Name: In Vitro Ensayo de la sumoilación estudiar SUMO E3 ligasa actividad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende un ensayo in vitro de SUMOilación para identificar nuevas SUMO E3 ligasas y estudiar su especificidad hacia diferentes isoformas de SUMO. Este método avanza la investigación en modificaciones proteicas.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de ciencia y tecnología (la mayoría, 105-2320-B-010-007-MY3 para PCC), del Instituto Nacional de investigación de salud (INDH-EX105 10215BC para PCC), del Ministerio de ciencia y tecnología (más 105-2314-B-400-019 a HJK) y del Instituto de investigación nacional de salud (INDH MG-105-SP-10, INDH MG-106-SP-10 HJK). Este trabajo también fue financiado en parte con la Universidad Nacional de Yang Ming en la publicación del manuscrito al PCC. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o reparación del manuscrito.

1. preparación de expresión de Baculovirus construye
<ol><li>
Purificar el SUMO E3 ligasa bZIP K mediante la clonación de cDNA de bZIP K19 en un vector del baculovirus de expresión dual (véase tabla de materiales) con un N-terminal del epítopo-tag. Hemos tenido éxito utilizando una etiqueta octapéptido (indicado en el protocolo como vector-etiqueta-K-bZIP). Nota: La plantilla de ADN para la clonación de la reacción en cadena (PCR) K-bZIP polimerasa es inversa del cDNA transcrito de RNA aislado de células de TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 después de la doxiciclina tratamiento20.<ol>
<li>Transferir el cuerpo entero K bZIP cDNA19 en el vector de expresión dual con Cpoque sitios de clonación. CPO Digiero el producto PCR y 1 μg del vector de expresión dual a 37 ° C para 3 h21.</li>
		<li>Separar y extraer el ADN digerido después de electroforesis en una de gel de agarosa 0,8%22. Ligar el inserto (K-bZIP) y vector de T4 ADN ligasa a 16 ° C durante 30 minutos según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Añadir 5 μl de ligadura de ADN a 50 μl competentes de e. coli las células "A" (véase Tabla de materiales) en un tubo de 1,5 mL. Poner en hielo durante 30 minutos. Luego, incubar el tubo de 1,5 mL en un baño de agua de 42 ° C por 45 s y poner inmediatamente el tubo en hielo por 3 minutos.</li>
		<li>Añadir 600 μl de medio de novedosa (Extracto de levadura 0.5% (p/v), 2% (w/v) triptona, NaCl 10 mM, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO4y glucosa 4% (p/v)) en el tubo e incubar a 37 ° C durante 1 h. Luego, centrifugar el tubo a temperatura ambiente durante 3 minutos a 600 x g.</li>
		<li>Quite el sobrenadante, Resuspender el precipitado con 60 μL de medio Luria-Bertani (LB; 1% (p/v) triptona, 0.5% (p/v) de levadura extracto y el 85 mM NaCl) y en placas de agar LB con ampicilina 100 de μg/mL. Incubar la placa de agar a 37 ° C por 16 h23,24.</li>
		<li>Seleccione 1 Colonia para inocular en medio LB de 5 mL conteniendo 100 μg/mL ampicilina y cultivo a 37 ° C por 16 h con agitación de 250 rpm. Luego, extrae el plásmido, vector-etiqueta-K-bZIP, por un kit de extracción de plásmidos según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generar la bacmid recombinante albergando la etiqueta-K-bZIP por transformación del vector-etiqueta-K-bZIP en competentes de e. coli las células "B" (véase tabla de materiales).
	<ol>
<li>0,2 μg plásmido de vector-etiqueta-K-bZIP y 100 μl de la mezcla competente E. las células "B" de coli en un tubo de 1,5 mL y puesto en hielo durante 30 minutos incuban el tubo en baño de agua de 42 ° C por 45 s y poner inmediatamente el tubo en hielo por 3 minutos.</li>
		<li>Agregar 900 μl de medio de la novedosa en el tubo e incubar a 37 ° C durante 4 h con rotación a 50 rpm. A continuación, tomar 10 μl del medio, agregar un adicional 50 μl de medio S.O.C difusión en placas de agar LB con kanamicina 50 de μg/mL, 7 gentamicina μg/mL, 10 tetraciclina μg/mL, sustrato de galactosidasa de 100 μg/mL y 40 μg/mL isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG ) e incubar las placas durante 48 h a 37 ° C.</li>
		<li>Inocular una colonia blanca en medio LB de 5 mL que contienen 50 kanamicina μg/mL, 7 gentamicina μg/mL y 10 μg/mL tetraciclina. Incubar a 37 ° C con agitación por 16 h de 250 rpm.</li>
		<li>Aislar la bacmid recombinante ADN que la etiqueta-K-bZIP, cuantificar y vuelva a suspender en una concentración de 1 μg/μl25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generar el baculovirus recombinante expresando etiqueta-K-bZIP por transferencia 1 μg de bacmid recombinante ADN que contiene la etiqueta-K-bZIP en células Sf9 en un pozo de una placa de 6 pozos.
	<ol>
<li>Semilla 2 x 106 Sf9 células (véase Tabla de materiales) en insecto medio 2 mL Grace suministrado con 10% suero bovino fetal (FBS) y gentamicina 1% en cada pozo de una placa bien 6, luego incuban a 27 ° C durante 1 hora.</li>
