Name: Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Aprende a medir la fagocitosis de astrocitos y microglía mediante imagen en vivo con sinaptosomas conjugados a indicador de pH. Este ensayo permite analizar la cinética de degradación en tiempo real para estudiar trastornos neurológicos.

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Los autores agradecen a Jung Yeon-Joo por su apoyo experimental durante la purificación de synaptosome y Jungjoo Corea Parque imágenes de sinaptosomas con exposición de PS. Además, agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Chung de discusión útil. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de investigación de concesión de Corea (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 y NRF-2016R1C1B3006969) (W. S. C).

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<li>Allen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+glypicans+4+and+6+promote+formation+of+excitatory+synapses+via+GluA1+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors.</a> Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).</li>
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<li>Chung, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+mediate+synapse+elimination+through+MEGF10+and+MERTK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways.</a> Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).</li>
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<li>Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+astrocytic+phagocytosis+is+mediated+by+CD36%2C+CD47+and+RAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).</li>
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<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Chung, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+allele-dependent+role+for+APOE+in+controlling+the+rate+of+synapse+pruning+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).</li>
<li>Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+glial+clearance+of+degenerating+axons+in+aged+Drosophila+is+due+to+reduced+PI3K%2FDraper+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity.</a> Nat Commun. 7, 12871(2016).</li>
<li>Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+degradation+in+phagocytic+astrocytes+can+be+enhanced+by+lysosomal+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification.</a> Glia. , (2015).</li>
<li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+astrocytic+lysosome+biogenesis+facilitates+Abeta+clearance+and+attenuates+amyloid+plaque+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis.</a> J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).</li>
<li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+degeneration+induces+glial+responses+through+Draper-TRAF4-JNK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling.</a> Nat Commun. 8, 14355(2017).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).</li>
<li>Stigliani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+re-sealed+particles+freshly+prepared+from+adult+rat+brain+are+competent+for+exocytotic+release+of+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate.</a> J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).</li>
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<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo se presentan métodos para un largo plazo imágenes viven en vitro fagocitosis ensayo usando células gliales purificadas y sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Se muestra que en comparación con la microglia, astrocitos poseen diferente capacidad de inmersión y degradación durante la fagocitosis de sinaptosomas. Además, nuestros datos sugieren que factores secretados de astrositos, que contienen moléculas puente como GAS6, proteínas y MEGE8, son esenciales para la fagocitosis depende PS efic...

