ligasas.
Objetivo del estudio
- Verificar proteínas que puedan ser SUMOiladas o actuar como ligasas E3 de SUMO.
- Responder preguntas clave en el campo de la SUMOilación.
- Desarrollar un método para identificar ligasas E3 de SUMO.
Métodos Utilizados
- Ensayo de reconstrucción in vitro para la SUMOilación.
- Purificación de la etiqueta K-bZIP mediante perlas magnéticas marcadas con anticuerpo.
- Incubación del lisado celular con perlas magnéticas.
- Rotación del tubo en un mezclador de suspensión a baja temperatura.
Resultados principales
- Identificación exitosa de nuevas ligasas E3 de SUMO.
- Demostación de la eficacia del protocolo en un entorno de laboratorio.
- Información sobre la especificidad de las ligasas E3 de SUMO hacia las isoformas de SUMO.
- Aplicaciones potenciales en investigaciones futuras sobre SUMOilación.
Conclusiones
- El protocolo modificado es una herramienta valiosa para la identificación de ligasas E3 de SUMO.
- Abre nuevas vías para investigaciones futuras sobre los mecanismos de SUMOilación.
- Estudios posteriores pueden ampliar el conocimiento sobre la especificidad de las ligasas E3 de SUMO.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación de ligasas SUMO E3 y su especificidad de isoforma es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas durante la fase inicial del descubrimiento. Este ensayo de reconstitución in vitro permite la investigación mecanicista de las vías de señalización dependientes de SUMO, lo que respalda la confianza predictiva en la prueba de hipótesis terapéuticas. El método proporciona un enfoque escalable y estandarizado para evaluar la actividad de las ligasas E3, aportando información directa para la identificación de compuestos líderes y las decisiones de selección de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la función de las ligasas E3 de SUMO y su especificidad hacia sustratos, a fin de esclarecer mecanismos de señalización relevantes para enfermedades.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reconstituido para validar ligasas E3 putativas mediante componentes purificados, reduciendo así los falsos positivos derivados de la complejidad celular.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos en dianas al demostrar la actividad enzimática directa sobre sustratos conocidos como p53 en condiciones definidas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de la conjugación de SUMO entre parálogos de SUMO (SUMO1/2/3) para perfilar la preferencia de isoformas de ligasas.
- Valor operativo: Utiliza condiciones y controles estandarizados (titulación de E1, Ubc9) para garantizar la reproducibilidad entre laboratorios y campañas de cribado.
- Valor de escalabilidad: Compatible con formatos de 96 pocillos para la evaluación de mediana escala de bibliotecas de ligasas o variantes mutantes.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la actividad de la ligasa SUMO E3 con resultados funcionales en modelos de enfermedad mediante la validación de la modificación de sustratos fisiopatológicos.
- Valor operativo: Permite el análisis estructura-función de dominios de ligasa mediante mutagénesis guiada por estructura acoplada a lecturas de actividad.
- Valor traslacional: Apoya el desarrollo de biomarcadores al confirmar el estado de SUMOilación de los objetivos en sistemas preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, proporcionando una confirmación bioquímica ortogonal del mecanismo antes del cribado celular o fenotípico.
- Biología del Descubrimiento: Prueba hipótesis terapéuticas mediante la confirmación de la modulación directa de la SUMOilación en objetivos oncogénicos o neurodegenerativos.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas dependientes de enzimas, adecuadas para la confirmación de compuestos activos en ensayos de moduladores de ligasas E3.
- Análisis: Mide la formación de conjugados de SUMO mediante inmunotransferencia, permitiendo la comparación de la potencia de las ligasas y su selectividad por isoformas.
- Investigación Traducional: Valida la interacción con el objetivo en contextos relevantes para la enfermedad, demostrando la SUMOilación de sustratos clínicamente pertinentes.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para caracterizar ligasas E3 de SUMO en múltiples proyectos y clases de objetivos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la modulación de la vía SUMO, aumentando la confianza en la selección de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza la evaluación de la actividad de la ligasa E3, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios y la comparabilidad de los datos.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia directa de la compatibilidad entre ligasa y sustrato, reduciendo el abandono en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de programas dirigidos a SUMO basada en datos mecanicistas validados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la purificación de proteínas, cinética enzimática y detección mediante inmunotransferencia.
- Depende del acceso a isoformas purificadas de SUMO, enzimas E1/E2 y proteínas sustrato.
- Necesita tampones de reacción estandarizados y controles de temperatura para mediciones consistentes de la actividad.
- Implica la optimización de las concentraciones de enzima y sustrato para evitar señales no específicas.
- Se limita a la actividad in vitro; el contexto celular y los mecanismos reguladores requieren validación complementaria.
