Name: Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende a detectar la fosforilación de Rab10 por LRRK2 mediante SDS-PAGE con etiqueta de unión a fosfato. Este método permite estimar la estequiometría de fosforilación en investigación de la enfermedad de Parkinson.

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Agradecemos a Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio, Japón) por proporcionar amablemente la plásmidos codifican 3xFLAG LRRK2 WT y mutantes. También agradecemos a Dr. Dario Alessi (Universidad de Dundee, Reino Unido) por proporcionar amablemente MLi-2 y el plásmido codificación HA-Rab10. Este trabajo fue apoyado por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHI concesión número JP17K08265 (G.I.).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos un método robusto y fácil de detectar Rab10 fosforilación de LRRK2 nivel endógeno basado en la metodología de la etiqueta P. Porque el anticuerpo actualmente disponible contra Rab10 fosforilada sólo funciona con las proteínas sobreexpresadas15, el presente método utiliza la etiqueta P SDS-PAGE es la única manera de evaluar los niveles endógenos de la fosforilación Rab10. Por otra parte, el presente método permite la estimación de la estequiometría de la fosforilación en las célul...

PD es una de las enfermedades neurodegenerativas más comunes, que afecta predominante a las neuronas dopaminérgicas en el cerebro medio, dando por resultado la disfunción de los sistemas de motor en personas de edad avanzada1. Mientras que la mayoría de los pacientes desarrollará PD de manera esporádica, hay familias que heredar la enfermedad. Se han encontrado mutaciones en varios genes vinculados con FPD2. Uno de los genes causales de la FPD es LRRK2, en el que ocho mutaciones sin sentido (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S y I2020T) vinculadas a un dominante heredado FPD llamada PARK8 hasta ahora han sido reportados3,4,5. Varios estudios de Asociación de genoma completo (GWAS) de pacientes con EP esporádicos también han identificado variaciones genómicas en el locus del LRRK2 como factor de riesgo para PD, lo que sugiere que la anormalidad en la función de LRRK2 es una causa común de la neurodegeneración en los esporádicos y PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 es una proteína grande (2.527 aminoácidos) que consiste en un dominio repetición rica en leucina, un Ras de unión a GTP dominio de proteínas complejas (ROC), un C-terminal de dominio, un dominio de la cinasa de serina/treonina proteína y WD40 dominio repetición9ROC (CDR). Las ocho mutaciones FPD localizar en estos dominios funcionales; N1437H y R1441C/G/H/S en el dominio ROC, Y1699C en el dominio de la COR, G2019S y I2020T en el dominio de la cinasa. Puesto que la mutación G2019S, que es lo más frecuentemente encontrado mutación en PD pacientes10,11,12, aumenta la actividad de la quinasa de LRRK2 en 2-3 veces en vitro13, se presume que el aumento anormal de fosforilación de los substratos de LRRK2 es tóxico para las neuronas. Sin embargo, ha sido imposible estudiar si se altera la fosforilación de sustratos fisiológicamente relevantes de LRRK2 en pacientes con EP familiar/esporádico debido a la falta de métodos de evaluación en muestras derivadas.
Fosforilación de la proteína es generalmente detectada por immunoblotting o análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) usando los anticuerpos específicamente reconociendo el estado fosforilado de proteínas o por análisis de espectrometría de masa. Sin embargo, la estrategia anterior a veces no se puede aplicar debido a las dificultades en la creación de anticuerpos específicos de fosforilación. Etiquetado metabólico de las células con fosfato radiactivo es otra opción para examinar niveles fisiológicos de la fosforilación de cuando los anticuerpos específicos de fosforilación no están disponibles. Sin embargo, requiere una gran cantidad de materiales radiactivos y por lo tanto implica algunos equipos especializados para protección radiológica14. El análisis de espectrometría de masa es más sensible frente a estos métodos inmunoquímicos y llegó a ser popular en el análisis de la fosforilación de la proteína. Sin embargo, la preparación de la muestra es desperdiciador de tiempo y costosos instrumentos son necesarios para el análisis.
