Name: Inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica y entrega de celular en un modelo preclínico grande (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 24 s
Description: Aprende a realizar inyección intramiocárdica guiada por ecocardiografía de contraste en corazón de conejo. Esta técnica permite entregar células marcadas de forma segura para investigación en medicina regenerativa cardíaca.

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Los autores agradecen excelente apoyo brindado durante la recogida de datos y Carlos Bueno para proporcionar las células HEK-293 EGFP(+) Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz y Manuel Molina. Este trabajo fue financiado en parte por: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, España (JT) (número de autorización: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de I + D + I 2008-2011 (no de la concesión. RD12/0019/0001) (JMM), cofinanciado con fondos estructurales de la Unión Europea (FEDER) (JMM); y la Universidad de Reading, Reino Unido (AG, GB) (financiación Central). Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

Los experimentos descritos en este documento fueron aprobados por el Comité ético de investigación de la Universidad de Murcia, España y se realizaron según la Directiva 2010/63/UE de la Comisión Europea. Los pasos descritos fueron realizados bajo protocolos operativos que eran parte del plan de trabajo y no se ha realizado únicamente con el propósito de filmar el vídeo que acompaña a este trabajo.
1. preparación de las células y vectores de expresión mamíferos
Nota: Aquí, brevemente Describimos un protocolo para la preparación y transfección de una línea celular (riñón embrionario humano 293 (HEK-293)); sin embargo, protocolos específicos de célula apropiada para el tipo de la célula de interés deben ser optimizado (p. ej., células madre).
<ol><li>Mantener las células HEK-293 en glucosa alta Dulbecco de modificado medio de águila (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS), piruvato de sodio 1%, 2 mM glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina y se incubó a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2 . Una vez que las células son el confluentes, en una relación de 1:3.</li>
	<li>Empezar a dividir las células por aspiración de los medios de comunicación, luego lave una vez con fosfato estéril tamponada con solución salina (PBS), quitar exceso PBS e incubar luego con 2,5 mL de 0,5 x ácido tripsina etilendiaminotetracético (EDTA) (5 minutos, 37 º C).<ol>
<li>Añadir un volumen de medio DMEM (complementada como se describe anteriormente) para detener la reacción y luego separar las células aspirando lenta y suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta electrónica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A continuación, transferir la suspensión de células en un contenedor adecuado (p. ej., tubo de centrífuga cónico de 15-50 mL). Centrifugar en una cubeta de swing (100 x g), eliminar el sobrenadante y lavar el pellet dos veces con PBS estéril.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en medio DMEM fresco y semilla en una densidad de célula apropiada (p. ej., 1 x 106 células en un frasco de 75 cm2 ) en frascos de cultivo fresco o platos grandes de prácticas de laboratorio local.<ol>
<li>Sustituir los medios de comunicación existentes con medio fresco cada 2 días. Nota: El vector de expresión se deriva de pIRES1hyg y utilizado según las instrucciones del fabricante como se describió anteriormente21. p(EGFP) IRES1hyg ha sido generado por subcloning EGFP cDNA como un BamHI + NotI Inserte de pEGFP-N1 la BamHI + NotI digerido pIRES1hyg21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 día antes de la transfección, semilla HEK-293 células a una densidad de 0,5 x 105 células/cm2 en placas de cultivo de tejidos de 12 o 24 pocillos.</li>
	<li>En el día de la transfección, preparar complejos de reactivo de transfección de DNA de lípidos en tubos de microcentrífuga separados 1,5 mL (1 tubo/bien).<ol>
<li>Iniciar mediante la adición de 250 μl de medio de suero reducido en cada tubo y agregar entonces 4 μg ADN (mezclar suavemente).</li>
		<li>Posteriormente, Añadir 250 μl de una mezcla previamente preparada de 10 μl de reactivo de transfección lípidos y 250 μl de medio de suero reducido, a cada tubo (mezclar suavemente otra vez).</li>
		<li>Por último, continuar con transfecciones, incubando las células HEK-293 con complejos de reactivo de transfección ADN lípidos durante 4 h, reemplazar con medio DMEM complementado como se describió anteriormente (paso 1.1) e incubar otro 48 h. realizar selección de droga de estable transfectants con 100 μg/mL higromicina B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Separar las células HEK-293 con tripsina como se describió anteriormente (paso 1.2). Después de lavar las células en PBS estéril, resuspender en un vehículo apropiado (por ejemplo, 10% v/v InI en PBS), para lograr una concentración celular final de 5 x 106/ml.</li>
</ol>2. preparación del conejo
Nota: La posición del conejo y el transductor para IMI no es óptima para evaluar la morfología y función del corazón del animal. Por lo tanto, es recomendable realizar una exploración ecocardiográfica completa20 antes de la IMI (véase abajo) y en momentos posteriores, según lo definido por el diseño experimental. Esto tendrá como objetivo evaluar las anatómicas y funcionales características basales del corazón en los animales que reciben una inyección y también evaluar los efectos, del IMI en la función del corazón.
