Name: Enfoque del Canal Semicircular posterior para la entrega del Gene de oído interno en ratón Neonatal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: Aprende el enfoque del canal semicircular posterior para la entrega de genes en el oído interno de ratones neonatos. Esta técnica quirúrgica permite perfundir todo el oído interno de manera eficiente y reproducible.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de la NIDCD División de intramuros investigación /NIH (DC000082-02 para W.W.C.), así como DC000081 a base de proyección de imagen avanzada. Estamos agradecidos por el personal de Animalario NIDCD para el cuidado de nuestros animales.

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el cuidado Animal y uso en el Instituto Nacional en sordera y otros trastornos de la comunicación (NIDCD ASP1378-15).
1. preparación y configuración del procedimiento
<ol><li>Esterilizar todos los instrumentos de óxido de etileno en el inicio del experimento. Entre los animales, limpiar instrumentos usando esterilización del grano.</li>
	<li>Cargar la solución con terapia génica viral en una micropipeta en el inyector de micro. Los vectores virales utilizados en este estudio fue AAV2/8-whirlin (1 x 1013 copias de genoma por mililitro, consulte la tabla de materiales). Nota: Típicamente, volumen total de 1,1 μl se carga en la micropipeta.</li>
</ol>2. anestesia
Nota: La cepa de ratón utilizada en este estudio es el ratón whirler. Mutantes homocigóticos (Whrnwi/wi) y hermanos de camada heterozigóticos (Whrn+ wi) fueron utilizados.
<ol><li>Lugar de la madre en una jaula separada (separada de la basura).</li>
	<li>Coloque la jaula casera que contiene basura (P0 - P5 PUP) sobre una almohadilla de calor recirculación (set a 37,5 ° C) para mantener calientes los ratones.</li>
	<li>Cortar la parte del pulgar de un guante de látex y colocar un cachorro en el mismo.</li>
	<li>Ponga el cachorro en pulgar guante de látex en un cubo de hielo durante 2 minutos.</li>
	<li>Coloque el cachorro anestesiado en un paquete de congelación plástico plaza comercial grande con una gasa de 4 "x 4" entre el cachorro y la superficie del paquete.</li>
	<li>Llenar un guante de látex resistente con hielo picado y coloque el guante de hielo alrededor de la cría.</li>
	<li>Verifique si el cachorro está adecuadamente anestesiado por la completa falta de respuesta a diversos estímulos (incluyendo una pizca del dedo del pie firme). Dejar el cachorro en el paquete de hielo para la duración de la cirugía (aproximadamente 5-10 min). Nota: Se recomienda dejar los cachorros en el paquete de hielo para no más de 15 minutos durante la cirugía.</li>
</ol>3. vía de abordaje (figura 1)
<ol><li>Limpiar la piel detrás del oído con un paño de yodo y un paño con alcohol una vez que el animal está anestesiado.</li>
	<li>Haga una incisión postauricular ~ 2 mm detrás de la oreja usando micro tijeras y dividir el músculo esternocleidomastoideo con micro tijeras.</li>
	<li>Identificar el nervio facial y la bulla. La bulla es cartilaginosa y semitransparente a esta edad y se encuentra medial al nervio facial. La arteria stapedial puede verse a través de la bulla a esta edad, que es un punto de referencia útil.</li>
	<li>Seguir el nervio facial superior y posteriorly para localizar el canal semicircular posterior (PSCC). Quitar las fibras musculares y tejido blando que cubre el canal semicircular posterior con micro tijeras. Nota: La PSCC es cartilaginosa a esta edad.</li>
	<li>Penetrar la PSCC utilizando una micropipeta de vidrio (~ 10 μm de diámetro) en el inyector de micro.</li>
	<li>Inyectar la terapia génica viral en el oído interno. Nota: Por lo general, un total de 20 inyecciones de 49 nL de la terapia del gene se entregan en el canal semicircular posterior más de ~ 40 s (μL volumen total ~ 1). El título viral utilizado era 1 x 1013 copias de genoma / mL.</li>
	<li>Cerrar la incisión de piel con una sutura de poligalactina 5-0.</li>
</ol>4. posoperatorio cuidado
<ol><li>Colocar el cachorro sobre una almohadilla calentadora para restablecer la temperatura normal del cuerpo durante la recuperación de la anestesia con el manual constante estimulación/balanceo con guantes dedos humanos.</li>
	<li>Una vez que el cachorro está despierto, colocar en su jaula casera.</li>
	<li>Acariciar cada cachorro con un hisopo de algodón que ha sido expuesto a las camas jaula casera. Nota: El propósito de esto es que los ratones huelen como lo hicieron antes de la cirugía, lo que aumenta la probabilidad de que la madre vuelva a aceptar después de la cirugía de su camada. Si es posible, orina de la madre puede ser recogido y frotado en los cachorros con un hisopo de algodón para disminuir aún más la probabilidad de rechazo.</li>
	<li>Aplicar aceite mineral al nariz de la madre a desensibilizar su8y reintroducir a la madre en la jaula de la casa.</li>
</ol>

