En Vivo Evaluación del desarrollo del callo de fractura durante la cicatrización ósea en ratones usando un dispositivo de osteosíntesis de MRI-compatible para el fémur de ratón

El objetivo general de esta técnica es utilizar la resonancia magnética, o RM, para la evaluación longitudinal del desarrollo del callo de fractura murina durante la cicatrización ósea. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la curación ósea, como cómo se desarrollan los callos de fractura con el tiempo en diferentes modelos de ratón. Las principales ventajas de esta técnica son que el desarrollo del callo de fractura se puede monitorizar in vivo en tiempo real y que el fijador externo aplicado proporciona un modelo de curación de fracturas altamente estandarizado.

La demostración del procedimiento de resonancia magnética estará a cargo de Anne Subgang, una técnica del centro de imágenes de animales pequeños. Antes de comenzar el procedimiento, confirmar el nivel adecuado de sedación por falta de respuesta al pellizco del dedo del pie e inyectar al ratón por vía subcutánea una dosis única de antibióticos en un depósito de líquido de dos veces 250 microlitros de cloruro de sodio al 0,9%. Aplique ungüento en los ojos del animal y coloque el ratón sobre una almohadilla térmica de 37 grados centígrados.

Retire el pelaje de la extremidad trasera derecha y frote el área quirúrgica con un desinfectante a base de alcohol. Coloque un paño estéril sobre el animal dejando expuesta el área quirúrgica y cubra la pata trasera derecha con un pequeño trozo de un guante estéril. Frote el área quirúrgica tres veces más con desinfectante.

Luego, usando un bisturí esterilizado en autoclave, haga una incisión longitudinal de aproximadamente un centímetro en la piel a lo largo del lado interior del fémur derecho y use microtijeras y pinzas para separar sin rodeos los músculos bíceps femoral y vasto lateral. Cortar la inserción del tendón en el trocánter del fémur para permitir el libre acceso a la parte anterolateral del hueso cuidando de que se conserve el nervio ciático, y colocar el fijador externo paralelo al fémur. Con una broca de 0,45 milímetros, taladre manualmente orificios a través de la corteza.

Y comenzando por los extremos más proximales y distales, coloque pasadores de montaje cerámicos en los orificios. Cuando se hayan colocado todos los clavos, humedezca el hueso con un pequeño volumen de solución salina estéril y use una sierra de alambre Gigli de 0,4 milímetros para crear una osteotomía de 0,4 milímetros a través del hueso del orificio entre los dos clavos internos. Enjuague cuidadosamente el espacio de osteotomía con dos mililitros de solución salina estéril para eliminar cualquier fragmento de hueso entre las dos cortezas fracturadas y use una sutura reabsorbible continua para adaptar los músculos, seguida de una adaptación de la piel con suturas interrumpidas no reabsorbibles.

Luego, limpie el área quirúrgica con desinfectante y devuelva al ratón a su jaula con monitoreo hasta la recuperación completa. Tan pronto como tres días después de la cirugía, inserte el fijador externo con cuidado en un dispositivo de montaje hecho a medida y coloque el ratón anestesiado en una base con temperatura controlada para introducirlo en el dispositivo de resonancia magnética. Fije rígidamente el fijador externo al dispositivo de montaje en la bobina principal de cuatro elementos y utilice un sistema de resonancia magnética de animales pequeños de alto campo dedicado que funcione a 11,7 tesla para aplicar una secuencia de eco de turboespín de múltiples cortes suprimida por la grasa de la densidad de protones a la fractura.

Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, abra los datos en el software de análisis de imágenes adecuado e introduzca el tamaño del vóxel como 0,05 por 0,05 por 0,35 milímetros cúbicos. Para segmentar los diferentes tejidos en el callo de fractura con umbrales semiautomáticos basados en su intensidad, primero haga clic en el campo editar nueva etiqueta y haga clic en Agregar material. Cambie el nombre del material a callo y use la herramienta de lazo para distinguir el área del callo de los tejidos circundantes en función de la señal hipointensa del periostio.

Haga clic en Añadir al material y, a continuación, haga clic en Añadir material y cambie el nombre del material a cartílago. Con la herramienta de umbral, segmente el cartílago y seleccione solo el material actual del callo. A continuación, haga clic en cartílago y Añadir al material.

Cuando se hayan segmentado todos los tejidos, haga clic en Generar superficie, aplique Ninguno para el tipo de suavizado y haga clic en Vista de superficie para generar reconstrucciones 3D de los fémures fracturados en función de los datos de segmentación de tejidos. Un procedimiento quirúrgico exitoso puede confirmarse mediante una resonancia magnética de la fractura que muestra los cuatro clavos en el centro de la diáfisis femoral con un espacio de osteotomía de entre 0,3 y 0,5 milímetros. En el día 10 después de la cirugía, la evaluación de las exploraciones longitudinales durante el proceso de curación de la fractura revela tejido cartilaginoso en el centro del callo de la fractura y tejido óseo en la periferia de la fractura.

Tanto el tejido cartilaginoso como el óseo aumentan hasta el día 14. A continuación, el tejido cartilaginoso disminuye hasta el día 21, momento en el que se puede observar un puente óseo. Después de la segmentación de los diferentes tejidos en el callo de fractura como se acaba de demostrar, se puede generar una exploración completa del fémur en 3D con la corteza madura en gris, los clavos cerámicos marcados en amarillo, el tejido blando del callo en verde, el tejido cartilaginoso en rojo y el tejido óseo calloso indicado en púrpura.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aplicar un fijador externo al fémur del ratón para crear la osteotomía del fémur e insertar un ratón en un dispositivo de resonancia magnética para garantizar una posición de exploración estandarizada. Una vez dominado, la aplicación del fijador externo y la técnica de osteotomía pueden completarse en 20 a 30 minutos si se realizan correctamente.