<ol><li>Llevar a cabo este examen de manera ciega y siguiendo las directrices del Comité de ecocardiografía de la Colegio Americano de medicina interna de veterinaria y la sociedad americana de ecocardiografía Europea Asociación para la proyección de imagen Cardiovascular 22 , 23 , 24.</li>
	<li>Obtener un trazo simultáneo de 1 cable de Electrocardiograma (ECG) durante todo el estudio ecocardiográfico todo.</li>
	<li>Anestesiar al conejo con ketamina 10 mg/kg, combinado con medetomidina 200 μg/kg, inyección intramuscular (I.M.).</li>
	<li>Verificar el nivel de la anestesia después de 10-20 min tras la administración de la anestesia.</li>
	<li>Usando un cortador de pelo eliminar el vello del pecho ampliamente (por ejemplo, debajo de la nuca a la región el xiphoid) (figura 1A).</li>
	<li>Afeitado más regiones de 1-2 cm2 en la cara interna de la extremidad delantera derecha (región mediocubital) y de ambas extremidades posteriores (región mediotibial) (figura 1B).</li>
	<li>Coloque los electrodos de ECG adhesivo en las regiones afeitadas de las extremidades síncrono monitorear el ritmo cardíaco durante el procedimiento (figura 1).</li>
	<li>Coloque el animal en la posición de decúbito supino en una manta térmica, con las extremidades extendidas con esparadrapo a la mesa (figura 1).<ol>
<li>Asegúrese de que los oídos se flexionan hacia atrás detrás de la cabeza/espalda del conejo y en una posición que es más baja que sus patas delanteras, ya que esto ayuda a mantener la correcta posición del tórax del animal durante todo el procedimiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permitir que el animal respire espontáneamente mientras que administrar oxígeno por mascarilla a lo largo de todo el proceso (100%, 2-3 L/min).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig1.jpg"> Figura 1. Preparación del conejo para IMI. (A) Clip pelo del tórax; (B) Clip pelo de miembros; (C) Coloque los electrodos y colocar el conejo con piernas estiradas en una manta térmica. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. técnica de contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI en el conejo
<ol><li>Limpiar y desinfectar la piel del tórax con una solución de clorhexidina.<ol>
<li>Utilizar una técnica aséptica durante todo el procedimiento, según mejores prácticas actuales.</li>
		<li>Siempre que sea posible y si es posible, realizar un procedimiento completamente estéril, incluyendo pero no limitado a, el uso de material estéril, tales como batas, guantes, cortinas de herida quirúrgica, preparación de material para la mesa, así como un ultrasonido estéril estériles cubierta y gel de ultrasonidos estéril. Esto reducirá al mínimo el riesgo de introducción de patógenos a los animales reciben el IMI y es una práctica estándar en el ajuste clínico (por ejemplo, durante la punción cardíaca). Nota: Se recomienda a proceder siempre conforme a las regulaciones locales y nacionales de investigación animal aplicable a las instituciones locales y el país de la práctica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplicar gel de transmisión del ultrasonido en el pecho o el transductor y el cable del transductor al cuello del experimentador, realizar un análisis rápido de la ventana del corazón del animal, que a menudo es útil para visualizar la anatomía y planificar para el IMI.</li>
	<li>Coloque el transductor manualmente en el 4 espacio intercostalth-6th , 2-3 cm de la línea paraesternal derecha con un ángulo de incidencia de ~ 90 ° con respecto a la derecha de la pared torácica (figura 2A).</li>
	<li>Ajuste la ubicación del transductor en relación con el espacio intercostal, así como sus anteroposterior y dorsoventral del ángulo para optimizar una vista modificada eje corto a nivel de los músculos papilares. Identificar en este punto de vista el ventrículo derecho (VD), ventrículo izquierdo (LV), septo interventricular (IVS), pared posterior (PW), así como anterolateral (AL) y músculos papilares posteromedial (PM) (figura 2B).<ol>
<li>Tienen un amplio campo de visión incrementando significativamente la profundidad mediante el control apropiado en el sistema (p. ej., botón, esfera).</li>
		<li>Prestar especial atención a la obtención de una imagen simétrica en esta vista, así como la adecuada diferenciación de contornos endocárdicos y epicárdicos y, si es necesario, ajuste a través de controles de optimización de la imagen (por ejemplo, ganancia).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez que la vista ecocardiográfica óptima se obtiene (figura 2B), mantener esta posición durante el resto del procedimiento, mientras que un segundo operador realiza el IMI (véase abajo).<ol>