<ol><li>Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for sensorineural hearing loss.</a> Ear Hear. 36, 1-7 (2015).</li>
<li>Askew, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmc+gene+therapy+restores+auditory+function+in+deaf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice.</a> Sci Transl Med. 7, 295(2015).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75, 283-293 (2012).</li>
<li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+restores+auditory+and+vestibular+function+in+a+mouse+model+of+Usher+syndrome+type+1c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c.</a> Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).</li>
<li>Isgrig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Balance+and+Auditory+Functions+in+a+Mouse+Model+of+Usher+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome.</a> Mol Ther. 25, 780-791 (2017).</li>
<li>Lentz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+hearing+and+vestibular+function+by+antisense+oligonucleotides+in+a+mouse+model+of+human+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness.</a> Nat Med. 19, 345-350 (2013).</li>
<li>Shibata, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+Prevents+Autosomal-Dominant+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss.</a> Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).</li>
<li>Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+care+and+use+of+mammals+in+neuroscience+and+behavioral+research%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp+Top+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research.</a> Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).</li>
<li>Chien, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Hair+Cell+Stereocilia+Morphology+in+Inner+Ears+of+Deaf+Whirler+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice.</a> Mol Ther. 24, 17-25 (2016).</li>
<li>Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lipopolysaccharide+compromises+the+blood-labyrinth+barrier+and+increases+entry+of+serum+fluorescein+into+the+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).</li>
<li>Okada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+targeting+mouse+vestibule+using+adenovirus+and+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors.</a> Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).</li>
<li>Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy+with+ancestral+AAV+in+adult+mice%3A+complete+transduction+of+inner+hair+cells+without+cochlear+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction.</a> Sci Rep. 7, 45524(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen ninguna divulgación pertinentes para hacer.

Se han descrito varios abordajes quirúrgicos para tener acceso a roedores interior de orejas. Cochleostomy y enfoques de ventanas redondas son más utilizados para acceder a la cóclea, mientras que el canal semicircular posterior y el saco endolinfático enfoques se suelen utilizar para acceder a los órganos vestibulares1. En un estudio reciente, mostramos canal semicircular posterior inyecciones de terapia génica viral dio lugar a la alta eficacia de transducción de la célula de pelo en los órganos...

Oído interno la terapia génica es un campo de rápido desarrollo de la investigación. Se ha aplicado en varios modelos de animales para combate ototoxicidad, traumatismo de ruido y de pérdida de audición hereditaria1. Varios estudios recientes han demostrado la recuperación funcional de la audición y las funciones de balance en ratones mutantes después de oído interno gene terapia entrega2,3,4,5,6, 7. uno de los principales factores en determinar el éxito de la terapia génica de oído interno es el método quirúrgico utilizado para acceder el oído interno. Idealmente, el acercamiento quirúrgico sería fácil de realizar, los hitos anatómicos sería consistente y fácil de identificar y la transducción resultante de tipos celulares específicos sería alta.
En un estudio reciente, demostró que cuando la terapia génica viral fue inyectada a través del canal semicircular posterior del ratón mutante whirler (un modelo de pérdida de la audición y la disfunción vestibular), transducción eficiente de células de pelo sensoriales fue visto en el vestibular órganos, así como en la cóclea5. La alta eficiencia de transducción de la célula de pelo sensorial dio lugar a la mejora de las funciones auditivas y vestibulares en estos ratones mutantes.
En este artículo, describimos en detalle el enfoque del canal semicircular posterior para tener acceso al oído interno de ratón neonatal.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de operación Microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td>OPMI Pico ENT. Otros microscopios de disección también funcionarían.</td></tr><tr><td>Micro-forcepts</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10, 11295-51</td><td>#5 y #55</td></tr><tr><td>Dumont Micro-tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Nanolitro2000 microinyector</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Mastex</td><td>Modelo 500/600</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Suturas Vitryl</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV8-whirlin</td><td>Vector Biolabs</td> Pipeta de <td></td><td></td></tr><tr><td>vidrio</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10 Vidrio de</td><td>borosilicato</td></tr></tbody></table>

enfoque del canal semicircular posterior para la entrega del gene de oído interno en ratón neonatal