Un subconjunto de la familia de Rab GTPase como Rab10 y Rab8 fue divulgado recientemente como sustratos fisiológicos directos para LRRK2 basan en el resultado de un análisis a gran escala phosphoproteomic del15. Entonces hemos demostrado que la fosforilación Rab10 fue aumentada por mutaciones de la FPD en fibroblastos embrionarios de ratón y en los pulmones de knockin ratones16. En este informe, optamos por emplear una electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE)-método en el cual una molécula de P-tag es co polimerizada en geles de SDS-PAGE (etiqueta P SDS-PAGE) para la detección de los niveles endógenos de la fosforilación Rab10, basado en porque todavía le faltaba un anticuerpo altamente sensible específico para Rab10 fosforilada. Nosotros hemos podido detectar la fosforilación de Rab8 endógeno debido a la pobre selectividad de anticuerpos disponibles para Rab8 total. Por lo tanto, decidimos enfocarnos en la fosforilación Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 en Thr73 ubicación en el centro de la región altamente conservada "interruptor II". Conservación de los sitios de fosforilación entre proteínas Rab podría ser una de las razones por qué anticuerpos phosphospecific reconociendo distintas proteínas Rab son difíciles de hacer.
La fosforilación de Rab8A por LRRK2 inhibe la Unión de Rabin8, un factor de intercambio del nucleótido guanina (GEF) que activa Rab8A intercambiando el PIB consolidado con GTP15. Fosforilación de Rab10 y Rab8A por LRRK2 también inhibe la Unión de los inhibidores de la disociación de PIB (GDIs), que son esenciales para la activación de las proteínas Rab extrayendo proteínas Rab PIB-limite de membranas15. Colectivamente, se presume que la fosforilación de proteínas Rab por LRRK2 les impide la activación aunque el mecanismo molecular exacto y consecuencias fisiológicas de la fosforilación no quedan claros.
P-etiqueta SDS-PAGE fue inventado por Kinoshita et al. en 2006: en este método, acrilamida covalente fue juntada con la etiqueta P, una molécula captura de fosfatos con alta afinidad, que copolymerized en SDS-PAGE gel17. Porque las moléculas de P etiqueta en un gel de SDS-PAGE selectivamente retardan la movilidad electroforética de las proteínas fosforiladas, etiqueta P SDS-PAGE puede separar proteínas fosforiladas de los no-phosphorylated (figura 1). Si el proteína de interés es fosforilado en residuos múltiples, se observará una escalera de bandas correspondientes a las formas fosforiladas diferencialmente. En el caso de Rab10, observamos sólo una banda cambiada de puesto, lo que indica que Rab10 es fosforilado en Thr73. La gran ventaja de la etiqueta P SDS-PAGE en immunoblotting con anticuerpos específicos de fosforilación es que Rab10 fosforilada puede detectarse por immunoblotting con fosforilación-anticuerpos inespecíficos (es decir, reconocimiento total Rab10) Tras ser trasladado en las membranas, que suele ser más específicos, sensibles y disponibles de fuentes comerciales y académico. Otra ventaja de usar la etiqueta P SDS-PAGE es que se puede obtener una estimación aproximada de la estequiometría de la fosforilación, que es imposible por immunoblotting con anticuerpos específicos de fosforilación o por el etiquetado metabólico de las células con radiactivo fosfatos.
Aparte del uso de acrilamida etiqueta P barata y algunas modificaciones menores relacionados con ella, el método actual de detección de Rab10 fosforilación de LRRK2 sigue un protocolo general de immunoblotting.Por lo tanto, debe ser sencillo y fácilmente ejecutable en cualquier laboratorios donde immunoblotting es una práctica habitual, con cualquier tipo de muestras incluyendo proteínas purificadas, lysates de la célula y homogenados de tejido.