		<li>Mantener una cultura de la fase de registro de células Sf9 en medio de insecto de gracia suministrado con 10% FBS, gentamicina 1% y detergente al 1% C (véase Tabla de materiales) a 27 ° C en suspensión orbital a 140 rpm. Contar las células usando un hemocitómetro y tinción trypan blue. viabilidad celular debe superar 95%. Mantener las células mediante una relación de subcultivation de 1:3 cada 2-3 días (mínima densidad ~0.5 x 106 células/mL).</li>
		<li>Añadir 2 μl bacmid ADN (1 μg/μl) y 98 μl reduce medios suero (véase Tabla de materiales) en un tubo de 2 mL. A continuación, añadir 4 μL de reactivo de transfección (véase Tabla de materiales) para el tubo y mezcla bien. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
		<li>Agregar esta mezcla de transfección (104 μL) en cada pocillo e incubar a 27 ° C durante 12-16 h.</li>
		<li>Agotado los medios de comunicación con la aspiración suave de quitar y reemplazar con 2 mL de medio de insecto de gracia fresca suministrada con FBS y 1% gentamicina al 10%. Las células Sf9 adhieran libremente a la superficie de la placa y no será perturbadas con aspiración suave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recoger el baculovirus recombinante después de transfección y amplificación de baculovirus para obtener las existencias del alto-título (P1) para experimentos adicionales.
	<ol>
<li>72 h después de cambiar de medio, raspe el Sf9 células usando un levantador de células estériles, recoger el sobrenadante de cada pozo individual en un tubo de 1,5 mL y agitar por 10 s.</li>
		<li>Centrifugar a 4 ° C por 3 min a 150 x g. recoger sobrenadante como P0 baculovirus y Alicuotar en tubos de 1,5 mL (baculovirus de 1 mL en cada tubo). Tienda a-80 ° C.</li>
		<li>Semilla 1 x 107 Sf9 células en insecto medio 10 mL Grace suministran con FBS y 1% gentamicina al 10% en una placa de Petri de 10 cm e incuban a 27 ° C durante 1 hora.</li>
		<li>Para la amplificación de baculovirus recombinante expresando su etiqueta-K-bZIP, añada 0,5 mL P0 baculovirus a las células Sf9 sembradas e incubar a 27 ° C durante 48 h.</li>
		<li>Recoger sobrenadante como baculovirus P1 en un tubo de 15 mL y conservar a 4 ° C durante 1 mes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificación de K-bZIP
<ol><li>Mantener una cultura de la fase de registro de células Sf9 en medio de insecto de gracia suministrado con 10% FBS, gentamicina 1% y detergente al 1% C a 27 ° C en suspensión orbital a 140 rpm como se describe en el paso 1.3.2.</li>
	<li>En el día de la transducción de señales, añadir 1 mL del sobrenadante que contiene el baculovirus (P1) en 250 mL de células Sf9 con una densidad de 2 x 106 células/mL.</li>
	<li>Incube las células Sf9 por 72 h a 27 º C en un agitador orbital con 140 rpm de agitación, luego recoge por centrifugación a 2.740 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante y lyse Pellet celular en 10 mL de tampón de lisis (20 mM HEPES pH 7.9, 0,5 M de NaCl, 1% detergente un (véase Tabla de materiales), 2% glicerol, inhibidor de la proteasa cóctel) y gira a 50 rpm con un mezclador de suspensión a 4 ° C durante 30 minutos.</li>
	<li>Célula de centrífuga lisada a 15.000 x g durante 15 min a recoger el sobrenadante.</li>
	<li>Para purificar el tag-K-bZIP, incubar los lysates de la célula (10 mL) con 50 μl de anticuerpo etiquetado granos magnéticos en tubos de polipropileno de 14 mL y gira a 50 rpm durante 3 h a 4 ° C utilizando una mezcladora de suspensión. Tras la captura de la proteína, pellets los granos en 800 x centrifugado g 30 s a 4 ° C. Eliminar la mayor parte del sobrenadante, resuspender los granos en el volumen residual de aproximadamente 1 mL y transferir a un tubo de 1,5 mL para lavado.</li>
	<li>Lavar la proteína capturada colocando el tubo que contiene los granos en un soporte magnético y eliminar el sobrenadante una vez que los granos magnéticos se han adherido completamente al lado del tubo.</li>
	<li>
Lavar los granos con tampón de lisis cuatro veces.
	<ol>
<li>Añadir 1 mL de tampón de lisis en tubos de 1,5 mL e invertir los tubos 10 veces. Coloque el tubo de 1,5 mL en un soporte magnético y eliminar el sobrenadante como se describe en 2.7.</li>
		<li>Repita el paso anterior otras 3 veces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavar los granos con tampón fosfato salino (PBS) una vez.
	<ol>
<li>Añadir 1 mL de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4) en tubos de 1,5 mL e invertir los tubos 10 veces.</li>
		<li>Poner el tubo de 1,5 mL en un soporte magnético y retire el sobrenadante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluir la etiqueta-K-bZIP proteína de los granos magnéticos etiquetados anticuerpo añadiendo 100 μl de 150 octapéptido μg/mL diluido en PBS en un tubo de 1,5 mL. Gire el tubo durante 10 minutos a 50 rpm mezcladora de suspensión a temperatura ambiente. A continuación, coloque el tubo en el soporte magnético y recoger el sobrenadante en un tubo limpio de 1.5 mL que contiene K-bZIP.</li>