Células gliales, que se refieren a las células no excitables en el cerebro, son el tipo de células principales en el sistema nervioso central (SNC). Anteriormente, las células glial fueron miradas como meras células de soporte que principalmente desempeñan un papel pasivo en el mantenimiento de propiedades sinápticas basals y la supervivencia neuronal. Sin embargo, nuevas pruebas ha revelado que las células gliales desempeñan un papel más activo en diversos aspectos de la neurobiología, como mantenimiento de la homeostasis cerebral, mediar la sinapsis formación1,2,3 y sinapsis eliminación4,5y modulando la plasticidad sináptica6,7. Las células gliales en el SNC son los astrocitos, microglia y oligodendrocitos. Entre estas células, los astrocitos y microglia han demostrado que desempeñan funciones fagocíticas por englobamiento sinapsis4,5, de células apoptotic8, desechos neuronales9y proteínas patógenas, tales como beta amiloide placas10,11. En el cerebro en desarrollo, los astrocitos eliminan sinapsis en el núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) a través de fagocitosis dependiente del MERTK y MEGF104. Del mismo modo, microglia también eliminan sinapsis C1q cubierto durante etapas de desarrollo a través de la cascada de complemento clásico5. Curiosamente, se ha sugerido que defectos en la poda de la sinapsis pueden ser uno de los iniciadores de varios desordenes neurológicos. Por ejemplo, se ha demostrado que las mutaciones en componente del complemento 4 (C4), que aumenta la poda de la sinapsis mediada por el complemento por microglía, son fuertemente asociadas con la prevalencia de la esquizofrenia en los seres humanos12. Un trabajo reciente también ha demostrado que la vía clásica del complemento es ligerament en las etapas de iniciación de AD e induce pérdida de sinapsis temprana de esta enfermedad13.
En comparación con la fagocitosis mediada por la microglía, si fagocitosis mediada por astrositos contribuye a la iniciación y progresión de varias enfermedades neurológicas es menos clara. Sin embargo, un artículo reciente sugiere que factores que alteran el ritmo de poda normal de la sinapsis por astrocitos pueden alterar la homeostasis cerebral y contribuyen a la patología y susceptibilidad de anuncio14. El tipo de poda de la sinapsis por astrocitos es poderosamente controlado por ApoE isómeros, con un alelo protector para AD (ApoE2) aumentar fuertemente la tasa y un alelo de riesgo para la EA (ApoE4) reducir significativamente la tasa de. Por otra parte, los ratones transgénicos que expresaban ApoE4 acumulan C1q sináptica mucho más que control o ApoE2 ratones14. Estos datos sugieren que deteriorada fagocitosis mediada por astrositos en principios cerebro AD puede inducir la acumulación de desechos senescentes revestido de C1q sinapsis/synaptic que activa fagocitosis complemento-mediada microglial, conducción sináptica degeneración . La capacidad fagocítica deteriorada de astrocitos en portadores ApoE4 puede también contribuir a la acumulación incontrolada de las placas de beta amiloide en los cerebros afectados por el anuncio.
Además, se ha demostrado que células gliales en el cerebro de Drosophila de perder su capacidad fagocítica por disminución traducción de Draper, un homólogo de Megf10 que los astrocitos phagocytosing la sinapsis. Restauración de niveles de Draper rescató la capacidad fagocitaria de las células gliales, que eficientemente dañado escombros axonal en el cerebro envejecido a un grado similar que en el cerebro joven, indicando que envejecimiento inducido por alteraciones en la capacidad fagocitaria de astrocytes pueden contribuir a la interrupción de la homeostasis cerebral15.
Partiendo de estos nuevos hallazgos, modulando la capacidad fagocitaria de astrocytes puede ser una estrategia terapéutica atractiva para prevenir y tratar diversos trastornos neurológicos. En este sentido, ha habido varios intentos para mejorar la capacidad fagocitaria de los astrocitos, por ejemplo, induciendo la acidificación de los lisosomas con nanopartículas ácidos16 y overexpressing el factor de transcripción EB (TFEB), que puede mejorar de la biogénesis del lisosoma17. A pesar de estos intentos, no está todavía claro cómo los astrocitos y las células microgliales se diferencian en su cinética fagocítico y si nosotros debemos aumentar o disminuir su capacidad fagocítica en diversas enfermedades.
En este trabajo presentamos un ensayo de novela en vitro para la detección de la capacidad fagocitaria de los astrocitos en tiempo real. Los datos muestran diferentes cinéticas de inmersión y degradación en astrocitos y microglía. Medio condicionado por astrositos (ACM), que contiene factores secretados de astrocitos, es esencial para la fagocitosis eficaz de astrocitos y microglia. Además, Megf10, un receptor fagocítico en astrocitos y un homólogo de Ced-1 y Draper, juega un papel crítico en la fagocitosis mediada por astrositos8,18.