<table><tbody><tr><td><Reactivos fuertes></</td>solución salina tamponada >con <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfato (DPBS)</td><td></td><td></td> de Dulbecco <td>150 mM de NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 en agua MilliQ y esterilizado en autoclave</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-34</td><td></td></tr><tr><td>Hidrógeno disódico de sodiofosfato 12-agua</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de dihidrógeno de potasio</td><td>Wako</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Tripsina (10X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td>Diluido 10 veces con DPBS estéril para la preparación de la solución</td></tr> <tr><td>de trabajoDulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>BioWest</td><td>S1560</td><td>Inactivado por calor a 56 & grados; C por 30 min</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (100X)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina HCl MAX, Lineal, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)</td><td>PolySciences, Inc.</td><td>24765-1</td><td>La solución madre se preparó en 20 mM de HEPES-NaOH pH 7,0 a 1 mg/mL y luego se ajustó el pH a 7,0 con NaOH</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Wako</td><td></td><td>045-28335</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>STAR</td><td>RSP-THA500G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno(10) Octilfenil éter</td><td>Wako</td><td>160-24751</td><td>equivalente a Triton X-100</td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA)</td><td>Wako</td><td>346-01312</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sodio(V)</td><td>Wako</td><td>198-09752</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de sodio</td><td>Kanto Chemical</td><td>37174-20</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Ácido glicerofosfórico Sal disódica Pentahidratado</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17103-82</td><td></td></tr><tr><td>Sodio pirofosfato decahidratado</td><td>Kokusan Chemical 2113899</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcistina-LR</td><td>Wako</td><td>136-12241</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sacarosa Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel completo de inhibidores de proteasas sin EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Disuelva una tableta en 1 ml de agua, que se puede almacenar a -20 & grados; C durante un mes. Úselo en dilución 1:50 para la lisis celular</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Kit de ensayo de proteínas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31607-65</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Wako</td><td>075-00616</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Wako</td><td>021-02911</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>25099-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Wako</td><td>056-06967</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako</td><td>136-01837</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida de unión a fosfato</td><td>Wako</td><td>AAL-107</td><td>Acrilamida P-tag</td></tr><tr><td>40% (p/v) solución de acrilamida</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06119-45</td><td>Acrilamida:Bis = 29:1</td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr>La solución de <td>persulfato de amonio (APS)</td><td>Wako</td><td>016-08021</td> al <td>10% (p/v) se preparó disolviendo el polvo de persulfato de amonio en agua MilliQ</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>166-04831</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374, 1610373, 1610377</td><td>Marcador de peso molecular utilizado en el protocolo</td></tr><tr><td>WIDE-VIEW Marcador de tamaño de proteína preteñido III</td><td>Wako</td><td>230-02461</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-64</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran NC 0.45</td><td>GE Healthcare</td><td>10600007</td><td>Membrana de nitrocelulosa</td></tr><tr><td>Durapore Filtro de membrana</td><td>EMD Millipore</td><td>GVHP00010</td><td>PVDF membrana</td></tr><tr><td>Papeles de filtro No.1</td><td>Advantec</td><td>00013600</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28322-72</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Wako</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>polioxietilenosmonolaurato de orbitán</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Wako</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Leche desnatada en polvo</td><td>Laboratorios Difco</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Immunostar</td><td>Wako</td><td>291-55203</td><td>Solución ECL (Sensibilidad normal)</td></tr><tr><td>Immunostar LD</td><td>Wako</td><td>290-69904</td><td>Solución ECL (Alta sensibilidad)</td></tr><tr><td>Solución de tinción CBB</td><td>casera</td><td></td><td>1 g CBB R-250, 50% (v/v) de metanol, 10% (v/v) de ácido acético en 1 L de agua MilliQ</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td></td></tr><tr><td>CBB decolorante solución</td><td>casera</td><td></td><td>12% (v/v) de metanol, 7% (v/v) de ácido acético en 1 L MilliQ agua</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte</td><td>><fuerte>Número de catálogo</fuerte</td><td>><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA anticuerpo</td><td>Sigma-Aldrich 11583816001</td><td></td><td>Se utiliza a 0,2 &mu; g/mL para inmunotransferencia.</td></tr><tr><td>anti-Rab10 anticuerpo</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#8127</td><td>Utilizado a 1:1000 para inmunotransferencia. La especificidad fue confirmada por CRISPR KO en Ito et al., Biochem J, 2016.</td></tr><tr><td>anti-pSer935 anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab133450</td><td>Utilizado en 1 &mu; g/mL para inmunotransferencia.</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-LRRK2</td><td>Abcam</td><td>ab133518</td><td>Utilizado en 1 &mu; g/mL para inmunotransferencia.</td></tr><tr><td>anti-&alfa;-tubulina anticuerpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>Utilizado en 1 &mu; g/mL para inmunotransferencia.