Name: Un modelo de ratón de cirugía ortopédica para el estudio de la disfunción cognitiva postoperatoria y regeneración de los tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende a realizar cirugía ortopédica en ratones para estudiar la disfunción cognitiva postoperatoria y la regeneración de tejidos mediante parabiosis entre animales jóvenes y adultos.

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Agradecemos a Kathy Gage, BS (Departamento de Anestesiología, Duke University Medical Center, Durham, NC) para asistencia editorial. NT reconoce apoyo de una beca de innovación de sueño de Anestesiología Duque y NIA/NIH R01 AG057525-01.

Todos los experimentos con animales fueron conducidos de acuerdo con los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobados por la institucional Animal Care & Comité uso (IACUC) en Duke University.
1. animales
<ol><li>Mantener los ratones en un ambiente con aire acondicionado con ciclos de 12 h luz/oscuridad y acceso adecuado a agua y alimentos. Casa no mayor de 5 hermanos de camada por jaula y evitar las condiciones que podrían fomentar la lucha.</li>
	<li>Utilizar ratones C57BL6/J de hembras 3 meses de edad (jóvenes) o 18 meses de edad (viejo).</li>
	<li>Para parabiosis, aclimatar 2 ratones juntos durante al menos dos semanas antes de la cirugía. Los ratones son tipo salvaje C57BL6/J o eGFP +.</li>
	<li>Compruebe la condición corporal y apariencia general de los ratones diariamente.</li>
</ol>2. preoperatorio configuración de Parabiosis y cirugía ortopédica
<ol><li>Pesar 2 ratones.</li>
	<li>Administrar anestesia general mediante el sistema de anestesia a un constante O2 flujo de 0.2 L/min uso 5% isoflurano para la inducción en una cámara de inducción. Nota: La profundidad de la anestesia se puede confirmar con una pizca de dedo del pie.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre una almohadilla de calefacción en una posición supina. Usar una sonda rectal para monitorear la temperatura corporal durante el procedimiento quirúrgico.</li>
	<li>Para mantener la anestesia, disminuir la concentración inhalada de isoflurano al 2.0% en 0,2 L/min a través de una máscara. Monitor para asegurar la adecuada profundidad de la anestesia.</li>
	<li>Monitor de parámetros fisiológicos (frecuencia respiratoria, saturación de oxígeno y el corazón batir) usando una forma no invasiva un pulso oxímetro (opcional).</li>
</ol>3. parabiosis cirugía (1A de protocolo)
<ol><li>Administrar analgesia (buprenorfina, SR lento liberar, 0,1 mg/kg por vía subcutánea) después de la inducción y antes de manipulación quirúrgica. Inyectar bupivacaína (0,25%) en los flancos justo antes de la apertura. Aplique lubricante ocular. Nota: El protocolo de parabiosis puede realizarse independientemente de la fractura tibial.</li>
	<li>Para todo el cuerpo interno de sutura, utilice el material de sutura de polidioxanona de 4-0. Para la sutura externa todos, utilizar material de sutura de polipropileno 4-0.</li>
	<li>Afeitarse cada uno de los 2 ratones a lo largo de una línea contigua desde el codo, el flanco y la rodilla del lado a unir. Desinfectar con yodo + piel de alcohol 70% matorral sobre 3 alternando ciclos en preparación para la incisión. Esterilizar instrumentos y mantener un campo estéril. Nota: Coloque el ratón de tipo salvaje a la derecha del ratón eGFP y preparar el flanco izquierdo del ratón de tipo salvaje y el flanco derecho del ratón eGFP para cirugía (figura 1).</li>
	<li>Cada ratón, usar una tijera para hacer una incisión en la piel a lo largo del flanco, desde proximal a la rodilla justo proximal al codo y sin molestar a los músculos debajo de la piel.</li>
	<li>Únete a lo tríceps de los animales con 2 suturas interrumpidas.</li>
	<li>Únete a las paredes del cuerpo a lo largo de los flancos con una sutura continua, marcha de pasos 7-9.</li>
	<li>Únete a los cuádriceps del animal con 2 suturas interrumpidas.</li>
	<li>Cerca de la piel de las 2 parabionts con suturas interrumpidas.</li>
	<li>Permitir que los ratones despertar en el aire ambiente.</li>
	<li>Para asegurar el éxito de este protocolo, se debe mantener la salud de los pares: controlar los pares de todos los días; realizar la condición corporal puntuación dos veces por semana; y los pares dos veces por semana. Nota: Cada pareja ocupa individualmente. Nota: Si utilizando buprenorfina regular (es decir no SR/slow release) entonces administrar 0,1 mg/kg por vía subcutánea en 1 mL de solución salina por el ratón dos veces al día durante 3 días.</li>
	<li>Permita que 4 semanas de tiempo de recuperación para asegurar la circulación compartida entre parabionts si realizar la cirugía de fractura tibial.</li>
</ol>4. cirugía de la fractura tibial (protocolo 1B)
<ol><li>Administrar analgesia (buprenorfina, 0,1 mg/kg por vía subcutánea) después de la inducción y antes de manipulación quirúrgica. Inyectar bupivacaína (0,25%) en el sitio quirúrgico proximal a la rodilla justo antes de la apertura. Aplique lubricante ocular.</li>
	<li>Afeitarse el aspecto medial de la extremidad trasera derecha del ratón para exponer el área quirúrgico y desinfectar con yodo + exfoliante de piel 70% alcohol 3 alternando ciclos. Mantener un campo quirúrgico estéril durante el procedimiento. Para limitar la contaminación; uso esterilizado los instrumentos y guantes; completar la cirugía con un microscopio de disección (opcional); y utilizar una almohada para mantener la temperatura corporal. Nota: Si el protocolo se lleva a cabo en parabionts, sólo 1 ratón se fractura en el par (la tibia derecha del derecho del ratón). Ver figura 1B para un diagrama esquemático de la fractura de parabionts.</li>