	<li>Análisis de 1-5 μl purificada etiqueta-K-bZIP proteínas por SDS-PAGE seguido por el azul de Coomassie tinción26. Carga 2 μg, 1 μg, y 0,5 μg muestras de albúmina de suero bovino (BSA) en el mismo gel y usan para la cuantificación con un programa de procesamiento de imagen, como el ImageJ. Calcular la concentración de K-bZIP en comparación a los estándares de BSA.</li>
	<li>El K-bZIP purificada está ahora listo para ser utilizado en cada ensayo la sumoilación. Diluir el bZIP K en PBS hasta una concentración final de 100 ng/μl y tienda en pequeñas alícuotas a-80 ° C.</li>
</ol>3. la sumoilación ensayo
<ol><li>Agregar 3 μl de 100 ng/μl de etiqueta-K-bZIP purificado en la mezcla principal de cada uno en vitro la sumoilación reacción. Componentes en la mezcla principal contienen 1 μl de tampón de proteínas, 1 x de buffer de la sumoilación, proteína de p53 de 0,5 μl (0,5 mg/mL), 25 nM de E1 activar enzima (stock Conc.: 1 μm), 50 nM de E2 conjugar la enzima (Conc. stock: 10 μm) y 250 nM de los péptidos SUMO (SUMO-1 , 2 de SUMO y SUMO-3; concentrado acción: 5 μm) a un volumen final de 17 μl.</li>
	<li>Mezclar suavemente el contenido e incubar la reacción a 30 ° C para 3 h. detener la reacción añadiendo 20 μl de 2 x de buffer de carga SDS-PAGE (100 mM Tris-HCL de pH 6.8, dodecil sulfato de sodio de 4%, azul de bromofenol 0,2% (p/v), glicerol al 20% (v/v) y 200 mM β-mercaptoetanol) y desnaturalizar las muestras a 95 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>
Muestras separadas por SDS-PAGE, transferir las proteínas separadas en una membrana de PVDF utilizando un aparato de transferencia electroforética semiseco y análisis por Western blot utilizando anticuerpos anti-p53.
	<ol>
<li>Configurar el aparato del gel como en el paso 2.11 y cargar 20 μl de muestra en los pocillos del gel.</li>
		<li>Correr el gel 10% en una constante actual a 80 V durante unos 120 minutos (hasta que la banda de tinte alcanza la parte inferior del gel). Después de la terminación de la electroforesis, apague la fuente de alimentación.</li>
		<li>Desconecte el aparato de gel y gel de cassettes para sacar el gel y flotar el gel en tampón de transferencia semiseco (48 mM Tris-HCl, 39 mM glicina, 20% metanol) durante 5 minutos.</li>
		<li>Toma otro recipiente y sumérgete en la membrana PVDF en metanol durante 1 minuto. Luego, sacar PVDF de metanol y poner en tampón de transferencia semiseco. Frote suavemente la membrana por 5 min.</li>
		<li>Retire la cubierta de seguridad del aparato electroforética semiseco.</li>
		<li>Humedezca previamente el papel de filtro y preparar un sándwich de gel en el ánodo de platino de fondo como sigue: papel de filtro, membrana PVDF, gel y papel de filtro.</li>
		<li>Cubierta de placa y seguridad seguro cátodo, entonces escurr blot en corriente para 90 min vuelta constante de 15 V la fuente de alimentación, desconecte aparatos semisecos y sacar la membrana PVDF.</li>
		<li>Membrana de PVDF de bloque con solución amortiguadora de bloqueo (5% leche descremada en buffer TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0.1% detergente B (véase Tabla de materiales), pH 7,6)) a temperatura ambiente durante 1 h con 30 rpm agitación por Agitador orbital.</li>
		<li>Hibridar la membrana PVDF con anti-p53 anticuerpo diluido (1:1, 000) en solución amortiguadora de bloqueo para 12-16 h a 4 ° C con 30 rpm agitación usando una mezcladora de suspensión.</li>
		<li>Saque la membrana PVDF en un recipiente y poner en TBST. Enjuagar la membrana PVDF con TBST dos veces más.</li>
		<li>Poner en remojo la membrana PVDF en TBST durante 30 minutos con 45 rpm agitación por Agitador orbital.</li>
		<li>Hibridar la membrana PVDF con anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) diluido (1:4, 000) en solución amortiguadora de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente con 30 rpm agitación usando una mezcladora de suspensión.</li>
		<li>Lavar la membrana PVDF con TBST 3 veces como se describe en el paso 3.4.10.</li>
		<li>Poner en remojo la membrana PVDF en TBST durante 30 minutos con 45 rpm agitación usando una mezcladora de suspensión. Retirar TBST y añadir PBS para preservar la membrana PVDF a 4 ° C por hasta 12 h.</li>
		<li>Mezclar el reactivo Substrato quimioluminiscente mejorada (ECL éste) 1 y 2 (1:1) (véase Tabla de materiales). Quitar la membrana PVDF del PBS, blot brevemente con una toalla de papel o un limpiador ligero para absorber el exceso de humedad y añadir 400 μL de reactivo de ECL para la superficie de cada membrana para 3-5 min quitar exceso ECL reactivo frotando brevemente, pero no permita que el m superficial a completamente secos.</li>
		<li>Exponga la mancha blanca /negra usando un sistema de proyección de imagen de luminiscencia o autorradiografía película27.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no divulgar conflictos de interés.