<li>Mientras sostiene el transductor, evitar ocultar la marca de orientación del transductor, que siempre debe ser hacia delante, lo que permite su alineación con la aguja en pasos posteriores (figura 2A, C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Con una aguja 24 G conectada a una jeringa de 1 mL, coloque la aguja cerca de la piel de lo hemitórax simétricos espejado con respecto al transductor. A continuación, alinear manualmente la aguja con la marca de orientación del transductor en un ángulo de ~ 90° (figura 2) y haga avanzar lentamente la aguja a través de la piel y en la cavidad torácica. Nota: La inserción percutánea de la aguja en esta posición y la orientación facilita la visualización de la aguja en el plano de la viga del ultrasonido (Figura 2D, E), lo que permite el monitoreo en tiempo real y, cuando sea necesario, el ajuste de la ubicación de la aguja en relación con la región de destino del miocardio (figura 2 G, H).</li>
	<li>Con la punta en la ubicación de destino, lentamente entregar el injectate (hasta 0,25 mL por sitio de inyección) dentro de 10-30 s (Figura 2E), mientras que poco a poco y suavemente retrayendo la aguja durante la inyección para aumentar la extensión del miocardio tratados.<ol>
<li>Use InI 10% (v/v) diluido en PBS para la estandarización de la técnica y como un trazador en situ y adquisición de competencias, así como para confirmar la focalización exitosa de las cuatro localidades IMI en el miocardio por el grueso de la patología e histopatología (véase Representante de resultados). Una vez que se logra la competencia, InI podría ser sustituida por un agente de contraste de ultrasonido comercial adecuado si se desea. Nota: La entrega del 10% (v/v) InI diluido en PBS con o sin células en los resultados de miocardio transmural hyperechogenicity (es decir, aspecto brillante eco) en el sitio de destino de la inyección (Figura 2E, F). Transitoria desaceleración o aceleración del ritmo cardiaco, asociado a Extrasistolia ventricular (p. ej., aislados, pareados y trillizos) se observan con frecuencia incluso desde el primer contacto de la aguja con el epicardio, así como durante o poco después de IMI. Sin embargo, no se desarrollan arritmias peligrosas para la vida, y efectos adversos agudos se observan raramente con 0.25 mL (1.25 x 106 células) de injectate por sitio de la inyección de IMI (véase Representante resultados y discusión).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar cambios sutiles en el ángulo de incidencia de la aguja según sea necesario para completar las inyecciones de 0.25 mL a cada uno de los sitios IMI cuatro (tres en el ventrículo izquierdo libre de pared (LVFW) y en el IVS).</li>
	<li>Después de completar el procedimiento de contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI, evaluar ritmo cardíaco (por ejemplo, a través de la serie ECG trace o 24 h Holter ECG) y realizar análisis ecocardiográfico ventana serie para verificar la ausencia de complicaciones, hasta que el animal está recuperado de la anestesia y solo entonces transferencia a un cuarto ciclo de luz.<ol>
<li>Aquí, utilizamos 24 h Holter ECG para monitorizar los efectos del IMI con el InI en el ritmo cardíaco durante 24 h. Para ello, se compararon un grupo de 6 conejos con fenotipo normal (grupo Normal) y un grupo de 6 conejos que recibieron administración intravenosa de doxorubicina (una cardiotóxicos anthracycline droga, comúnmente utilizada para el tratamiento del cáncer; Grupo DOX) en una dosis de 2 mg/kg/semana durante 8 semanas y luego ambos cohortes recibido IMI con InI.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig2.jpg"> Figura 2 . Inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica en el conejo. (A) colocación del transductor en el hemithorax correcto en un ángulo de ~ 90 °. (B) imagen representativa de una visión de eje corto paraesternal (PSSX) del corazón a nivel de músculos papilares en el conejo. (C) alineamiento de la aguja en un ángulo de ~ 90 ° en relación con la marca de orientación del transductor. (D) Ubicación de la aguja en el sitio de destino en una vista PSSX del corazón (note que la aguja se visualiza fácilmente en el plano de la viga del ultrasonido). (E y F) demostración del hyperechogenicity en el sitio de destino en inyección intramiocárdica con tinta de la India (puntas de flecha de resaltar el hyperechogenicity transmural). (G) Ubicación Accidental de la aguja en la cámara del LV (puntas de flecha de resaltar el eje de la aguja). Nuevo (H) de la aguja a la pared libre del LV (puntas de flecha de resaltar el eje de la aguja). RV = ventrículo derecho; LV = ventrículo izquierdo; IVS = tabique interventricular; PW = pared posterior; AL = músculo papilar anterolateral; PM = músculo papilar posteromedial. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. post IMI análisis
<ol><li>Realizar el análisis histopatológico de las muestras de tejido de corazón de conejos.<ol>