	<li>Use una tijera para hacer una incisión en la piel a lo largo del aspecto medial de la extremidad trasera derecha proximal a la rodilla hasta el midshaft de la tibia sobre el derecho del ratón.</li>
	<li>Exponer el midshaft de la tibia y localizar visualmente la diáfisis. La flexión de la rodilla y visualizar la meseta tibial mediante el ligamento de la rótula-femoral como un hito.</li>
	<li>Visualizar el tendón patelar; manual taladro girando los dedos pulgar e índice un agujero de 0,5 mm en el canal intramedular utilizando una aguja de calibre 25. Nota: El agujero funcionará paralelo a lo largo de la tibia, en a través de la meseta tibial.</li>
	<li>Introduzca un pin de acero inoxidable de 0,38 mm a través del orificio de 15 mm en la cavidad medular hasta que resistencia se siente y cortar al ras con la meseta tibial con un cortador de alambre (ver 1 vídeo complementario para una reconstrucción 3D).</li>
	<li>Usando las tijeras de Bonn recta, fractura el midshaft de la tibia (diáfisis). Ver figura 1 para un diagrama esquemático de la fractura.</li>
	<li>Observar visualmente el sitio de la fractura y los tejidos adyacentes a inspeccionar para la estabilización de la vista de la fractura.</li>
	<li>Cierre con grapas dérmicas.</li>
	<li>Coloque los ratones en pads climatizadas para recuperarse antes de volver a una jaula limpia casa. Inyectar 1 mL precalentado (37 ° C) solución salina normal por vía subcutánea en cada ratón para reposición de líquidos.</li>
	<li>Ver ratones diariamente para detectar signos de cojera, infección o sangrado. Nota: Si utilizando buprenorfina regular (es decir no SR/slow release) entonces administrar 0,1 mg/kg por vía subcutánea en 1 mL de solución salina diariamente durante 3 días.</li>
</ol>

<ol><li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perioperative+cognitive+decline+in+the+aging+population%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Perioperative cognitive decline in the aging population.</a> Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).</li>
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<li>Han, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delirium+in+the+emergency+department%3A+an+independent+predictor+of+death+within+6+months%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months.</a> Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).</li>
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<li>Harry, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+healing+of+open+tibial+fractures+covered+with+either+muscle+or+fasciocutaneous+tissue+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model.</a> J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).</li>
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<li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+postoperative+neuroinflammation+and+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline.</a> Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).</li>
<li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+alpha7+Nicotinic+Acetylcholine+Receptor+Protects+against+Neuroinflammation+after+Tibia+Fracture+and+Endotoxemia+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice.</a> Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).</li>
<li>Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-mobility+group+box+1+protein+initiates+postoperative+cognitive+decline+by+engaging+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages.</a> Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+mitochondrial+DAMPs+cause+inflammatory+responses+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury.</a> Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).</li>
<li>Degos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+bone+marrow-derived+macrophages+perturbs+the+innate+immune+response+to+surgery+and+reduces+postoperative+memory+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction.</a> Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).</li>
<li>Zhang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthopedic+surgery+modulates+neuropeptides+and+BDNF+expression+at+the+spinal+and+hippocampal+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).</li>
<li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A8+contributes+to+postoperative+cognitive+dysfunction+in+mice+undergoing+tibial+fracture+surgery+by+activating+the+TLR4%2FMyD88+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway.</a> Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).</li>
<li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+mediate+postoperative+hippocampal+inflammation+and+cognitive+decline+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice.</a> JCI Insight. 2 (7), e91229(2017).</li>
<li>Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+fear+conditioning+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Trace fear conditioning in mice.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Kamran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parabiosis+in+mice%3A+a+detailed+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Parabiosis in mice: a detailed protocol.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las fracturas son un problema clínico común y siguen siendo una causa importante de morbilidad, particularmente en la creciente población mayor. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para un modelo de ratón de fractura tibial para estudiar mecanismos responsables postoperatorio neuroinflamación y deterioro cognitivo. Este modelo puede combinarse con cirugía de parabiosis para estudiar las interacciones neuro-inmune, regeneración de tejidos y otros procesos de señalización. Entender estos mecanismos proporcionará objetivos estratégicos para minimizar los riesgos de complicaciones postoperatorias y optimizar los resultados.