El en vitro la sumoilación protocolo descrito aquí se utiliza rutinariamente para establecer la situación de la sumoilación de sustratos Ubc9 identificados. La limitación principal utilizando el protocolo estándar para el estudio de la función de SUMO E3 ligasa de sumoilación es la abundancia de activación de SUMO E1 y E2 Conjugación enzimas Ubc9 que maximicen la conjugación de SUMO en sistemas in vitro . Teniendo en cuenta este reto, creemos la titulación de la cantidad de enzimas SUMO E1 y E2 al nivel...

Modificación de SUMO fue identificado inicialmente como una modificación poste-de translación reversible (PTM) que regula la estabilidad de la proteína1. Además de conjugación directa, SUMO puede también acoplarse a una proteína a través de la interacción no covalente por SUMO interacción motivos (SIMs)2. Similar a la Unión de Tirosil-fosforilación de moléculas que de homología Src 2 (SH2) o phosphotyrosine atar (PTB) dominios3,4, modificación SUMO proporciona una plataforma de interacción adicional para selectivo contratación de SIM que contiene proteínas de efector5,6. Además de regulación de la transducción de la señal, la sumoilación de factores transcripcionales y cromatina remodelación moléculas sirven para modular la gene expresión7,8. Estudios de patrones de sumoilación de genoma han revelado que la modificación SUMO es asociada a positivo9,10 o negativo10,11,12 transcripción Reglamento, en parte debido a la especificidad del paralogue de sumoilación.
Hay tres isoformas principales de SUMO para la proteína conjugando presente en células de mamíferos; Estos incluyen SUMO-1 y la altamente homólogo SUMO-2 y SUMO-3 (denominado SUMO-2/3)13. SUMO se conjuga generalmente a los residuos de lisina (K) en el motivo de consenso ψKxD/E en la proteína diana. La SIM en SUMO E3 ligasas es responsable de la especificidad de paralogue14. En contraste con vías de ubiquitinación que contiene cientos de ligasas E3, sólo ha habido unos SUMO E3 ligasas identificados15. Ligasas de SUMO E3 se definen por propiedades, incluyendo su capacidad para (i) atar Ubc9, (ii) parte de SUMO se unen a través de un dominio SIM y (iii) mejorar la transferencia SUMO de Ubc9 sobre substrato. Ligasa E3 no es absolutamente necesario para SUMO verbal16, pero proporciona sustrato y SUMO paralogue especificidad. Puesto que generalmente sólo una pequeña fracción de la proteína total del sustrato es modificado de SUMO, detección de proteínas sumoiladas en vivo es siempre un reto. Por lo tanto, se necesitan análisis precisos y reproducibles para aclarar la función precisa de modificación de SUMO.
El en vitro la sumoilación ensayo, que evalúa la capacidad de Ubc9 purificada para catalizar la sumoilación de proteínas sustrato, es un ensayo bien-aceptado para el estudio de modificación SUMO17. Sin embargo, SUMO E3 ligasa actividad en la mayoría de los casos no puede ser detectada o solamente se pueden detectar con ligasa SUMO transformada con alta SUMO E3 ligasa actividad y especificidad de sustrato bajo el protocolo estándar debido a la presencia de una abundante cantidad de Ubc918 . El éxito de este ensayo depende en gran medida la valoración cuidadosa de Ubc9 purificada. El ensayo de la sumoilación en vitro descrito aquí se modifica una sumoilación estándar protocolo (véase Tabla de materiales). La observación de mayor modificación SUMO global durante la reactivación del herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi (KSHV) nos llevó a identificar la ligasa E3 SUMO viral que puede ser responsable de la para arriba-regulación de la sumoilación. Tras una proyección en pequeña escala de las proteínas obran recíprocamente de viral SUMO E3 ligasa K bZIP, p53 fue identificado como un sustrato nuevo. En este protocolo, se muestra detalladamente en células de los insectos los pasos involucrados en la expresión y purificación de tipo K-bZIP, una ligasa E3 SUMO viral con especificidad de SUMO-2/3. Se evalúa la capacidad de la K-bZIP purificado para mejorar la sumoilación de p53, un conocido sustrato SUMO, en presencia de cantidades reducidas de enzimas E1 y E2. Usando este análisis modificado de sumoilación, los investigadores pueden confiablemente definir las capacidades del SUMO E3 ligasa SUMOylate novela o sustratos conocidos, que es un paso primordial en el estudio de la sumoilación de la proteína. Además, este método ayuda a identificar nuevos ligasas SUMO E3 con actividad ligasa baja pero la especificidad de sustrato alta.

