Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador

El objetivo general de este experimento es detectar la cinética de envolvimiento y degradación en tiempo real de las células gliales, como los astrocitos y la microglía, a través de imágenes en vivo in vitro de la fagocitosis de los sinaptosomas conjugados con indicadores de pH. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cómo se regula la fagocitosis de las células gliales en cerebros sanos y enfermos. La principal ventaja de esta técnica es que podemos monitorizar y analizar eficazmente la cinética fagocítica en tiempo real de las células gliales a través de imágenes en vivo de células cultivadas in vitro.

Este método también se puede utilizar para detectar factores y compuestos que regulan la capacidad de engullido y degradación de las células gliales. Comience centrifugando las muestras de sinaptosomas descongeladas durante tres o cuatro minutos a 21, 092 G y cuatro grados Celsius. Después de aspirar los sobrenadantes, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de carbonato de sodio 0,1 molar por tubo, agregando dos microlitros de indicador de pH a cada muestra después de que se hayan mezclado completamente.

Después de un vórtice suave, proteja las soluciones de la luz con cubiertas de papel de aluminio y coloque las muestras en un agitador giratorio con agitación suave durante dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, agregue un mililitro de PBS de Dulbecco, o DPBS, y recoja los sinaptosomas por centrifugación, volviendo a suspender el pellet en un mililitro de DPBS fresco por lavado. Después de la última centrifugación, vuelva a suspender el pellet de sinaptosoma no funcional en 200 microlitros de DPBS suplementado con 5% de DMSO.

Para obtener imágenes en vivo de la envolvimiento de sinaptosomas, primero retire el sobrenadante de cada pocillo de un cultivo de astrocitos confluente y lave rápidamente las células tres veces con un mililitro de DPBS por lavado. Después del último lavado, añadir 300 microlitros de medio básico de astrocitos inmunopanificados y cinco microlitros de sinaptosomas conjugados con indicador de pH, así como cualquier factor adicional que pueda modular la fagocitosis de las células gliales. Permitir que los sinaptosomas se asienten en el fondo de los pozos y se adhieran a los receptores de fosfatidilserina en los astrocitos a 37 grados Celsius y 5% de Co2.

Después de 40 minutos, deseche los sobrenadantes y lave rápida pero suavemente los pocillos tres veces con un mililitro de DPBS por lavado. Después del último lavado, agregue 500 microlitros de medio fresco complementado con los factores de interés a los pocillos apropiados y transfiera la placa a un instrumento de imagen en vivo. Seleccione las posiciones de imagen, ajuste el enfoque, el tiempo de exposición, el brillo y la potencia del LED, y establezca el formato de imagen, el intervalo de tiempo y el número total de ciclos para imágenes en vivo según sea apropiado experimentalmente.

Luego, comience a obtener imágenes en vivo de los experimentos de fagocitosis. En el punto final experimental adecuado, abra un programa de análisis de imágenes e importe la secuencia de imágenes de lapso de tiempo. Convierta las imágenes a escala de grises de 8 bits e inicie una sustracción de fondo con un radio de barra rodante de 50 píxeles.

A continuación, abra el complemento Time Series Analyzer V3 y arrastre la región de interés al complemento. En el administrador de la región de interés, haga clic en Agregar. En el complemento Time Series V3, haga clic en Obtener intensidad total.

A continuación, guarde los resultados e integre los datos. Después de su preparación, los sinaptosomas expresan fosfatidilserina en sus membranas externas, lo que sugiere una pérdida de función, y que puede ser reconocida por los receptores de fosfatidilserina en los astrocitos y la microglía. A medida que los sinaptosomas conjugados por el indicador de pH se fagocitan, emiten fluorescentes de color rojo brillante.

Para cuantificar la fagocitosis de las células gliales, se puede medir el área de la señal de fluorescencia roja, o índice fagocítico. Aunque los astrocitos son eficientes en la fagocitación de un gran número de sinaptosomas conjugados con indicadores de pH, la microglía es más rápida en engullir y degradar los sinaptosomas. Curiosamente, los factores secretados por astrocitos, que están contenidos en el medio condicionado por astrocitos, son esenciales para aumentar la fagocitosis mediada por astrocitos y microglía.

Además, los astrocitos knockout MEGF10 de ratón demostraron una capacidad fagocítica significativamente deteriorada en comparación con las células de tipo salvaje. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia y la biología de las células gliales exploraran los mecanismos implicados en la modulación de la fagocitosis de las células gliales como un método potencial para el tratamiento de diversos trastornos neurológicos.