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Oído interno la terapia génica ofrece gran promesa como tratamiento potencial para la pérdida de oído y mareos. Uno de los determinantes críticos del éxito de la terapia génica de oído interno debe encontrar un método de entrega que se traduce en eficiencia de transducción consistente de tipos celulares específicos y reducir al mínimo pérdida de la audición. En este estudio, describimos el enfoque del canal semicircular posterior como un método viable para la entrega del gene de oído interno en ratones neonatales. Mostramos que entrega del gene a través del canal semicircular posterior es capaz de inundar todo oído interno. La fácil identificación anatómica del canal semicircular posterior, así como mínima manipulación del hueso temporal necesario, hacer este quirúrgico acercarse una opción atractiva para la entrega del gene de oído interno.

Inyección de whirlin AAV8 terapia génica en ratones neonatales whirler a través del canal semicircular posterior dio lugar a whirlin expresión (verde) en células de pelo utricular (figura 2), con la eficiencia global de la infección del 53,1% (SD 38.1, n = 28)5 . Células transduced había alargado estereocilios (rojo) en comparación con las células de pelo de orejas no contralaterales (5.35 μm ± 2.11 vs 3,20 ± 0.34 μm, respectivamente)<...

En este estudio, describimos el enfoque del canal semicircular posterior como un método confiable para la entrega del gene de oído interno en ratones neonatales. Mostramos que entrega del gene a través del canal semicircular posterior es capaz de inundar todo oído interno.

Enfoque del Canal Semicircular posterior para la entrega del Gene de oído interno en ratón Neonatal

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

El objetivo general de este procedimiento es acceder al oído interno del ratón para la administración de genes. Este método puede ayudar a administrar la terapia génica al oído interno del ratón de manera eficiente. Las principales ventajas de esta técnica es que es fiable y fácil de aprender.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al pequeño tamaño del oído interno del ratón. Sin embargo, con la práctica, la mayoría de las personas pueden completar una disección quirúrgica en diez minutos. Comience el procedimiento con instrumentos estériles y encienda el esterilizador de perlas para limpiar los instrumentos entre animales.Cargue el virus terapéutico en una micropipeta de diez micras de diámetro conectada a un microinyector. El vector viral utilizado en nuestros experimentos es AAV28-whirlin con un título de uno por diez a 13 copias del genoma por mililitro. Para este video, se utilizó un tinte azul de metileno para facilitar la visualización.Limpie la piel detrás de la oreja con tres exfoliantes de betadine seguidos de una toallita con alcohol. Luego, use micro tijeras para hacer un postauricular aproximadamente dos milímetros detrás de la oreja y divida el tejido blando subyacente. Identificar el nervio facial y la bulla.El músculo esternocleidomastoideo se encuentra perpendicular al nervio facial. La arteria estapedial se puede ver a través de la bulla, que es un punto de referencia útil. Siga el nervio facial superior y posteriormente para localizar el canal semicircular posterior.Utilice las microtijeras para eliminar las fibras musculares y el tejido blando que recubre el canal semicircular posterior. A continuación, penetre en el canal semicircular posterior con la micropipeta de vidrio cargada en el microinyector e inyecte el colorante en el oído interno. Por lo general, se administran un total de 20 inyecciones de 49 nanolitros en el canal semicircular posterior durante 40 segundos para un volumen total de aproximadamente un microlitro.Retire la pipeta inmediatamente después de administrar el último volumen. Luego, cierre la incisión en la piel con una sutura de poliglactina 5-0. La inyección de AAV8-whirlin en ratones neonatos whirler, como se muestra en este video, dio como resultado la expresión de whirlin en verde en las células ciliadas utricular .Las células ciliadas transducidas tenían estereocilios alargados que se mostraban en rojo en comparación con las células ciliadas de las orejas contralaterales no inyectadas. La inyección posterior en el canal semicircular de AAV8-whirlin también dio lugar a la transducción de células ciliadas cocleares en los ratones whirler. Las células ciliadas transducidas expresaban remolinos en las puntas de los estereocilios y tenían estereocilios alargados en comparación con las células ciliadas de las orejas contralaterales no inyectadas.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el ITB y la prueba estereoscópica para responder a preguntas adicionales como si la entrega de genes del oído interno tiene un efecto sobre las funciones auditivas y vestibulares. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la entrega de genes en el oído interno exploraran los defectos de la entrega de genes en el oído interno del ratón.