</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-GAPDH</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-32233</td><td>Utilizado a 0.02 &mu; g/mL para inmunotransferencia.</td></tr><tr><td>Peroxidasa AffiniOvejas puras anti-ratón IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td>Utilizado a 0,16 &mu; g/mL para inmunotransferencia.</td></tr><tr><td>Peroxidasa AffiniCabra pura anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td>Utilizado a 0.16 &mu; g/mL para inmunotransferencia.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>InhibitorsGSK2578215A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> La solución madre <td>de MedChem Express</td><td>HY-13237</td><td>se preparó en DMSO a 10 mM y se almacenó a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>MLi-2</td><td>Proporcionado por el Dr. Dario Alessi (Universidad de Dundee)</td><td></td><td>La solución madre se preparó en DMSO a 10 mM y se almacenó a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plásmidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rab10/pcDNA5 FRT A HA</td><td>Proporcionado por el Dr. Dario Alessi (Universidad de Dundee)</td><td></td><td>Este plásmido expresa Rab10 humano marcado con HA amino-terminal.</td></tr><tr><td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)</td><td></td><td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). Este plásmido expresa LRRK2 humano de tipo salvaje marcado con amino-terminal 3xFLAG.</td></tr><tr><td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)</td><td></td><td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante inactivo K1906M quinasa marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Este documento. Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante N1437H FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante R1441C FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante R1441G FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante R1441H FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Este documento. Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante R1441S FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante Y1699C FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante G2019S FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante I2020T FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Forma Series II 3110 Pipeta automática con camisa</td><td></td>de agua</tr><tr><td></td><td>Drummond</td><td>Pipet-Aid PA-400</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta P10</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-10</td><td>0.5&ndash; 10 &mu; </td></tr><tr><td>L Micropipeta P200</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-200</td><td>20&ndash; 200 &mu; L</td></tr><tr><td>Micropipeta P1000</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-1000</td><td>100&ndash; 1000 &mu; L</td></tr><tr><td>Puntas para micropipeta P10</td><td>STAR</td><td>RST-481LCRST</td><td>Puntas estériles</td></tr><tr><td>para micropipeta P200</td><td>FUKAEKASEI</td><td>1201-705YS Puntas</td><td>estériles</td></tr><tr><td>para micropipeta P1000</td><td>STAR</td><td>RST-4810BRST</td><td>Pipeta estéril</td></tr><tr><td>disponente de 5 mL</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td>Pipeta estéril</td></tr><tr><td>desgastable de 10 mL</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td>Pipeta estéril</td></tr><tr><td>de 25 mL disporsable</td><td>Falcon</td><td></td><td>357535 Hematocitómetro estéril</td></tr><tr><td></td><td>Sunlead Glass</td><td>A126</td><td>Microscopio Neubeuer mejorado</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Platos de 10 cm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>Para cultivo</td></tr><tr><td>de tejidos Placas de 6 pocillos</td><td>AGC Techno Glass</td><td>3810-006</td><td>Para cultivo</td></tr> <tr><td>de tejidosMezclador de vórtice</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie Rascadores de 2</td><td></td></tr><tr><td>celdas</td><td>Sumitomo Baquelita</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>STAR</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2323-015</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 mL AGC</td><td>Techno Glass</td><td>2343-050</td><td></td></tr><tr><td>Centrífugas</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos</td><td>Greiner</td><td>655061</td><td>No apto para cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M2e</td><td></td></tr><tr><td>SDS&ndash; Tanques PAGE</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1010</td><td></td></tr><tr><td>Tanques de transferencia</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1510B</td><td></td></tr><tr><td>Placas de gel (con muescas)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Placas de gel (lisas)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-2</td><td></td></tr><tr><td>Espaciadores de silicio</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>Peines de 17 pocillos</td><td>Nihon Eido</td><td>Hecho a medida</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de carpeta</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-15</td><td></td></tr><tr><td>5 mL jeringa</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>21G</td><td>Terumo</td><td>NN-2138R</td><td></td></tr><tr><td>Power Station 1000 VC</td><td>ATTO</td><td>AE-8450 Fuente de</td><td>alimentación para SDS&ndash; PÁGINA y transferencia</td></tr><tr><td>Grandes botes de pesaje</td><td>Ina Optika</td><td>AS-DL</td><td></td></tr><tr><td>Contenedores de plástico</td><td>COMO UN</td><td>CASO PS No.4</td><td>10 x 80 x 50 mm</td></tr><tr><td>Agitador oscilante</td><td>Titech</td><td>NR-10</td><td></td></tr><tr><td>Caja de espuma de estireno</td><td>genérica</td><td></td><td>Las dimensiones internas deben caber en un tanque de transferencia (200 x 250 x 250 mm).</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4000</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Un generador de imágenes equipado con una cámara CCD refrigerada para la detección de ECL</td></tr></tbody></table>

