Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

El objetivo general de este experimento es detectar la fosforilación de Rab10 por LRRK2 utilizando SDS-PAGE con una etiqueta de unión a fosfato. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del Parkinson, como cómo las mutaciones de la enfermedad en LRRK2 afectan a la fosforilación de Rab10. La principal ventaja de esta técnica es que se puede tener una estimación aproximada de la estequiometría de la fosforilación de Rab10 utilizando un simple Western blot.

Muchos de los pasos de este protocolo son bastante estándar y se describen con suficiente detalle en el protocolo de texto que acompaña a este video. Aquí, queremos mostrarle los pasos que más se benefician de la instrucción visual. Prepare placas de células HEK293 transfectadas como se describe en el protocolo de texto.

Con las placas en hielo, aspire y deseche los medios. A continuación, agregue con cuidado dos mililitros de DPBS en la esquina de cada placa y agite las placas para esparcir la solución. A continuación, retire y deseche el DPBS.

A continuación, agregue a cada placa 100 microlitros de tampón de lisis. Incline la placa y use un raspador para esparcir el tampón y liberar el lisado celular. A continuación, aspirar los lisados y transferirlos a tubos de microfuga preenfriados en hielo y esperar 10 minutos.

A continuación, recoja los lisados celulares libres de residuos centrifugando los tubos y transfiriendo los sobrenadantes a nuevos tubos en hielo. A continuación, mida las concentraciones de proteínas de los lisados aclarados mediante el ensayo de Bradford. Para los datos de concentración, prepare muestras de 100 microlitros de los lisados para el análisis en gel.

Preparar lisados más densos para medir el Rab10 endógeno en comparación con la hemaglutinina Rab10 sobreexpresada. Finalice la preparación de las muestras incubándolas a 100 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, almacene las muestras a menos 20 grados centígrados hasta que las necesite durante un máximo de seis meses o más.

Para comenzar, prepare las celdas SDS-PAGE de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, cargue el gel en el depósito y asegúrelo con pinzas aglutinantes. A continuación, llene el tanque con tampón corriente y elimine las burbujas de aire en los pocillos y debajo del gel con una aguja conectada a una jeringa.

Ahora agregue cloruro de manganeso a las muestras y gírelas hacia abajo para eliminar los precipitados. A continuación, cargue el gel con volúmenes iguales de muestra, 10 microgramos de proteína para analizar la hemaglutinina Rab10 sobreexpresada o 30 microgramos de proteína para analizar la Rab10 endógena. Cargue los carriles vacíos con tampón de muestra que contenga cloruro de manganeso.

También complemente el marcador de peso molecular con tampón y cloruro de manganeso para que tenga el mismo volumen que las muestras. Ahora comience a hacer funcionar el gel a 50 voltios. Después de la pila de muestras, aumente el voltaje a 120 para obtener la separación.

Cuando el frente del tinte llegue al fondo de los geles, apague el voltaje. A continuación, lave el gel tres veces de la siguiente manera. Cargue el gel de separación en un baño de tampón de transferencia limpio con EDTA y SDS agregados.

Luego déjalo mecer en una coctelera durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de tres lavados, realice un lavado más utilizando un tampón de transferencia con SDS añadido pero sin EDTA. A continuación, transfiera el gel utilizando un depósito húmedo.

Cargue el tanque en una caja de espuma llena de agua helada, conecte el tanque a una fuente de alimentación e inicie la transferencia. Una transferencia prolongada con un enfriamiento eficiente es esencial para el procedimiento. Después de la transferencia, verifique la transferencia tiñendo la membrana con Ponceau S, seguido de un lavado en TBST de acuerdo con el protocolo de texto.

A continuación, aplique un bloque. Sumerja la mancha en un TBST lechoso y mueva la mancha en una coctelera durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, retire y deseche la solución bloqueante y aplique la solución de anticuerpos primarios.

Ahora balancea la membrana durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos primarios. A continuación, lave la membrana con TBST fresco tres veces como antes.

Después de los lavados, sumerja la mancha en una solución de anticuerpos secundaria e incube la membrana en un balancín durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave la membrana con TBST tres veces una vez más. Ahora desarrolle la membrana.

Agregue un mililitro de solución ECL a una hoja grande de envoltura de plástico. A continuación, coloque la membrana en el ECL y gírela rápidamente para humedecer ambos lados. A continuación, levanta la membrana y déjala escurrir.

Después de escurrir, deje que un borde toque una toalla de papel durante unos cinco segundos para ayudar a absorber el exceso de solución. A continuación, envuelva la membrana en una película transparente rígida sin arrugas y transfiérala a una bandeja negra para la obtención de imágenes. Las células HEK293 se transfectaron con hemaglutinina Rab10 de tipo salvaje y 3xFLAG-LRRK2.

Se probaron quinasas de tipo salvaje inactivas en mutaciones familiares de LRRK2 en la enfermedad de Parkinson. La sobreexpresión conjunta de LRRK2 y Rab10 dio lugar a un importante cambio de banda en el gel P-tag. Por el contrario, la coexpresión con un mutante inactivo de la quinasa no dio lugar a ningún cambio en la movilidad de Rab10, lo que implica a la quinasa como la causa del cambio de banda.

También como se esperaba, las mutaciones familiares de la EP aumentaron el cambio de banda. El sistema de gel P-tag también se utilizó para analizar células de fibroblastos embrionarios albinos suizos 3T3 de ratón tratadas con un inhibidor de LRRK2. El desplazamiento de banda correspondiente a Rab10 endógeno fosforilado desapareció cuando las células fueron tratadas con GSK2578215A.

La misma prueba también se realizó con células humanas A549. En estos experimentos, la eficacia del inhibidor de LRRK2 se validó utilizando el anticuerpo anti-p serina 935 LRRK2, que es un marcador bien establecido de inhibición de LRRK2. Una vez dominada, esta técnica solo necesita 14 minutos adicionales en comparación con un procedimiento regular de Western blot que consiste en lavar los geles antes de la transferencia.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la espectrometría de masas para responder a preguntas adicionales como si los mutantes de FPD fosforilan el mismo residuo de Rab10. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del Parkinson exploraran los niveles endógenos de fosforilación de Rab10 en células cultivadas, así como en tejidos. No olvide que trabajar con microcistina añadida al tampón de lisis puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal adecuado, mientras se preparan los lisados celulares.