Varios modelos ortopédicos se han desarrollado para estudiar la reparación ósea en roedores25. Hemos adoptado y modificado este procedimiento de fractura tibial, descrito originalmente por Harry et al. 8para estudiar efectos de la cirugía ortopédica en función del cerebro. También hemos usado este modelo de fractura en combinación con nuestro modelo de parabiosis investigar factores que son responsables de la cicatrización ósea y regeneración de los tejidos dependientes de la edad. Cuando se realiza bajo anestesia general volátil, este procedimiento de fractura tibial requiere unos 15 minutos por animal, resultados en cero mortalidad mínima (dependiendo de la edad del ratón y susceptibilidades genéticas subyacentes) y recapitula común injurias asociadas con fractura de hueso largo y trauma quirúrgico ortopédico. Así, este modelo es ideal para interrogar a vías biológicas y realización de evaluaciones longitudinales. Sin embargo, es fundamental que la osteotomía y la fijación son reproducibles, y que daño a los tejidos blandos es consistente. Daño de tejido suave puede ser modulada, por ejemplo el periostio y pellizcando los músculos circundantes para hacer la cirugía más traumático. Modelos de fractura traumática inducida por trauma embotado no fija o tres puntos de flexión no proporcionaría tal consistencia o exactitud. Estos procedimientos a menudo resultan en nuevas lesiones, que conduce a la respuesta inflamatoria prolongada. Por el contrario, los modelos de fractura con fijación rígida tienen una inflamación más moderada, que no recapitular completamente el daño asociado con la cirugía ortopédica26,27.
Otros modelos utilizando clavos de aleación de titanio se han desarrollado cerca mímica artroplastia humana y pueden ser más relevantes para interrogar a inestabilidad de la prótesis, osteólisis y complicaciones asociadas a prótesis en ratones28,29 . Modelos de agujero de taladro como el que aquí se presenta, proporcionar estabilización adecuada y ratones pueden probarse en paradigmas conductuales sin déficits significativos que podrían confundir tareas como miedo acondicionado o abierto campo locomoción, ansiedad prueba6 ,7,11,15,19,20. Sin embargo, deformidades rotacionales pueden ocurrir si la fijación no está correctamente bloqueada. Algunos modelos usan un fijador externo, que proporciona estabilización superior pero es difícil de implementar en la tibia de un ratón, aunque puede ser aplicado con éxito en un fémur de ratón27.
Las debilitaciones cognoscitivas, incluyendo delirio y la disfunción cognitiva postoperatoria, son complicaciones frecuentes después de cirugía ortopédica para la reparación de la fractura, especialmente en pacientes de edad avanzada y frágil30. Este modelo de ratón clínicamente relevantes de la cirugía de la fractura tibial demuestra que postoperatorias sistémicas cytokine release6,7,17, deteriorada barrera blood - brain función15,19 , alterado microglial morfología16,22, contribuir a la debilitación de la memoria y pueden representar las características críticas de las complicaciones neurológicas postoperatorias vistas en muchos pacientes después de cirugía ortopédica. Es importante tener en cuenta que otros procedimientos quirúrgicos se han utilizado para modelar la disfunción cognitiva postoperatoria en ratones. Estos incluyen abdominal31,32,33 y cirugía vascular34 , así como trauma superficial35,36. La técnica de parabiosis es aplicable a todos estos modelos, que comparten similares puntos finales, incluyendo inflamación, activación glial y déficits conductuales, que pueden estar mediados por mecanismos comunes.