<table><tbody><tr><td>pFastBac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016 vector de</td><td>baculovirus de doble expresión</td></tr><tr><td>vector pCR2.1-TOPO vector de</td><td>producto de PCR</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>célula competente&nbsp; E. coli DH5 y alfa;</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYE678-80VL</td> células <td>competentes E. coli células A</td></tr><tr><td>E. coli DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>competentes E. coli células B</td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Roche</td><td>04709705001</td><td>reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>medios séricos reducidos</td></tr><tr><td>T4 Ligasa</td><td>NUEVA INGLATERRA BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>CpoI (RsrII)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0741</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1690</td><td>sustrato de galactosidasa</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Medio de insectos</td><td>Gibco</td><td>11605094</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco 10082147</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0254-20ML</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>tetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Merk</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sodio</td><td>Merk</td><td>1.13760.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (Base)</td><td>J.T.Baker</td><td>4109-06</td><td></td></tr><tr><td>Leche descremada</td><td>Fonterra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>J.T.Baker</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>detergente A</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-500ML</td><td>detergente B</td></tr><tr><td>Poloxámero 188 solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556-100ML</td><td>detergente C</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa Cocktail Tablet</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>3x Péptido bandera Sigma</td><td></td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG m2 Perlas magnéticas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8823</td><td>perlas magnéticas marcadas con anticuerpos</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-1 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40120</td><td>estándar Protocolo SUMOylation&nbsp;</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40220</td><td>estándar protocolo SUMOylation&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel QIAquick QIAGEN</td><td></td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Mini kit de plásmido QIAGEN</td><td></td><td>12123</td><td>kit de extracción de plásmidos</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno Falcon</td><td></td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri Falcon 351029</td><td></td><td></td> Elevador de células Corning CNG3008 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punta de carga</td><td>Sorenson BioScience</td><td>28480</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF1002</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro secante</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini aparato de gel de losa (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001 EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electroforetic Transfer Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting</td><td>Thermo</td><td>32106</td><td>ECL </td></tr><tr><td>mezclador de suspensión</td> de reactivos <td>Digisystem laboratory instruments&nbsp; Inc.</td><td>Agitador orbital SM-3000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kansin instruments Co.</td><td>OS701</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 generador de imágenes biomoleculares</td><td>GE Healthcare</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Thermo Scientific</td><td>B82501</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-p53</td><td>Cell</td> <td>Signaling#9282</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-conejo</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ensayo de la sumoilación estudiar sumo e3 ligasa actividad

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Modificación de pequeños ubiquitin-like modifier (SUMO) es una importante modificación poste-de translación (PTM) que media el transduction de la señal sobre todo a través de la modulación de las interacciones proteína-proteína. Similar a la modificación de la ubiquitina, la sumoilación está dirigida por una cascada secuencial de enzimas como enzima activadora de E1 (SAE1/SAE2), enzima E2-Conjugación (Ubc9) y E3 ligasa (es decir, Pia familia, RanBP2 y Pc2). Sin embargo, a diferencia de la ubiquitinación, una ligasa E3 es no esencial para la reacción pero no proporcionan precisión y eficacia para verbal de SUMO. Las proteínas modificadas por sumoilación pueden identificarse por ensayo en vivo mediante inmunoprecipitación con anticuerpos específicos de sustrato y el immunoblotting con anticuerpos específicos para SUMO. Sin embargo, la demostración de la actividad de la proteína SUMO E3 ligasa requiere reconstitución en vitro de sumoilación ensayos con enzimas purificadas, sustrato y proteínas SUMO. Ya que en las reacciones en vitro , generalmente SAE1/SAE2 y Ubc9, solo son suficientes para Conjugación de SUMO, realce de la sumoilación por una supuesta ligasa E3 no siempre es fácil de detectar. Aquí, describimos una modificada en vitro la sumoilación protocolo que identifica sistemáticamente modificación SUMO usando un sistema en vitro reconstituido. También se presenta un protocolo paso a paso para purificar catalítico activo K-bZIP, una ligasa E3 de SUMO-2/3 viral. Las actividades de la sumoilación de la purificada bZIP de K aparecen en p53, un conocido destino de SUMO. Este protocolo puede no sólo utilizarse para dilucidar las ligasas SUMO E3 novela, sino también para revelar su especificidad paralog SUMO.