<li>Fijar el tejido durante 24 horas en formaldehído al 10%, seguido de deshidratación con el aumento de las concentraciones de etanol como sigue: • 1 x 70% (60 min) • 1 x en metanol de ethanol/5% 95% (60 min) • 1 x 100% (60 min) • 1 x 100% (90 min) • 1 x 100% (120 min) Nota: Todas las anteriores incubaciones se realizan a temperatura ambiente (RT). Luego, sustituir dos veces con xileno 100% (1 h, RT) y finalmente incluir en parafina en dos pasos (60 min, 58 ° C)25.</li>
		<li>Realizar secciones de tejido de 4-5 μm con un micrótomo25. Monte las secciones en las diapositivas.</li>
		<li>Realizar tinción con hematoxilina-eosina y trichrome métodos25,26,27 de Masson.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En secciones del tejido del corazón trasplantado, realizar inmunohistoquímica para detectar las células HEK-293 EGFP(+) (p. ej., utilizando el método de (ABC) complejo avidina-biotina), brevemente:<ol>
<li>La cera secciones corazón grueso de 4-5 μm en xileno 100% (10 min, a temperatura ambiente). Rehidratar el tejido lavando con la disminución de soluciones de concentración de etanol (2 x 100% (2 min) x 2 en el 95% (2 minutos) 1 x 70% (2 minutos); 1 x en el 50% (2 min); 1 x 30% (2 min); 1 x ddH2O (2 min)) a TA.</li>
		<li>Llevar a cabo la inhibición de la peroxidasa endógena que cubre las secciones con 100 μl de 3% H2O2 diluido en metanol (preparada con 5 mL de solución de H2O2y agregar metanol 30% hasta un volumen total de 50 mL) ( Incubar 30 min, RT) y luego lavar por inmersión con solución salina tamponada con Tris (TBS; pH 7,6).</li>
		<li>Realizar antígeno desenmascarar mediante tratamiento enzimático, cubriendo las secciones con 100 μl de 0,1% pronasa (preparada con 0.01 g pronasa diluida en 10 mL TBS) (incubar 12 min, RT), a continuación lavado con TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Incubar en el bloqueo de solución (suero normal de cabra en 10% en TBS) con 100 μl por diapositiva (30 min, RT) y lavado con TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Incubar con proteína de pollo anti-verde fluorescente (GFP) como anticuerpo primario (1: 500 en TBS) (1 h, 30 ° C) y lavado con TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Incubar con el anticuerpo secundario biotinilado cabra anti-pollo IgG (1: 250 en TBS) (1 h, 30 ° C) y luego lavado con TBS (5 min, RT).</li>
		<li>Incubar con complejo avidina-biotina (20 min, 30 ° C) y luego la etiqueta usando tetrahydrochloride 3,30-diaminobenzidina (DAB) (RT, 5-10 min).</li>
		<li>Finalmente, deshidratar por lavado en el aumento de las concentraciones de etanol (1 x 30% (2 minutos) 1 x 50% (2 minutos) 1 x 70% (2 minutos); 2 x (2 min.) el 95%; 2 x 100% (2 min)) en RT, contratinción secciones usando el método de hematoxilina-eosina25y luego montar diapositivas de cubierta. Son positivo, negativo así como controles de isotipo. Nota: El breve protocolo descrito anteriormente no está diseñado para uso general inmunohistoquímica; optimización para el tejido de interés y condiciones es necesario.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El objetivo principal era desarrollar una técnica mínimamente invasiva que podría ser utilizada para la entrega de células madre en el miocardio de conejos (un gran tamaño animal modelo preclínico)17,18, mientras que tomando ventaja de la utilización de un relativamente barato, fácilmente disponible en muchas clínicas del sistema de imagen y centros de investigación. Aquí, demostramos que, utilizando un sistema de clínicas de la ecocardiografía, y ayudado por el ...

Las terapias celular y génica son emocionantes y nunca desarrollar estrategias para la regeneración o reparación del miocardio lesionado en HFrEF. Unos pocos estudios han comparado la eficacia (e.g., tasa de retención celular) de las diferentes rutas de entrega de la célula, que constantemente han demostrado la superioridad del IMI sobre rutas intravenosa o intracoronary1,2 , 3 , 4 , 5. por lo tanto, no es de extrañar que una gran proporción de los estudios sobre modelos traslacionales de la terapia de la célula de vástago del miocardio lesionado, entregar el injectate via IMI realizada bajo visión directa en un pecho abierto procedimiento6,7 . Sin embargo, este enfoque tiene varias limitaciones, incluyendo la naturaleza invasiva del procedimiento, que conlleva el riesgo de mortalidad peri-procedimiento (a menudo debajo-divulgado)8. Además, un IMI bajo visión directa no elimina la posibilidad de que la inyección inadvertida dentro de la cavidad ventricular. En la práctica clínica un IMI durante cirugía abierta de tórax podría ser un método adecuado para la entrega de la terapéutica celular, por ejemplo, en la arteria coronaria bypass cirugía del injerto (CABG); sin embargo, este enfoque no puede ser apropiado para la entrega de celular global miocardiopatía de origen no isquémico (p. ej., HFrEF secundaria a miocardiopatía inducida por antraciclinas (AICM)).