<table><tbody><tr><td><fuerte>purificación de sinaptosomas</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE ciencias de la vida para el cuidado de la salud</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Bradford de inicio rápido 2</td><td>BIO-RAD</td><td>5000202</td><td></td></tr><tr><td><conjugación > indicador de pH fuerte</solución ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>LPS</td><td></td><td></td>DMSO100</tr><tr><td>Sondas de</td> molécula<td>de éster de succinimidilo rojo pHrodo</td><td>P36600</td><td></td></tr><tr><td>Immunopanning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Earle' s solución salina equilibrada (EBSS)</td><td>Sigma</td><td>E7510</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Bovogen</td><td>BSA025</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirebonucleasa 1 (DNasa)</td><td>Worthington</td><td>Is002007</td><td></td></tr><tr><td>(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>(dPBS)</td><td>Welgene</td><td>LB001-02</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Griffonia Simplicifolia Lectina (BSL-1)</td><td>Vector Labs</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG+IgM(H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-044</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgM (&mu;-cadena)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina</td><td>Sigma</td><td>E4643</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo HepaCAM humano</td><td>R& Sistemas D</td><td>MAB4108</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal integrina beta 5 (KN52)</td><td>eBioscience</td><td>14-0497-82</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamato</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-citeína (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Medios neurobasales</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>O4 hibridoma, sobrenadante(ratón IgM)</td><td>Bansal et al.23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>Is003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluristrainer 20 &mu; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Picilorhidrato de putrescina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón de rata purificado CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rata de ratón purificada CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T9935</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina</td><td>Worthington</td><td>LS003086</td><td></td></tr><tr><td>Tubo ultra claro (Tubo, pared delgada, ultra transparente)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Collect Dispositivos centrífugos IP-ACM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrosep Advance con membrana Omega (10k)</td><td>PALL</td><td>MAP010C37</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivos centrífugos Macrosep Advance con membrana Omega (30k)</td><td>PALL</td><td>MAP030C37</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de imagen en vivo de fagocitosis</etapa ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Juli fuerte</td><td>Complementos de NanoEntek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Time Series Analyzer V3</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un ph de novela in vitro live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Los astrocitos son las células principales en el cerebro y contacta directamente con las sinapsis y los vasos sanguíneos. Aunque las células microgliales se han considerado las principales células inmunes y solamente fagocitos en el cerebro, estudios recientes han demostrado que los astrocitos también participan en diversos procesos fagocíticos, tales como eliminación de sinapsis desarrollo y despacho de placas de beta amiloide en la enfermedad de Alzheimer (AD). A pesar de estos resultados, la eficiencia de la inmersión de astrositos y degradación de sus objetivos es confusos en comparación con la de microglia. Esta falta de información se debe principalmente a la falta de un sistema de ensayo en el que la cinética de fagocitosis mediada por astrositos y microglía son fácilmente comparables. Para lograr este objetivo, hemos desarrollado un a largo plazo vivir-proyección de imagen en vitro ensayo fagocitosis para evaluar la capacidad fagocitaria de purificada astrocitos y microglía. En este ensayo, detección en tiempo real de la inmersión y la degradación es posible usando sinaptosomas conjugado con indicador de pH, que emiten fluorescencia roja brillante en orgánulos ácidos, tales como lisosomas. Nuestro ensayo novela proporciona una detección simple y eficaz de la fagocitosis a través de imágenes en vivo. Además, este ensayo de fagocitosis en vitro puede utilizarse como una plataforma de proyección para identificar productos químicos y compuestos que pueden potenciar o inhibir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Como mal funcionamiento de la poda sináptica y acumulación de la proteína patógena han demostrado como causantes de trastornos mentales y enfermedades neurodegenerativas, productos químicos y compuestos que modulan la capacidad fagocitaria de las células gliales deberán ser útiles en el tratamiento de varios trastornos neurológicos.

En este en vitro fagocitosis análisis con imágenes en vivo a largo plazo, utilizamos sinaptosomas de homogenados de cerebro de ratón adulto, que se separaron de la solución gradiente entre solución gradiente 23% y 10% degradado por ultracentrifugación ( Figura 3). Después de la preparación, sinaptosomas expusieron PS en su membrana externa (figura 4), sugiriendo que perdieron su función y pueden ser reconocidos por recep...

Este protocolo presenta un en vitro en vivo-proyección de imagen de fagocitosis ensayo para medir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Microglia y astrocitos de rata purificados se utilizan junto con sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Este método puede detectar cinética en tiempo real de la inmersión y la degradación y proporciona una plataforma de proyección adecuado para identificar factores de modulación de fagocitosis de los astrositos.

Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

El objetivo general de este experimento es detectar la cinética de envolvimiento y degradación en tiempo real de las células gliales, como los astrocitos y la microglía, a través de imágenes en vivo in vitro de la fagocitosis de los sinaptosomas conjugados con indicadores de pH. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cómo se regula la fagocitosis de las células gliales en cerebros sanos y enfermos. La principal ventaja de esta técnica es que podemos monitorizar y analizar eficazmente la cinética fagocítica en tiempo real de las células gliales a través de imágenes en vivo de células cultivadas in vitro.Este método también se puede utilizar para detectar factores y compuestos que regulan la capacidad de engullido y degradación de las células gliales. Comience centrifugando las muestras de sinaptosomas descongeladas durante tres o cuatro minutos a 21, 092 G y cuatro grados Celsius. Después de aspirar los sobrenadantes, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de carbonato de sodio 0,1 molar por tubo, agregando dos microlitros de indicador de pH a cada muestra después de que se hayan mezclado completamente.Después de un vórt

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Investigación

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Neurociencia

Este protocolo detalla la forma de cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores.