Según la información proporcionada por el fabricante, la cantidad de enzima E1 y E2 en el ensayo de sumoilación es de 50 nM y 500 nM, respectivamente. Primero se determinó la cantidad mínima de E2 conjugando enzimas Ubc9 que es capaz de SUMOylate p53 por un análisis de la sumoilación en vitro . Tan bajo como un quinto de la cantidad de Ubc9 utilizado en el estándar en vitro la sumoilación protocolo eficiente SUMOylate p53 (figura 1A<...

A diferencia de ligasas de ubiquitina ligasas E3 SUMO algunos han sido identificados. Este modificado en vitro protocolo de sumoilación es capaz de identificar nuevos SUMO E3 ligasas por un ensayo de reconstitución en vitro .

In Vitro Ensayo de la sumoilación estudiar SUMO E3 ligasa actividad

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

El objetivo general de este experimento es verificar una proteína de interés que pueda ser SUMOilada o que sea una lygasa SUMO E3. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la SUMOilación, como la identificación de la lygasa SUMO E3. La principal ventaja de esta técnica es que podría utilizarse para la investigación de la especificidad de la ligasa SUMO E3 hacia diferentes formas iso de SUMO.El demostrador del procedimiento será Wan-Shan Young, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para purificar la etiqueta K-bZIP, primero incube 10 mililitros de lisado celular con 50 microlitros de perlas magnéticas marcadas con anticuerpos en un tubo de polipropileno de 14 mililitros. Luego gire el tubo a 50 revoluciones por minuto a cuatro grados centígrados durante tres horas en un mezclador de suspensión.Una vez capturada la proteína, centrifugar la muestra a 800 veces g durante 30 segundos a cuatro grados centígrados para pellet las perlas. Deseche todo menos un mililitro de sobrenadante para volver a suspender las cuentas. Y transfiera las perlas disueltas a un tubo de 1,5 mililitros.Para lavar las proteínas capturadas, coloque el tubo con las perlas en un soporte magnético. Espere unos tres segundos para que las cuentas se adhieran a las paredes laterales del tubo y luego retire el sobrenadante. Para lavar las perlas, agregue un mililitro de tampón de lisis en el tubo de 1,5 mililitros.A continuación, invierta el tubo diez veces. A continuación, coloque el tubo de 1,5 mililitros en el soporte magnético y retire el sobrenadante una vez que las cuentas se adhieran a las paredes. Para volver a lavar las perlas, agregue un mililitro de solución salina tamponada con fosfato al tubo de 1,5 mililitros e inviértalo diez veces.A continuación, transfiera el tubo al soporte magnético y retire el sobrenadante una vez que las cuentas se hayan adherido a las paredes laterales. Para eluir las proteínas marcadas con K-bZIP de las perlas magnéticas marcadas con anticuerpos, agregue 100 microlitros a 150 microgramos por mililitro de octapéptido diluido en solución salina tamponada con fosfato en el tubo de 1,5 mililitros. Luego gire el tubo en un mezclador de suspensión a 50 revoluciones por minuto durante diez minutos a temperatura ambiente.Transfiera el tubo al soporte magnético. Y luego recoja el K-bZIP que contiene sobrenadante. A continuación, para analizar la etiqueta K-bZIP purificada, someta de uno a cinco microlitros de la proteína purificada a la página SDS, seguida de la tinción con azul de Coomassie.Cargue 0,5, 1 y 2 microgramos de albúmina sérica bovina como patrones en el gel para cuantificar la concentración de K-bZIP. Mientras procesa la imagen en la imagen J.Next, diluya el K-bZIP purificado en solución salina tamponada con fosfato. Para alcanzar una concentración final de 100 nanogramos por microlitro.Y almacenar a menos 80 grados centígrados en pequeñas alícuotas. Agregue tres microlitros de 100 nanogramos por microlitro de K-bZIP marcado purificado en la reacción de mezcla maestra de SUMOilation in vitro. A continuación, mezcle suavemente el contenido de la mezcla maestra e incube a 30 grados centígrados durante tres horas.A continuación, agregue 20 microlitros de página SDS 2X con tampón de carga para detener la reacción. A continuación, calienta las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos para desnaturalizar la proteína. A continuación, cargue 20 microlitros de la muestra en un gel de página 10%SDS.Y haz funcionar el gel a 80 voltios durante unos 120 minutos hasta que el tinte llegue al fondo del gel. Una vez finalizada la electroparesia, desconecte el aparato de gel. Y transfiera el gel en un tampón de transferencia semiseco durante cinco minutos.A continuación, remoje la membrana de PVDF en otro recipiente lleno de metanol durante un minuto. Retire