Estudios que incluyen parabiosis han revelado nuevos roles de factores circulantes que pueden afectar la función cognitiva, neuroinflamación y rejuvenecimiento de tejidos en animales envejecidos37,38,39,40 ,41,42. Hemos demostrado que parabiosis se puede combinar con éxito con el modelo de fractura tibial descrito aquí para interrogar vías regenerativas y estudiar mecanismos que implican factores transmitidos por la sangre que influencia curación y fractura la reparación de12. Aquí, demostramos que la capacidad de reparación de la fractura de un animal envejecido puede ser rejuvenecida cuando el animal envejecido es anastomosado a un animal joven. Esta reversión de edad tiene su raíz en el engraftment de células hematopoyéticas en el sitio de la fractura. Curiosamente, también podría lograrse tal rejuvenecimiento mediante trasplante de médula ósea joven en ratones envejecidos. En este sentido, trasplante de médula ósea puede considerarse una alternativa más directa y más simple de parabiosis. Sin embargo, la parabiosis es un modelo más robusto para investigar la función de células y factores circulantes. Se espera que una combinación de modelos de cirugía ortopédica y parabiosis jugará un papel importante al responder a preguntas críticas en la atención perioperatoria y Biología del envejecimiento.
En Resumen, presentamos un protocolo paso a paso para un modelo de ratón de fractura tibial para estudiar los mecanismos responsables de neuroinflamación postoperatoria y el deterioro cognitivo después de procedimientos quirúrgicos ortopédicos. Este modelo puede combinarse con un procedimiento de parabiosis para estudiar las interacciones neuro-inmune, regeneración de tejidos y otras vías. Definición de estos mecanismos proporcionará objetivos estratégicos para minimizar los riesgos de complicaciones postoperatorias y optimizar los resultados.

La cirugía ha transformado el sistema de salud médico y continuamente está contribuyendo a la tecnología de punta, mayor seguridad y mantiene la calidad de vida. Desafortunadamente, la cirugía también induce respuestas fisiopatológicas que pueden conducir a complicaciones postoperatorias como infecciones de la herida, problemas neurológicos e incluso mortalidad, particularmente en pacientes mayores de1,2. Cirugía ortopédica se realiza rutinariamente, especialmente en los adultos mayores, para mejorar la calidad de vida y reparar lesiones óseas comunes. Sin embargo, hasta un 50% de los pacientes de cirugía ortopédica que son 65 años y mayor experiencia debilitaciones neurológicas como delirio postoperatorio. Esta siempre se correlaciona con mal pronóstico, es decir, 5-fold mayor riesgo de mortalidad a los 6 meses, el persistente deterioro funcional, mayor tiempo por paciente, mayor duración de la estancia hospitalaria y tasas más altas de colocación de asilos de enfermería 3 , 4 , 5. se han identificado algunos factores de riesgo, como edad avanzada, pero poco se sabe sobre los mecanismos responsables de deficiencias neurológicas después de la cirugía.
Puesto que las fracturas son muy comunes en los ancianos, hemos establecido un modelo de ratón de la fractura tibial para determinar el impacto del trauma periférico en la recuperación postoperatoria, incluyendo la neuroinflamación y cerebro salud (función cognitiva)6, 7. este modelo, descrito originalmente por Harry et al. 8, consiste en la fijación intramedular y fractura tibial bajo anestesia general y analgesia y así imita la lesión de la piel, trauma muscular, y hueso asociada con las fracturas del largo-hueso común de reparación y reparación en los seres humanos. Después de este procedimiento, ratones demuestran cambios en los marcadores inflamatorios similares a los cambios observados en los seres humanos9,10, así como la activación microglial en el hipocampo, que está asociada con déficits en la memoria declarativa y hipocampal de neuroplasticidad6,7,11. Previamente hemos combinado este modelo de fractura con parabiosis. Parabiosis es un modelo quirúrgico en el que se anastomosa 2 ratones y así compartan un sistema circulatorio. Este modelo ha proporcionado un gran avance en la comprensión de los efectos reglamentarios de circulación de las células y factores humorales en la función del órgano en el contexto de la enfermedad y la edad de13,12,14. Utilizando este enfoque recientemente hemos descubierto factores sistémicos de fractura depende de la edad curación12.
