Una identificación basada en redes neuronal desarrollo competentes o incompetentes adulto de ovocitos de ratón

El objetivo general de este procedimiento es la identificación de occitos con capacidad de desarrollo posterior mediante una herramienta no invasiva. La principal ventaja de este método es que con la simple observación de los movimientos de los ovocitos que se producen durante la maduración in vitro, se puede evaluar el potencial de desarrollo de los gametos femeninos. Esta técnica se basa en la obtención de imágenes de lapso de tiempo junto con la velocimetría de imágenes de partículas, un análisis basado en redes neuronales.

Aquí, describiremos los pasos tomados para demostrar que los ovocitos de ratón durante la transición de la etapa vesical germinal a la metafase dos, muestran un perfil diferente de dichos movimientos plásmicos significativamente correlacionados con su competencia o incompetencia en el desarrollo. Según la Organización Mundial de la Salud, la infertilidad es una patología que afecta a alrededor del 20 por ciento de las parejas y, además, un tercio de las mujeres que se someten a un tratamiento contra el cáncer corren el riesgo de sufrir una insuficiencia ovárica prematura. Esto corresponde a unas 300.000 o 30.000 mujeres en países como Estados Unidos o Italia, respectivamente.

El diseño de procedimientos no invasivos para la identificación de la competencia del desarrollo ovocito ayudaría a mejorar el éxito general de los resultados del embarazo. Aquí, damos detalles de los pasos más críticos del procedimiento desarrollado para el ratón, con el fin de que esté fácilmente disponible para ser probado y utilizado por otras especies de mamíferos como bovinos o humanos. Los ovarios se transfieren en una placa de Petrie que contiene medio M2 precalentado y equilibrado y 37 grados centígrados y cinco por ciento de CO2.

Si el oviducto y algo de grasa todavía están presentes alrededor del ovario, deben extirparse. Luego, sosteniendo el ovario con un par de pinzas, se perfora su superficie con una aguja estéril de 1G. Los ovarios perforados se extraen del medio M2 y, utilizando una micropipeta manual, se realiza el primer paso a un nuevo medio M2 limpio, y luego se pipetea durante unos segundos hasta que las células del cúmulo que rodean el ovocito se eliminan por completo.

A continuación, los ovocitos se transfieren en gotas de 20 microlitros de medio M2 y, si persisten algunas células del cúmulo, se eliminan completamente a través de varios pasajes de gota a gota hasta que las células del cúmulo se eliminan por completo. Para preparar Hoechst 33342 a una concentración final de 0,05 microgramos por mil, comenzamos con una solución suave de Hoechst a una concentración de cinco miligramos por mil, preparada en pbs de una sola vez y se diluye aún más hasta obtener la concentración requerida. Se colocan microgotas de 3,5 microlitros de solución de Hoechst en el fondo de la tapa de una placa de Petrie y cada ovocito diluido se transfiere en una sola gota de Hoechst, teniendo cuidado de reducir la exposición a la luz durante el proceso de tinción de Hoechst, cubriendo la placa con una tapa oscura.

Después de diez minutos de tinción, los ovocitos se observan bajo un microscopio fluorescente con luz UV. En función de la conformación de la cromatina, se clasifican como nucléolo rodeado, SN, si presentan un anillo de cromatina x-positiva alrededor del nucléolo o como nucléolo no rodeado, NSN, si el nucléolo carece de un anillo de cromatina x-positiva y la cromatina general aparece dispersa en el nucléolo. Se colocan cuatro gotas de dos microlitros de medio alfa mem en una placa de Petrie con fondo de vidrio teniendo cuidado de mantener las gotas dentro de una distancia específica, las gotas se superponen con aceite mineral precalentado y eculibrado y se transfieren un total de tres a cuatro ovocitos a cada gota.

La placa de Petrie se transfiere a la cámara de incubación de un microscopio de lapso de tiempo, lo que permite el mantenimiento prolongado de la temperatura de la cilación a 37 grados centígrados y cinco por ciento de CO2 y la iluminación con luz LED roja. Antes del análisis de time-lapse, utilizando el software BioStation, se establecen las coordenadas de cada gota para automatizar el paso de una gota a la siguiente durante la rutina de time-lapse. Los fotogramas de lapso de tiempo se toman a intervalos de ocho minutos durante un total de 15 horas.

A continuación, las películas grabadas se analizan utilizando el software CellPave, que permite la detección de movimientos citoplasmáticos expresados en términos de vectores de velocidad. En primer lugar, con la herramienta CellPave se delimita manualmente el perímetro de cada ovocito. A continuación, el software calcula la velocidad del movimiento citoplasmático que se produce en la comparación entre dos fotogramas de lapso de tiempo consecutivos y la expresa colocando una flecha de color cuya intensidad y longitud de color define la velocidad y la dirección de los movimientos.

El histograma debajo del ovocito que se ve aquí describe la velocidad general del movimiento citoplasmático a lo largo del período de registro de 15 horas de un ovocito SN. El mismo tipo de análisis se realiza en un ovocito NSN. Obsérvese el retraso en el pico de extrusión del cuerpo polar uno que muestra el ovocito NSN en comparación con el ovocito SN.

La parte inferior de la pantalla muestra el patrón temporal de la velocidad de movimiento citoplasmático del ovocito. La velocidad se calcula comparando dos fotogramas consecutivos. A continuación, los datos brutos de la velocidad del movimiento citoplasmático se exportan a una hoja de Excel que informa, en las filas, de la secuencia de Frens y en las columnas, del ovocito analizado.

En el lado izquierdo, los datos de un ovocito SN, mientras que en el lado derecho, los de los ovocitos NSN. Los datos de los ovocitos SN o NSN se dividen en 10 subgrupos. Nueve se utilizan para el entrenamiento, color verde.

Y uno para las pruebas a ciegas, de color rojo. Este procedimiento se repite un total de 10 veces. Cada vez que se cambia la muestra de prueba a ciegas.

A continuación, los datos se examinan a través de una red neuronal artificial de realimentación, o FANN. El FANN está construido para analizar todos los fotogramas de lapso de tiempo, aquí llamados Neuronas de entrada"Estos últimos están conectados a tres neuronas ocultas, a su vez vinculadas a dos neuronas de salida. Una salida da la probabilidad de que la entrada sea un ovocito competente.

La otra, por el contrario, que el insumo es un ovocito incompetente. La comparación entre los dos resultados predice la competencia mental de los ovocitos con una precisión del 91,03 por ciento. La técnica se ha configurado para ovocitos de ratón, como se muestra aquí.

Sin embargo, el retiro futuro es para probarlo en ovocitos humanos. De hecho, los procedimientos no invasivos a partir del análisis de la calidad de los ovocitos son especialmente necesarios en el campo de las tecnologías de reproducción artificial.