la membrana de PVDF del metanol y sumérjala en un tampón de transferencia semiseco. A continuación, agite suavemente la membrana durante cinco minutos.Retire la cubierta de seguridad del aparato electroforético semiseco. Humedece previamente un papel de filtro. Y prepare un sándwich de gel en la parte inferior del ánodo de platino.Después de asegurar la placa del cátodo en la cubierta de seguridad, haga funcionar el blot a 15 voltios de corriente constante durante 90 minutos. A continuación, apague la fuente de alimentación y extraiga la membrana de PVDF después de desconectar el aparato semiseco. Ahora bloquee la membrana de PVDF con tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente en un agitador orbital a 30 revoluciones por minuto.A continuación, hibridar la membrana de PVDF con el anticuerpo anti-p53 y el tampón de bloqueo durante 12 a 16 horas a cuatro grados centígrados en un mezclador de suspensión a 30 revoluciones por minuto. A continuación, saque la membrana de PVDF y transfiérala a un recipiente lleno de solución salina tamponada con Tris tween 20. A continuación, sumerja la membrana de PVDF en solución salina tween 20 tamponada con Tris durante 30 minutos en el agitador orbital a 45 revoluciones por minuto.A continuación, hibridar la membrana de PVDF con el anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente en el mezclador de suspensión a 30 revoluciones por minuto. A continuación, lave la membrana de PVDF con solución salina tamponada Tris 20 veces antes. Después del lavado, remoje la membrana de PVDF en solución salina tamponada Tris tween 20 durante 30 minutos en el mezclador de suspensión a 45 revoluciones por minuto.A continuación, sustituya la solución salina tamponada Tris tween 20 por solución salina tamponada con fosfato. Para conservar la membrana de PVDF a cuatro grados centígrados durante un máximo de 12 horas. A continuación, mezcle los reactivos de sustrato quimioluminiscente mejorados uno y dos en una proporción de uno a uno.A continuación, retire la membrana de PVDF de la solución salina tamponada con fosfato y seque brevemente con las cavidades de perforación para absorber el exceso de humedad. Agregue inmediatamente 400 microlitros del reactivo quimioluminiscente a la superficie de la membrana y espere de tres a cinco minutos. Seque brevemente para drenar el exceso de reactivo quimioluminiscente, evitando que la membrana se seque por completo.Utilice el sistema de imágenes de Luminescent para exponer la mancha. En este caso, se realizó un análisis de inmunotransferencia para mostrar la concentración de la enzima Ubc9 necesaria para SUMOilar los objetivos de p53. Esto demuestra que 1/2 y 1/5 de la concentración de la enzima Ubc9 puede SUMOilar suficientemente la enzima p53 en un ensayo de SUMOilación in vitro utilizando péptidos SUMO 1 y SUMO 2.Para analizar el p53 SUMOilado, la membrana se probó con el anticuerpo anti-p53. Se realizó un análisis de inmunotransferencia similar para mostrar que se requiere la mitad de E1 y una concentración de 1/10 de las enzimas Ubc9 para SUMOilar el objetivo p53 en un ensayo de SUMOilación in vitro utilizando péptidos SUMO 1, SUMO 2 y SUMO 3. Aquí, la membrana se tiñó con Coomassie para mostrar la proteína K-bZIP purificada.Se utilizó el sistema de expresión de Baculovirus para expresar el K-bZIP purificado que se analizó en la página SDS con albúmina sérica bovina como estándar para la comparación. También se realizó un análisis adicional de inmunotransferencia que mostró que al aumentar la concentración de K-bZIP se cataliza la SUMOilación de p53 en presencia de la mitad de la cantidad de E1 y 1/10 de la cantidad de enzimas Ubc9, respectivamente. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todo el reactivo para el ensayo de SUMOilación in vitro en hielo, y hacer la dilución en serie en lugar de en una dilución gigante. Encuentre este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la sobreexpresión de SUMOlygase, para verificar la SUMOilación in vitro. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la SUMOilación exploraran más SUMOlygase y validaran su poder de especificidad.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar una lygasa SUMO e3 utilizando un ensayo de simulación in vitro.

in-vitro-sumoylation-assay-to-study-sumo-e3-ligase-activity

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Biología

Este video demuestra el método in vitro para la SUMOilación de proteínas de sustrato utilizando una cascada de enzimas secuencial. Además, el estado SUMOilado de la proteína se identifica mediante la técnica de electroforesis e inmunotransferencia.