Cabe duda de que la cardiopatía isquémica (IHD) es la causa más común de HFrEF (~ 66%)9,10; sin embargo, la cardiomiopatía no isquémica, incluyendo AICM, todavía afecta a una proporción significativa de pacientes con HFrEF (33%)9 . De hecho, los recientes avances en oncología clínica han resultado en más de 10 millones de supervivientes de cáncer en los Estados Unidos solo11, con las estimaciones de un número similar en Europa, consistente con una tendencia global hacia la mejoría en la supervivencia de pacientes con cáncer12 ,13. Por lo tanto, explorar los beneficios de los nuevos tratamientos como el trasplante de células madre para la cardiomiopatía no isquémica, así como las pruebas de una ruta efectiva y mínimamente invasiva de la entrega de la célula de vástago es de suma importancia, dado el creciente número de pacientes afectados por cardiotoxicidad secundaria a medicamentos contra el cáncer.
De nota, usando terapia de células madre con el objetivo de reparación/regenerar el miocardio lesionado con frecuencia los estudios de prueba de hipótesis consiste en el uso de roedores pequeños (por ejemplo, ratones y ratas). Estos modelos requieren a menudo sistemas de ultrasonido de alta frecuencia costosos para la evaluación de la función miocárdica, generalmente equipada con transductores de arreglo lineal que tienen algunas limitaciones inherentes asociadas (e.g., reverberación)14. Sin embargo, otros modelos como los conejos, que representan un gran modelo preclínico, tienen algunas ventajas para la comprobación de hipótesis de terapias con células madre en HFrEF. Así, en contraste con las ratas y ratones, conejos mantienen un sistema de transporte de Ca+ 2 y electrofisiología celular que se asemeja a el de seres humanos y otros animales grandes (por ejemplo, perros y cerdos)15,16,17 ,18,19. Otra ventaja es su receptividad para ultrasonido cardiaco proyección de imagen usando relativamente baratos y los sistemas de ecocardiografía clínica ampliamente disponible equipados con transductores array relativamente para fase de alta frecuencia, por ejemplo, 12 MHz, tales como los utiliza con frecuencia en cardiología pediátrica y neonatal. Estos sistemas permiten excelente imagen ecocardiográfica con tecnología de vanguardia, y toman ventaja de la superioridad de la proyección de imagen20armónica. Además, comprobación de hipótesis amplia de las posibilidades de terapias regenerativas cardiacas (p. ej., terapia de células madre), su seguridad, eficacia, cardiomiogenético potencial, así como evaluación del destino de la injectate una vez entregado en el miocardio, es obligatorio antes de que se pueden considerar para el uso humano, y requieren el uso de modelos animales preclínicos grandes, tales como el conejo17,19. Aquí, describimos una técnica mínimamente invasiva para la entrega de la célula mediante ecocardiografía de contraste percutánea guiada por IMI utilizando un sistema de ecocardiografía clínica, destinada a terapia basadas en el trasplante con células madre para la cardiomiopatía no isquémica20 . También describimos las ventajas de la tinta de la India (InI, también conocido como tinta China) como un trazador ultrasonido contraste agente y en situ de injectate en el corazón de conejo.

