Utilizando el análisis filogenético para investigar origen de genes eucariotas

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo fitogenético, como cómo recolectar secuencias y cómo seleccionar el modelo de cálculo correcto. La principal ventaja de esta técnica es que es muy fácil de aprender. En general, aquellos que son nuevos en este método pueden tener dificultades simplemente porque no saben cómo manejar los datos debido a la falta de conocimiento básico de los principios y métodos de filogenia.

Este método se desarrolló por primera vez cuando analizamos la alineación de los genes eucariotas SWEET. La demostración visual de este método es fundamental, ya que hay una gran cantidad de opciones y configuraciones para diferentes aspectos de la alineación. Comience este procedimiento con la selección de 35 proteínas SWEET candidatas de organismos eucariotas unicelulares como se describe en el protocolo de texto.

Alinea las 35 secuencias SWEET introduciéndolas en Clustal Omega. Copie y pegue las secuencias de proteínas en formato FASTA en el cuadro de entrada o cargue un archivo de secuencia en formato FASTA. Especifique que se trata de una secuencia de aminoácidos haciendo clic en el icono situado debajo del menú desplegable en la sección del paso uno.

Especifique el formato de salida y otros parámetros en la sección del paso dos si es necesario. Para este estudio, establezca el formato de salida como Clustal sin número y deje los demás parámetros en la configuración predeterminada. En la mayoría de los casos, los parámetros predeterminados funcionan bien sin ninguna especificación.

Envíe y ejecute la alineación en la sección del paso tres. Puede tardar desde varios segundos hasta minutos hasta que se finalice la alineación. En el panel Resumen de resultados, haga clic con el botón derecho en el enlace debajo de Alineación en formato CLUSTAL y guarde las secuencias alineadas como 35.clustal.

Para abrir el archivo de resultados de alineación en BioEdit, haga clic en Secuencia y seleccione Editar estado de ánimo en el primer menú desplegable en el panel principal de BioEdit. A continuación, haga clic en Editar residuos en el submenú. Seleccione las secuencias que sobresalen en el lado izquierdo de la alineación con el cursor y haga clic en el icono Eliminar en el menú Editar para eliminar las secuencias seleccionadas.

Seleccione y elimine las secuencias en el lado derecho del primer dominio de saliva MtN3 y guarde las primeras secuencias de dominio de saliva MtN3 recortadas como 35-1.fas. Del mismo modo, elimine las secuencias del lado izquierdo y derecho del segundo dominio de saliva MtN3 y guárdelo como 35-2.fas. La primera y la segunda secuencia de dominio de saliva MtN3 se pueden predecir con ritmo o TMHMM de antemano.

Abra el archivo 35-1. fas con MEGA y haga clic en Alinear cuando se le solicite. En el menú Editar, haga clic en Seleccionar todo.

A continuación, haga clic en Seleccionar secuencias. Los nombres y secuencias de los taxones se seleccionarán en negro. Elija Copiar en el menú Editar para copiar las secuencias en el portapapeles y, a continuación, pegar las secuencias copiadas en un archivo doc.

En el archivo doc, reemplace todos los signos de número por el signo mayor que y, a continuación, elimine los caracteres no relacionados para convertirlos al formato FASTA. Agregue 1 al final de cada nombre de taxón para marcarlos como las primeras secuencias de dominio de saliva MtN3. Procese las segundas secuencias de dominio de saliva MtN3 siguiendo el mismo método y agregue 2 después de cada nombre de taxón.

Ahora combine la primera y la segunda secuencia de dominio de saliva MtN3 en formato FASTA en un archivo doc. Para ello, cargue de nuevo las secuencias combinadas en Clustal Omega y alinee las secuencias como antes. Guarde el resultado como 35realigned.clustal.

Abra el archivo clustal 35realigned. en BioEdit. Elimine los residuos de aminoácidos desiguales en cualquiera de los extremos de las secuencias alineadas y, a continuación, guarde las secuencias como 35realigned.fas.

Haga clic en Sí cuando se le advierta de que algunos caracteres no estándar no se pueden guardar. Abrir 35realineado. fas en MEGA.