Ensayo de SUMOilación: una técnica in vitro para detectar el estado de SUMOilación de proteínas sustrato mediante inmunotransferencia

Este manuscrito describe la detección de sumoylation y ubiquitinación de proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en la levadura Saccharomyces cerevisiae en ciernes.

Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

Proteínas familiares pequeños modificadores relacionados con ubiquitina (SUMO) se conjugan para los residuos de lisina de las proteínas diana para regular diversos procesos celulares. Este papel describe un protocolo para la detección de la proteína retinoblastoma (Rb) la sumoilación condiciones endógenas y exógenas en células humanas.

En Vivo Detección y análisis de la sumoilación de la proteína Rb en células humanas

El SUMO es una proteína modificadora de ubiquitina, esencial y muy conservada. En este protocolo Describimos el uso de una proteína de captura de SUMO recombinante con tolerancia al estrés (kmUTAG) para visualizar conjugados de SUMO nativos, sin etiquetar y su localización en una variedad de tipos de células.

Localización de proteínas de SUMO modificado utilizando proteínas de atrapamiento de sumo fluorescente

Aquí, presentamos un protocolo para enriquecer, aislar, identificar y caracterizar proteínas modificadas por SUMO in vivo tanto de células de hepatoma humanos como de tumores hepáticos obtenidos a partir de modelos de ratón de carcinoma hepatocelular mediante el uso de entidades de unión SUMO (SUBE).

Entidades de unión SUMO (SUBE) como herramientas para el enriquecimiento, aislamiento, identificación y caracterización del proteome SUMO en cáncer de hígado

El objetivo de este manuscrito es presentar un esquema para los estudios bioquímicos y funcionales completos de las ligasinas de ubiquitina tipo RING E3. Esta canalización de varios pasos, con protocolos detallados, valida una actividad enzimática de la proteína probada y demuestra cómo vincular la actividad a la función.

Caracterización funcional de las ligasinas de ubiquitina RING-Tipo E3 In Vitro y In Planta

El presente estudio proporciona protocolos detallados de ensayo de ubiquitilación in vitro para el análisis de la actividad catalítica de la ubiquitina ligasa E3. Las proteínas recombinantes se expresaron utilizando sistemas procariotas como el cultivo de Escherichia coli.

In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa

Proporcionamos un protocolo detallado para un ensayo de ubiquitilación de un sustrato específico y una ubiquitina ligasa E3 en células de mamíferos. Se utilizaron líneas celulares HEK293T para la sobreexpresión de proteínas, el sustrato poliubiquitilado se purificó a partir de lisados celulares por inmunoprecipitación y se resolvió en SDS-PAGE. Se utilizó immunoblotting para visualizar esta modificación post-traduccional.

Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos

El presente protocolo destaca un método modificado para detectar y cuantificar los enlaces cruzados ADN-proteína (DPCs) y sus modificaciones postraduccionales (PTMs), incluyendo la ubiquitilación, la SUMOilación y la ADP-ribosilación inducida por inhibidores de la topoisomerasa y por formaldehído, permitiendo así el estudio de la formación y reparación de DPCs y sus PTMs.

Detección cuantitativa de enlaces cruzados ADN-proteína y sus modificaciones postraduccionales

La ubiquitinación es un regulador crítico de las funciones intracelulares de las proteínas. Aquí describimos dos métodos de lisis celular para detectar los niveles de ubiquitinación de proteínas del sustrato en células de mamíferos y comparamos su eficacia para analizar los niveles de ubiquitinación. La sobreexpresión de proteínas en HEK293T células fue inducida por transfección transitoria, y proteínas ubiquitinadas fueron detectadas mediante análisis de western blot.

Estrategias comparativas para la detección de ubiquitinación en lisados celulares de mamíferos utilizando SMAD2/SMURF2 como modelo

Este protocolo describe un método para ubiquitinar Streptococcus pneumoniae utilizando lisado celular de mamífero o complejo enzimático puro de ubiquitina puro, seguido de un tratamiento con complejo proteico purificado VCP/p97-UFD1-NPLOC4 para evaluar su actividad bacteriolítica, permitiendo el estudio de efectores inmunitarios dependientes de ubiquitina.

In vitro Reconstitución de la ubiquitinación bacteriana y eliminación mediada por VCP/p97

Aprende un ensayo in vitro de SUMOilación para identificar nuevas SUMO E3 ligasas y estudiar su especificidad hacia diferentes isoformas de SUMO. Este método avanza la investigación en modificaciones proteicas.

In Vitro Ensayo de la sumoilación estudiar SUMO E3 ligasa actividad

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