<table><tbody><tr><td>Sistema de ultrasonido HD11 XE</td><td>Sistema de</td><td>ecocardiografía</td> <td>Philips 10670267</td>.</tr><tr><td>S12-4</td><td>Philips</td><td>B01YgG</td><td>Transductor de matriz de fase de 4-12 MHz</td></tr><tr><td>Gel de transmisión de ultrasonidos (Aquasone)</td><td>Parket laboratories Inc</td><td>N 01-08</td><td></td></tr><tr><td>Vasovet 24G</td><td>Braun</td><td>REF 381212</td><td>&nbsp; catéter sobre la aguja</td></tr><tr><td>Omnifix-F jeringa de 1 ml</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Imalgene (Ketamina)</td><td>Merial</td><td>RN 9767</td><td>Es necesaria prescripción veterinaria</td></tr><tr><td>Domtor (Medetomidina)</td><td>Esteve</td><td>CN 570686.3</td><td>Es necesaria prescripción veterinaria</td></tr><tr><td>Almohadilla</td><td></td><td></td><td></td>térmica</tr><tr><td>Faber-Castel TG1</td><td>Faber-Castel</td><td>16 33 99</td><td>India (China) Tinta</td></tr><tr><td>Holter Syneflash</td><td>Ela medical</td><td>SF0003044S</td><td>sistema de ECG Holter 24 horas.</td></tr><tr><td>Electrodos Blue Sensor&reg;</td>Electrodos de ECG <td>Ambu (NUMED)</td><td>VLC-00-S</td><td>Holter.</td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2155</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olimpus</td><td>CO11</td><td></td></tr><tr><td>ABC Vector Elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6200</td><td>Avidin Biotin Complex Kit.</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP de pollo</td><td>Invitrogen</td><td>A10262</td><td>Anticuerpo primario.</td></tr><tr><td>Anticuerpo IgG biotinilado contra cabra y pollo</td><td>Laboratorios de vectores</td><td>BA-9010</td><td>Anticuerpo secundario.</td></tr><tr><td>3,30-diaminobenzidina tetraclorhidrato (DAB)</td><td>DAKO (Agilent)</td><td>S3000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td>Zeiss AX10 Axioskop</td><td></td></tr><tr><td>Holter ECG</td><td>Elamedical</td><td>Syneflash SF0003044S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>10% suero fetal de ternera (FCS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11573397</td><td></td></tr><tr><td>0,05% de tripsina-etilendiaminácido tetraacético (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (reactivo de transfección de lípidos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Medio sérico reducido (Opti-MEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>31985070</tr><tr><td>Higromicina B</td><td>Calbiochem (MERCK)</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>Xileno (histológico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td></td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Fisher Scientific</td><td>53-702-250KU</td><td></td></tr></tbody></table>

inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica y entrega de celular en un modelo preclínico grande

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Terapia celular y génica son emocionantes y prometedoras estrategias con el propósito de regeneración cardiaca en el contexto de la insuficiencia cardíaca con reducción fracción de eyección (HFrEF). Antes de que puedan ser considerados para su uso y aplicados en los seres humanos, se requieren extensos estudios preclínicos en modelos animales grandes para evaluar la seguridad, eficacia y destino de injectate (p. ej., células madre) una vez entregado en el miocardio. Modelos de roedores pequeños ofrecen ventajas (e.g., rentabilidad, receptividad para manipulación genética); sin embargo, debido a limitaciones inherentes de estos modelos, rara vez se traducen en la clínica de los resultados en estos. Por el contrario, los modelos animales grandes como conejos, tienen ventajas (e.g., electrofisiología cardíaca similar en comparación con los seres humanos y otros animales grandes), manteniendo un buen equilibrio rentable. Aquí, demostramos cómo realizar una técnica de inyección (IMI) percutánea contraste intramiocárdico guiada por ecocardiografía, que es mínimamente invasivo, seguro, bien tolerado y muy efectivo en la entrega específica de injectates, incluidas las células, en varios lugares en el miocardio de un modelo de conejo. Para la aplicación de esta técnica, también hemos tomado ventaja de un sistema de ecocardiografía clínica ampliamente disponibles. Después de poner en práctica el protocolo descrito aquí, un investigador con conocimientos de ecografía básica será competente en el desempeño de esta técnica mínimamente invasiva y versátil para uso rutinario en los experimentos, a la comprobación de la hipótesis de la capacidades de la terapéutica regenerativa cardiaca en el modelo de conejo. Una vez que se logra la competencia, todo el procedimiento se puede realizar dentro de 25 minutos después de la anestesia en el conejo.

Contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI con InI:
Utilizando el protocolo descrito anteriormente, y una vez que la posición óptima de la punta de la aguja fue confirmada por la ecocardiografía y la inyección iniciadas, transmural hyperechogenicity se observó durante la entrega de InI (10% v/v en PBS) (Figura 2E) , así como poco después el IMI a la región de destino (<stro...

Nuevas estrategias terapéuticas en medicina regenerativa cardiaca requieren extensos y detallados estudios en modelos animales preclínicos grandes antes que pueden ser considerados para el uso en seres humanos. Aquí, demostramos una técnica de inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica en conejos, que es valiosa para la hipótesis que prueba la eficacia de estas nuevas terapias.

Inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica y entrega de celular en un modelo preclínico grande

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

El objetivo general de este procedimiento es administrar de manera segura y precisa un volumen de inyectado en el miocardio ventricular izquierdo del corazón del conejo. Y para ello aprovechando la guía de la ecocardiografía percutánea con contraste. Esto se logra primero anestesiando al animal y luego preparando el tórax para el procedimiento.A continuación, después de colocar al conejo sobre una manta térmica, y comprobar que la señal de ECG se muestra correctamente, utilice un sistema de ecografía clínica para obtener una ventana acústica adecuada, y optimice la imagen en un campo de visión amplio. Luego, después de cargar la jeringa con células marcadas mezcladas con un agente de contraste adecuado, y bajo la guía de una ecografía, alinee cuidadosamente la aguja opuesta al transductor y colóquela cerca de la piel del hemitórax izquierdo, antes de avanzar lentamente la aguja a la región objetivo del miocardio. Finalmente, la inyección se administra de forma segura, como lo demuestra la hiperecogenicidad transmural en el sitio de la inyección en la imagen ecocardiográfica.En última instancia, la confirmación ex vivo de la administración exitosa del inyectado se demuestra por la presencia de colorante en el miocardio, mientras que el análisis inmunohistoquímico transversal de secciones de tejido miocárdico se utiliza para mostrar la administración exitosa de un marcador celular y un tinte en el miocardio objetivo. El propósito de este video es demostrar cómo realizar esta técnica de manera segura y precisa, para nuestra posibilidad, en el conejo de hoy, utilizando un sistema de ecocardiografía clínica. Las principales ventajas de esta técnica son la naturaleza mínima y básica de la máquina, y la capacidad de utilizar la guía ecocardiográfica de contraste para una visualización precisa de los sitios objetivo de inyección, reduciendo así al mínimo el riesgo de parto accidental entre cámaras.Antes de proceder con la inyección intramiocárdica, comience inyectando una combinación de ketamina y medetomidina para anestesiar al animal. Como se ha demostrado, el conejo mantiene la calma cuando la cabeza está cubierta con una manta quirúrgica. Una vez que el animal está anestesiado, use un cortapelos para eliminar el vello de la piel del tórax, comenzando por debajo del cuello y luego pasando a la región subxifoides.Afeitar regiones adicionales de uno a tres centímetros de la cara interna de la extremidad anterior derecha, así como las regiones tibiales mediales de las extremidades posteriores derecha e izquierda. A continuación, aplique un gel conductor adecuado a los electrodos y colóquelos en las regiones afeitadas de las extremidades. Fije los electrodos con cinta quirúrgica para evitar la pérdida de contacto mientras se mueve el animal durante el procedimiento.A continuación, coloque al animal sobre una manta térmica, verifique que se muestre una señal de ECG correcta en la pantalla del sistema, mantenga al animal en posición supina y permita que el animal respire espontáneamente mientras administra oxígeno mediante mascarilla durante todo el procedimiento. Limpie y desinfecte a fondo la piel afeitada del pecho con una solución a base de clorhexidina. Para mantener un buen contacto de la piel con el transductor, reducir los artefactos y mejorar la calidad general de la imagen, aplique una cantidad suficiente de gel de ultrasonido al transductor.A continuación, coloque manualmente el transductor en el cuarto al sexto espacio intercostal, a dos o tres centímetros de distancia de la línea paraesternal derecha, y en un ángulo de incidencia del haz de ultrasonido de aproximadamente 90 grados, en relación con la pared torácica. Asegúrese de que la marca de orientación del transductor esté orientada hacia adelante para facilitar su alineación con la aguja en los pasos posteriores. Debe obtener una vista paraesternal del eje corto del corazón a nivel de los músculos papilares.Y es importante tener un amplio campo de visión aumentando la profundidad con el control adecuado en el sistema. Si es necesario, ajuste la ubicación del transductor en relación con el espacio intercostal, así como su ángulo anteroposterior y dorsoventral para optimizar la imagen, y luego identifique en esta vista el ventrículo derecho, el VD, el ventrículo izquierdo, el VI, el tabique interventricular, el SVIV, la pared posterior, PW, así como los músculos papilares antero y posteromedial. Preste especial atención a obtener una imagen simétrica en esta vista, así como a la diferenciación adecuada de las contorsiones endocárdicas y epicárdicas y, si es necesario, ajustar a través de controles de optimización de imagen como el control de ganancia.Una vez obtenida la vista ecocardiográfica correcta, se mantiene esta posición durante el resto del procedimiento mientras un segundo operador realiza la inyección intramiocárdica. Para ello, utilice una jeringa precargada con una aguja adherida que debe colocarse cerca de la piel del hemitórax izquierdo en una posición de espejo simétrica con respecto al transductor. Luego, alinee manualmente la aguja con la marca de orientación del transductor en un ángulo de aproximadamente 90 grados y avance lentamente la aguja a través de la piel hasta la cavidad torácica.La inserción percutánea de la aguja en esta posición y orientación permite la visualización de la aguja en el plano del haz de ultrasonido, lo que permite el seguimiento en tiempo real y, cuando sea necesario, el ajuste de la ubicación de la aguja en relación con la