rab10 detección de fosforilación por la actividad de lrrk2 mediante sds-page con una etiqueta de enlace de fosfato

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutaciones de la cinasa repetición rica en leucina 2 (LRRK2) han demostrado estar relacionados con la enfermedad de Parkinson familiar (FPD). Puesto que la activación anormal de la actividad quinasa de LRRK2 se ha implicado en la patogénesis de la EP, es esencial establecer un método para evaluar los niveles fisiológicos de la actividad quinasa de LRRK2. Estudios recientes revelaron que LRRK2 fosforila a miembros de la familia de Rab GTPase, incluyendo Rab10, bajo condiciones fisiológicas. Aunque la fosforilación de Rab10 endógeno de LRRK2 en células cultivadas podría detectarse por espectrometría de masas, ha sido difícil de detectar por immunoblotting debido a la pobre sensibilidad de anticuerpos específicos de fosforilación actualmente disponibles Rab10. Aquí, describimos un sencillo método para detectar los niveles endógenos de Rab10 fosforilación de LRRK2 basado en immunoblotting utilizando sodio electroforesis dodecyl del sulfato gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) combinado con una enlace de fosfato etiqueta (P-), que es N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (pyridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. El presente Protocolo no sólo proporciona un ejemplo de la metodología que utiliza la etiqueta P pero también permite la evaluación de cómo mutaciones así como tratamiento y administración de inhibidor u otros factores alteran la señalización corriente abajo de LRRK2 en células y tejidos .

Sistema de sobreexpresión: Fosforilación de la HA-Rab10 por 3 × bandera-LRRK2 en HEK293 células:
Las células HEK293 fueron transfectadas con 0.266 μg de HA-Rab10 tipo de salvaje y 1.066 μg 3 × bandera LRRK2 (mutante de tipo salvaje, quinasa inactiva (K1906M), o mutantes FPD). Fosforilación de Rab10 fue examinada por etiqueta P SDS-PAGE seguido immunoblotting usando un anti-HA anticuerpo (figura 2). 10 ...

El presente estudio describe un método sencillo de detectar niveles endógenos de la fosforilación Rab10 quinasa repetición rica en leucina 2.

Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

El objetivo general de este experimento es detectar la fosforilación de Rab10 por LRRK2 utilizando SDS-PAGE con una etiqueta de unión a fosfato. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del Parkinson, como cómo las mutaciones de la enfermedad en LRRK2 afectan a la fosforilación de Rab10. La principal ventaja de esta técnica es que se puede tener una estimación aproximada de la estequiometría de la fosforilación de Rab10 utilizando un simple Western blot.Muchos de los pasos de este protocolo son bastante estándar y se describen con suficiente detalle en el protocolo de texto que acompaña a este video. Aquí, queremos mostrarle los pasos que más se benefician de la instrucción visual. Prepare placas de células HEK293 transfectadas como se describe en el protocolo de texto.Con las placas en hielo, aspire y deseche los medios. A continuación, agregue con cuidado dos mililitros de DPBS en la esquina de cada placa y agite las placas para esparcir la solución. A continuación, retire y deseche el DPBS.A continuación, agregue a cada placa 100 microlitros de tampón de lisis. Incline la placa y use un raspador para esparcir el tampón y liberar el lisado celular. A continuación, aspirar los lisados y transferirlos a tubos de microfuga preenfriados en hielo y esperar 10 minutos.A continuación, recoja los lisados celulares libres de residuos centrifugando los tubos y transfiriendo los sobrenadantes a nuevos tubos en hielo. A continuación, mida las concentraciones de proteínas de los lisados aclarados mediante el ensayo de Bradford. Para los datos de concentración, prepare muestras de 100 microlitros de los lisados para el análisis en gel.Preparar lisados más densos para medir el Rab10 endógeno en comparación con la hemaglutinina Rab10 sobreexpresada. Finalice la preparación de las muestras incubándolas a 100 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, almacene las muestras a menos 20 grados centígrados hasta que las necesite durante un máximo de seis meses o más.Para comenzar, prepare las celdas SDS-PAGE de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, cargue el gel en el depósito y asegúrelo con pinzas aglutinantes. A continuación, llene el tanque con tampón corriente y elimine las burbujas de aire en los pocillos y debajo del gel con una aguja conectada a una jeringa.Ahora agregue cloruro de manganeso a las muestras y gírelas hacia abajo para eliminar los precipitados. A continuación, cargue el gel con volúmenes iguales de muestra, 10 microgramos de proteína para analizar la hemaglutinina Rab10 sobreexpresada o 30 microgramos de proteína para analizar la Rab10 endógena. Cargue los carriles vacíos con tampón de muestra que contenga cloruro de manganeso.También complemente el marcador de peso molecular con tampón y cloruro de manganeso para que tenga el mismo volumen que las muestras. Ahora comience a hacer funcionar el gel a 50 voltios. Después de la pila de muestras, aumente el voltaje a 120 para obtener la separación.Cuando el frente del tinte llegue al fondo de los geles, apague el voltaje. A continuación, lave el gel tres veces de la siguiente manera. Cargue el gel de separación en un baño de tampón de transferencia limpio con EDTA y SDS agregados.Luego déjalo mecer en una coctelera durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de tres lavados, realice un lavado más utilizando un tampón de transferencia con SDS añadido pero sin EDTA. A continuación, transfiera el gel utilizando un depósito húmedo.Cargue el tanque en una caja de espuma llena de agua helada, conecte el tanque a una fuente de alimentación e inicie la transferencia. Una transferencia prolongada con un enfriamiento eficiente es esencial para el procedimiento. Después de la transferencia, verifique la transferencia tiñendo la membrana con Ponceau S, seguido de un lavado en TBST de acuerdo con el protocolo de texto.A continuación, aplique un bloque. Sumerja la mancha en un TBST lechoso y mueva la mancha en una coctelera durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, retire y deseche la solución bloqueante y aplique la solución de anticuerpos primarios.Ahora balancea la membrana durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos primarios. A continuación, lave la membrana con TBST fresco tres veces como antes.Después de los lavados, sumerja la mancha en una solución de anticuerpos secundaria e incube la membrana en un balancín durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave la membrana con TBST tres veces una vez más. Ahora desarrolle la membrana.Agregue un mililitro de solución ECL a una hoja grande de envoltura de plástico. A continuación, coloque la membrana en el ECL y gírela rápidamente para humedecer ambos lados. A continuación, levanta la membrana y déjala escurrir.Después de escurrir, deje que un borde toque una toalla de papel durante unos cinco segundos para ayudar a absorber el exceso de solución. A continuación, envuelva la membrana en una película transparente rígida sin arrugas y transfiérala a una bandeja negra para la obtención de imágenes. Las células HEK293 se transfectaron con hemaglutinina Rab10 de tipo salvaje y 3xFLAG-LRRK2.Se probaron quinasas de tipo salvaje inactivas en mutaciones familiares de LRRK2 en la enfermedad de Parkinson. La sobreexpresión conjunta de LRRK2 y Rab10 dio lugar a un importante cambio de banda en el gel P-tag. Por el contrario, la coexpresión con un mutante inactivo de la quinasa no dio lugar a ningún cambio en la movilidad de Rab10, lo que implica a la quinasa como la causa del cambio de banda.También como se esperaba, las mutaciones familiares de la EP aumentaron el cambio de banda. El sistema de gel P-tag también se utilizó para analizar células de fibroblastos embrionarios albinos suizos 3T3 de ratón tratadas con un inhibidor de LRRK2. El desplazamiento de banda correspondiente a Rab10 endógeno fosforilado desapareció cuando las células fueron tratadas con GSK2578215A.La misma prueba también se realizó con células humanas A549. En estos experimentos, la eficacia del inhibidor de LRRK2 se validó utilizando el anticuerpo anti-p serina 935 LRRK2, que es un marcador bien establecido de inhibición de LRRK2. Una vez dominada, esta técnica solo necesita 14 minutos adicionales en comparación con un procedimiento regular de Western blot que consiste en lavar los geles antes de la transferencia.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la espectrometría de masas para responder a preguntas adicionales como si los mutantes de FPD fosforilan el mismo residuo de Rab10. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del Parkinson exploraran los niveles endógenos de fosforilación de Rab10 en células cultivadas, así como en tejidos. No olvide que trabajar con microcistina añadida al tampón de lisis puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal adecuado, mientras se preparan los lisados celulares.