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

En este video, realizamos el ensayo de fagocitosis microglial para el neuroblastoma utilizando células madre pluripotentes inducidas. El ensayo ayuda a evaluar el deterioro de la función microglial en enfermedades neurodegenerativas.

Ensayo de fagocitosis microglial: un ensayo in vitro para establecer un modelo de fagocitosis microglial para células de neuroblastoma utilizando macrófagos iPSC

En este video, evaluamos la capacidad fagocítica de los astrocitos purificados in vitro mediante un ensayo de imagen en vivo. El ensayo sirve como una plataforma de cribado eficaz para identificar compuestos químicos que pueden mejorar o inhibir la capacidad fagocítica de los astrocitos.

Ensayo de fagocitosis in vitro: un método basado en imágenes en vivo para estudiar la fagocitosis sinaptosómica mediada por astrocitos en tiempo real

Fuente: Funes, S., et. al., Células similares a la microglía humana: diferenciación de células madre pluripotentes inducidas y ensayo de fagocitosis de células vivas in vitro utilizando sinaptosomas humanos. J. Vis. Exp. (2022)Este video muestra un ensayo para estudiar la capacidad fagocítica de células similares a la microglía utilizando sinaptosomas marcados con colorantes fluorescentes sensibles al pH.

Ensayo de fagocitosis de células vivas de células similares a la microglía utilizando sinaptosomas humanos

Aquí se describe una adaptación de los protocolos utilizados para inducir la plasticidad homeostática en las neuronas para el estudio de la plasticidad de los receptores acoplados a proteínas G astrocíticos. Recientemente se utiliza para examinar los cambios en el grupo I mGluRs astrocítica en ratones jóvenes, el método se puede aplicar para medir la escala de varios GPCRs astrocitos, en el tejido de los ratones adultos in situ e in vivo, y para obtener una mejor apreciación de la sensibilidad...

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) con una alta capacidad de fagocitar o material de envolver en su entorno extracelular. Aquí, se describe un ensayo ampliamente aplicable, fiable, y altamente cuantitativo para visualizar y medir la microglia mediada por inmersión de componentes sinápticas.

Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas

fagocitosis microglial es crítica para el mantenimiento de la homeostasis del tejido e inadecuada función fagocítica se ha implicado en la patología. Sin embargo, la evaluación de la función de la microglia in vivo es un desafío técnico. Hemos desarrollado una técnica sencilla pero robusto para el seguimiento y cuantificar el potencial fagocítica de microglia en un entorno fisiológico con precisión.

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Aquí describimos un método in vitro de imágenes en vivo para visualizar el transporte intracelular de orgánulos y el tráfico de proteínas de membrana plasmática en astrocitos murinos. Este protocolo también presenta una metodología de análisis de imágenes para determinar los itinerarios de transporte de carga y la cinética.

Visualización y análisis del transporte intracelular de organelos y otros Cargos en astrocitos

Las enfermedades neurodegenerativas se asocian con funciones de microglía desreguladas. Este artículo describe un ensayo in vitro de fagocitosis de células de neuroblastoma por macrófagos iPSC. Las lecturas de microscopía cuantitativa se describen tanto para imágenes de lapso de tiempo de células vivas como para imágenes de alto contenido de células fijas.

Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

Este protocolo describe el proceso de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) en células similares a la microglía para la experimentación in vitro . También incluimos un procedimiento detallado para generar sinaptosomas humanos a partir de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC que se pueden usar como sustrato para ensayos de fagocitosis in vitro utilizando sistemas de imágenes de células vivas.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Aquí presentamos dos protocolos para cuantificar el envolvimiento microglial de sinapsis positivas para vGLUT1 y sinaptosomas crudos marcados con pHRodo Red mediante citometría de flujo.

Cuantificación de la envolvimiento microglial de material sináptico mediante citometría de flujo

Aprende a medir la fagocitosis de astrocitos y microglía mediante imagen en vivo con sinaptosomas conjugados a indicador de pH. Este ensayo permite analizar la cinética de degradación en tiempo real para estudiar trastornos neurológicos.

Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador (Video) | JoVE Journal

Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador

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