región objetivo del miocardio, como se muestra aquí. Obsérvese en esta imagen, la presencia de la aguja en la cámara ventricular izquierda, mostrada por las puntas de flecha. Esto se puede reposicionar fácilmente retrayendo y reposicionando suavemente la aguja en la ubicación deseada.Con la punta en el lugar objetivo, administre lentamente la inyección durante un período de 20 a 30 segundos, mientras retrae lenta y suavemente la aguja para aumentar la extensión del miocardio tratado. Realice cambios sutiles en el ángulo de incidencia de la aguja según sea necesario para completar las inyecciones en cuatro sitios de inyección intramiocárdica. Uno en el tabique intraventricular y tres en la pared libre del ventrículo izquierdo, y suministran un volumen de 250 microlitros de inyectado por sitio de inyección.Después de completar el procedimiento, continúe monitoreando las ecografías ecocardiográficas biseriales de ventana del conejo, así como los trazados de ECG para verificar la ausencia de complicaciones secundarias al procedimiento, hasta que el animal esté completamente despierto de la anestesia. Se recomienda el uso de la monitorización Holter ECG de 24 horas para ayudar a determinar los efectos de las inyecciones intramiocárdicas sobre el ritmo cardíaco. Utilizando el protocolo aquí descrito, una vez confirmada la posición intramiocárdica de la punta de la aguja por ecocardiografía, y iniciada la inyección, se observó hiperecogenicidad transmural durante la administración de tinta china a la región objetivo en esta vista de eje corto paraesternal, puntas de flecha blancas.También se observó hiperecogenicidad poco después de la inyección, como se muestra en esta vista del eje largo paraesternal del corazón, donde se puede ver claramente una imagen brillante en el tabique interventricular, puntas de flecha blancas. Cuando la inyección intramiocárdica fue seguida inmediatamente por la eutanasia, los depósitos de tinta china fueron fácilmente visibles en el examen externo del corazón, como se muestra en esta imagen. Puntas de flecha negras.De manera similar, las secciones de tejido cardíaco a nivel de los músculos papilares revelaron depósitos transmurales de tinta china en la pared libre del ventrículo izquierdo, puntas de flecha negras, lo que demuestra una administración eficiente y efectiva de la inyección en el miocardio. En esta misma imagen, también se apreciaba un depósito de tinta china en el tabique interventricular. Flecha blanca.Si bien el procedimiento fue generalmente bien tolerado, fue muy común observar aceleración o desaceleración transitoria de la frecuencia cardíaca, asociada con contracciones ventriculares prematuras aisladas, PVC, tanto durante como poco después del procedimiento. De hecho, la monitorización con ECG Holter de 24 horas en animales que recibieron inyección intramiocárdica con tinta china reveló que las arritmias eran muy comunes y que su frecuencia relativa podría verse afectada por el estado fisiológico subyacente del animal. Esta imagen muestra un ejemplo de PVC aislado, la arritmia más frecuentemente observada, detectada durante la monitorización Holter.Comparación entre un grupo de conejos con fenotipo normal y un grupo de conejos que recibieron administración intravenosa de doxorrubicina, o DOX, un fármaco cardiotóxico y oncológico, durante ocho semanas. Antes de la inyección intramiocárdica con tinta china indicó que las contracciones ventriculares prematuras aisladas eran significativamente más frecuentes en el grupo DOX. Otras arritmias detectadas por la monitorización Holter ECG en ambos grupos fueron pareados de PVC, tripletes de PVC y taquicardia ventricular no sostenida.Significativamente, mientras que la frecuencia cardíaca media en los grupos normal y DOX fue comparable, la desviación estándar de la normalidad a la normalidad, los intervalos R a R o SDNN, una medida de la dinámica no lineal relacionada con el estado de salud cardíaca, mostró una marcada reducción en el grupo tratado con doxorrubicina. Antes del procedimiento, se confirmó la transfección exitosa de la proteína verde fluorescente mejorada, células marcadas con eGFP positivas, mediante una microscopía de fluorescencia durante condiciones de cultivo celular in vitro. A continuación, tras la inyección intramiocárdica, a la que siguió inmediatamente la eutanasia, se demostró el éxito de la administración de células marcadas con eGFP positivo en el miocardio mediante el análisis inmunohistoquímico de secciones de tejido cardíaco.Por lo tanto, como se muestra en esta imagen, había abundantes células marcadas dentro del miocardio. Puntas de flecha negras, intercaladas con depósitos de tinta china. Los depósitos de tinta china y las abundantes células eGFP positivas, puntas de flecha blancas, seguían presentes cuando la eutanasia se retrasó 24 horas después de la inyección intramiocárdica.Cabe destacar que se observó una respuesta inflamatoria aguda en este momento, con neutrófilos infiltrados en el miocardio, flechas rojas, lo que sugiere una respuesta de rechazo celular agudo a las células xenogénicas que se trasplantaron. También se observó inflamación aguda 24 horas después de la inyección intramiocárdica con tinta china sola. Sin embargo, en este caso, las células predominantes que se infiltraron en el miocardio fueron los macrófagos.Puntas de flecha blancas. Después de haber visto este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar una inyección intramiocárdica percutánea, guiada por ecocardiografía con contraste en un corazón de conejo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 25 minutos después de la estasis.

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