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Investigación

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Medicina

La oreja de ratón interno es un órgano sensorial placoda derivada del desarrollo cuyo programa se elaboró ​​durante la gestación. Se define...

Transferencia de genes a la oreja del ratón en desarrollo por el interior<em&gt; En Vivo</em&gt; La electroporación

Fuente: Kozin, E. D., et.al. Visualización directa del núcleo coclear dorsal murino para la estimulación optogenética de la vía auditiva. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra la transferencia de genes mediada por virus al núcleo coclear dorsal (DCN) del ratón para permitir la estimulación auditiva inducida por la luz. Un vector viral que codifica opsina, un canal iónico sensible a la luz, se inyecta en el DCN después de una craneotomía y aspiración cerebelosa para acceso directo. Las opsinas...

Transferencia de genes mediada por virus al núcleo coclear dorsal del ratón para estimulación auditiva inducida por luz

Este video muestra la canalostomía, un procedimiento que permite la administración local de fármacos en el oído interno de un ratón a través del canal semicircular con un daño mínimo a la audición y la función vestibular. Este método permite la inoculación de vectores virales, productos farmacéuticos y moléculas pequeñas en el oído interno del ratón.

Canalostomía para la administración local de fármacos en el oído interno de un ratón adulto

Fuente: Akil, O., et al., Método quirúrgico para la administración de genes mediados por vía viral al oído interno del ratón a través de la membrana de la ventana redonda. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el procedimiento de administración de un gen terapéutico en el oído interno de un cachorro de ratón con pérdida auditiva inducida genéticamente. Usando un vector viral adenoasociado (AAV), el gen se inyecta a través de la membrana de la ventana redonda, lo que permite que las partículas...

Terapia génica basada en vectores virales para la restauración de la audición en un modelo de ratón

El abordaje quirúrgico postauricular descrito permite una administración rápida y directa en el lápido timpático coclear del ratón, al tiempo que minimiza la pérdida de sangre y la mortalidad animal. Este método se puede utilizar para la terapia coclear mediante la administración molecular, farmacológica y viral a ratones posnatales a través de la membrana de la ventana redonda.

Método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus de la oreja del ratón Interior a través de la ventana de membrana Ronda

Presentamos un método que describe el aislamiento y cultivo de explantes cocleares del oído interno de ratones embrionarios.  También demostramos un método para la transferencia de genes a explantes cocleares a través de electroporación de onda cuadrada. El cultivo in vitro de explantes, junto con la técnica de transferencia de genes, permite a los investigadores estudiar los efectos de la alteración de la expresión génica durante el desarrollo.

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

El objetivo de este protocolo es esbozar un enfoque quirúrgico para proporcionar acceso directo al núcleo coclear dorsal en un modelo murino.

La visualización directa de la murino Dorsal coclear Núcleo de optogenética La estimulación de la vía auditiva

Aquí se describen y comparan dos enfoques de microcirugía para la administración local de fármacos al oído interno en términos de impacto en los parámetros auditivos, la citoarquitectura coclear y la expresión de marcadores inflamatorios.

Estudio comparativo de los métodos de entrega de fármacos dirigidos a la oreja del ratón interno: Bullostomy vs. Inyección transtimpánicos

El objetivo de este protocolo es demostrar la preparación, cultivo, tratamiento e inmunotinción de los explantes cocleares murinos neonatales. La técnica puede utilizarse como una herramienta de cribado in vitro en la investigación auditiva.

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Divulgamos un método quirúrgico para administrar medicamentos al oído interno de un primate no humano, el tití común (Callithrix jacchus), a través de la membrana de ventana redonda.

Un procedimiento quirúrgico para la administración de medicamentos para el oído interno en una no humanos primates común tití (Callithrix jacchus)

Aquí describimos el procedimiento de canalostomy que permite la entrega del local de la droga en los oídos interiores de ratones adultos y neonatales a través del canal semicircular con mínimo daño a la función auditiva y vestibular. Este método puede utilizarse para inocular vectores virales, productos farmacéuticos y pequeñas moléculas en el oído interno de ratón.

Canalostomy como un abordaje quirúrgico a la entrega del Local de la droga en los oídos interiores de ratones adultos y Neonatal

Aprende el enfoque del canal semicircular posterior para la entrega de genes en el oído interno de ratones neonatos. Esta técnica quirúrgica permite perfundir todo el oído interno de manera eficiente y reproducible.

Enfoque del Canal Semicircular posterior para la entrega del Gene de oído interno en ratón Neonatal

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