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Investigación

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Quinasa con repeticiones ricas en leucina 2 es una quinasa multidominio grandes, las mutaciones en el que son la causa genética más común de enfermedad de Parkinson. Análisis de la actividad quinasa de la proteína ha demostrado ser una herramienta crucial en la comprensión de la biología y la disfunción de esta proteína. En este...

Ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 In vitro</em

Este video muestra una técnica de cuantificación sensible de la fosforilación de proteínas utilizando un ensayo pull-down de una sola molécula. La funcionalización de la polietilenglicol-biotina y el uso de anticuerpos marcados aumenta la detección de tirosina fosforilada con especificidad.

Ensayo pull-down de molécula única para el análisis de fosforilación de proteínas: una técnica de alto rendimiento para cuantificar la fosforilación de proteínas en el lisado celular

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son proteínas multidominio que codifican tanto GTPasa y dominios quinasa y que son fosforilados en las células. Aquí, se presenta un protocolo para etiquetar LRRK1 y LRRK2 en las células con 32 P ortofosfato, proporcionando así un medio para medir sus niveles generales de fosforilación celular.

Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato

Aquí describimos un procedimiento que permite un análisis detallado de la activación dependiente de la fosforilación del factor de transcripción IRF3. Esto se logra mediante la combinación de un SDS-PAGE de alta resolución y un PAGE nativo acoplado a inmunoblots utilizando múltiples anticuerpos fosfoespecíficos.

Una alta resolución Método de Seguimiento activación fosforilación dependiente de IRF3

Los ensayos de competición de péptidos se usan ampliamente en una variedad de experimentos moleculares e inmunológicos. Este documento describe un método detallado para un ensayo de quinasa que compite con oligopéptido in vitro y los procedimientos de validación asociados, que pueden ser útiles para encontrar sitios de fosforilación específicos.

Ensayo de Competencia Oligopeptídica para la Determinación del Sitio de Fosforilación

Las mutaciones en el gen de la quinasa 2 de la leucina rica causan la enfermedad de Parkinson hereditaria. Hemos desarrollado un método fácil y robusto para evaluar la fosforilación controlada por LRRK2 de Rab10 en neutrófilos de sangre periférica humana. Esto puede ayudar a identificar a las personas con aumento de la actividad de la vía de la quinasa LRRK2.

Aislamiento de Neutrófilos de Sangre Periférica Humana para Interrogar la Vía de Kinasa LRRK2 Asociada al Parkinson mediante la evaluación de la fosforilación de Rab10

El objetivo de este protocolo es la etiqueta, enriquecer e identificar los sustratos de la proteína quinasa CK2 de una muestra biológica compleja como un lisado de célula o tejido homogeneizado. Este método aprovecha los aspectos únicos de la biología de CK2 para este propósito.

Identificación de los sustratos de quinasa CK2 novela utilizando un enfoque bioquímico versátil

Caracterizamos una nueva proteína quinasa utilizando enfoques bioquímicos robustos: análisis de Western Blot con un anticuerpo específico específico específico específico en diferentes líneas y tejidos celulares, interacciones por experimentos de coinmunoprecipitación, actividad quinasa detectada por Western Blot usando un anticuerpo fosfo-específico y por el etiquetado ATP de32P.

Caracterización a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos de una nueva proteína kinasa

Este protocolo describe la cuantificación rápida y altamente sensible de Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) datos de sensor utilizando un analizador de FRET portátil a medida. El dispositivo se utilizó para detectar la maltosa dentro de un rango de temperatura crítico que maximiza la sensibilidad de detección, lo que permite la evaluación práctica y eficiente de contenido de azúcar.

Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET

Este estudio describe las técnicas biofísicas, bioquímicas y moleculares para caracterizar la actividad chaperona de Escherichia coli HdeB en condiciones de pH ácido. Estos métodos se han aplicado con éxito para otros chaperones ácido-protectores tales como HdeA y puede ser modificado para trabajar para otros chaperones y condiciones de estrés.

Detección de la actividad dependiente del pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Acompañante HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; y<em&gt; En Vivo</em

Aprende a detectar la fosforilación de Rab10 por LRRK2 mediante SDS-PAGE con etiqueta de unión a fosfato. Este método permite estimar la estequiometría de fosforilación en investigación de la enfermedad de Parkinson.

Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

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