Haga clic en el menú Datos y elija Exportar alineación. A continuación, guarde la alineación en formato POP como 35. siguiente para su uso posterior en MR Base.

Mientras tanto, haga clic en el icono Modelos en el panel principal de MEGA. Elija Buscar los mejores modelos de proteínas de ADN y haga clic en Aceptar en la ventana emergente. Haga clic en Calcular para comenzar el proceso de búsqueda de modelos.

Se abrirá un nuevo panel de progreso. Este proceso dura de varios minutos a varios días, dependiendo de la complejidad de las secuencias cargadas y del rendimiento del equipo. Una vez finalizado el proceso de búsqueda del modelo, se abrirá una tabla que muestra los resultados.

La puntuación BIC más pequeña se enumerará en primer lugar, seguida de una serie de modelos diferentes con puntuaciones BIC que aumentan gradualmente. El primer modelo LG+G+F con la puntuación BIC más baja es el modelo recomendado para el árbol ML basado en el 35realigned. FAS.

A continuación, haga clic en el icono de Filogenia en el panel principal de MEGA. Haga clic en Construir/Probar el árbol de máxima verosimilitud y, a continuación, haga clic en Sí en el panel emergente. Se abrirá una nueva ventana que muestra los diferentes parámetros que deben especificarse.

Primero, establezca el valor de bootstrap en la prueba de la caja de filogenia. 500 o 1, 000 es adecuado en la mayoría de los casos. En el modelo de sustitución, elija aminoácido como tipo de sustitución.

El propósito de elegir un modelo de sustitución es estimar la verdadera diferencia entre secuencias en función de sus estados actuales. Seleccione LG con modelo de frecuencias en el cuadro Modelo y método. En el cuadro Tasas y patrones, seleccione gamma distribuida para describir las variaciones de velocidad entre sitios, como dar más peso a los cambios en sitios que evolucionan lentamente.

En el cuadro Subconjunto de datos, seleccione Eliminación completa para quitar todas las columnas que contengan guiones. Mantenga todos los demás parámetros en sus estados predeterminados. Después de especificar estos parámetros, haga clic en el icono Calcular para iniciar el cálculo.

Se presentará un árbol filogenético de ML cuando finalice el cálculo utilizando MEGA. En el menú desplegable del icono Archivo del panel Árbol, elija Guardar sesión actual para guardar el resultado. En el presente estudio, el resultado se guardó como 35.mas.

En el panel Árbol, se muestran muchos parámetros, incluida la longitud del clado, el estilo del árbol, la topología del árbol, la fuente del nombre del taxón, el tamaño y el color, y se pueden establecer en diferentes opciones. Guarde el archivo de árbol final haciendo clic en el icono de imagen y guarde la figura en diferentes formatos o copie la imagen como fuente para la edición de fotos. Proceda con el análisis de la relación de SWEETs y semiSWEETs, así como con el uso de la construcción del árbol filogenético de alineación de secuencias con MR Base como se detalla en el protocolo de texto.

Los árboles filogenéticos muestran que todos los primeros dominios de saliva MtN3 de las 35 secuencias SWEET se agruparon como un clado y los segundos dominios de saliva MtN3 de las secuencias SWEET se agruparon como otro clado. Además, los resultados de la alineación de los SWEETs y semiSWEETs muestran que algunos semiSWEETs de Alpha-Proteobacteria se alinearon con el primer dominio de saliva MtN3 de las secuencias SWEETs, mientras que los semiSWEETs de Methanobacteria se alinearon con el segundo dominio de saliva MtN3 de las secuencias SWEETs. Estos resultados en conjunto sugieren que los dos dominios de saliva MtN3 que contienen SWEETs podrían derivarse de una fusión evolutiva de un semiSWEET bacteriano y un arqueo.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora o varios días, dependiendo de la complejidad de los datos. Al intentar este protocolo, es importante recopilar secuencias de alta calidad con anticipación. Después de su desarrollo, este protocolo allanó el camino para que los investigadores en evolución exploraran las relaciones entre genes homólogos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir un árbol filogenético.