Aquí, presentamos un protocolo que combina el modelo de fractura tibial con parabiosis para estudiar mecanismos dependientes de la edad de hueso del cerebro, que son relevantes para la medicina regenerativa y Neuroinmunología. 1A protocolo describe el procedimiento de parabiosis y detalles del protocolo 1B el procedimiento de fractura tibial (figura 1A). Éstos pueden realizarse de forma independiente o en combinación, dependiendo de la naturaleza del interrogatorio.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-017-25</td><td>También se pueden utilizar otros agentes volátiles o anestesia inyectable</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals</td><td>NDC 12496- 6757-1</td><td>Opcional y en función de las recomendaciones individuales del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td>Solución al 70% para el tratamiento antiséptico de piel y limpieza</td></tr><tr><td>10% povidona Yodo</td><td>Dynarex</td><td></td><td>Para el tratamiento antiséptico de la piel</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>Low Flow&nbsp; Sistema de anestesia</td></tr><tr><td>MouseSTAT</td><td>Kent Scientific</td><td>PS1161</td><td>Pulsioxímetro & Monitor de frecuencia cardíaca</td></tr><tr><td>Afeitadora</td><td>Wahl</td><td>9854L</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí - #11</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Adson</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11006-12</td><td>Necesario para extirpar el periostio</td></tr><tr><td>Iris Pinzas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11066-07</td><td>Útiles (1x2 dientes) para causar traumatismos musculares/de tejidos blandos localizados</td></tr><tr><td>Tijeras Bonn (rectas)</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14084-08</td><td>Buenas para osteotomía, tenga en cuenta que debe cambiar regularmente a medida que se vuelve romo Tijeras finas</td></tr><tr><td></td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14058-09</td><td>Tijeras afiladas para cortar suturas</td></tr><tr><td>22G x 3.5 En Quincke&nbsp; Aguja espinal</td><td>BD</td><td>405181</td><td>Utilice la varilla interior para sujetar</td></tr><tr><td>los portaagujas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Aspecto</td><td>de sutura</td><td>1079B</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6/J</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>&nbsp; n.º de stock 000664</td><td></td></tr><tr><td>eGFP+ (que expresa la proteína fluorescente verde mejorada de forma ubicua)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>&nbsp; N.º de inventario 003291</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón de cirugía ortopédica para el estudio de la disfunción cognitiva postoperatoria y regeneración de los tejidos

A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

Cirugía se utiliza comúnmente para mejorar y mantener la calidad de vida. Por desgracia, en pacientes vulnerables como los ancianos, las complicaciones pueden ocurrir y disminuir significativamente el resultado. De hecho, después de la cirugía ortopédica rutinaria para reparar una fractura, tanto como el 50% de los pacientes ancianos padecen complicaciones neurológicas como delirio. Además, la capacidad de sanar y regenerar el tejido después de la cirugía disminuye con la edad y puede afectar la calidad de la reparación de la fractura e incluso óseo integración de implantes. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos que impulsan estos cambios depende de la edad podría proporcionar objetivos estratégicos para minimizar el riesgo de estas complicaciones y optimizar los resultados. Aquí, presentamos un modelo de ratón clínicamente relevantes de fractura tibial. Los cambios postoperatorios en estos ratones imitan algunas de las debilitaciones cognoscitivas comúnmente observadas después de la cirugía ortopédica rutinaria en los seres humanos. Brevemente, se realiza una incisión en la extremidades derecha bajo condiciones estrictamente asépticas. Los músculos se desvincularon y un pasador de 0.38 mm de acero inoxidable se inserta en la cresta superior de la tibia, en el canal intramedular. La osteotomía se realiza, y la herida es con grapas. Hemos utilizado este modelo para investigar los efectos del trauma quirúrgico postoperatorio neuroinflamación y cambios de comportamiento. Mediante la aplicación de este modelo de fractura en combinación con la parabiosis, un modelo quirúrgico en el cual se anastomosa 2 ratones, hemos estudiado y secretadas factores que sistémicamente rejuvenecen órganos función y tejido la regeneración después de lesión. Siguiendo nuestro protocolo paso a paso, estos modelos se pueden reproducir con alta fidelidad y pueden ser adaptados a interrogar a muchas vías biológicas que son alteradas por el trauma quirúrgico.

Después de osteotomías transversales fueron cuidadosamente realizadas bajo condiciones estériles con la constante inserción de pernos y de sutura adecuado, ratones no mostraban signos de cojera, infección o hemorragia en la pierna izquierda después de la cirugía. Ortopédico curación se evaluó mediante el análisis radiográfico y histomorphometry después de Safranina O tinción (figura 2). Las radiografías de las tibias fracturadas midshaft indican mayor deposición de tejido en los callos de fractura de ratones jóvenes que en los callos de fractura de ratones envejecidos. Callos de fractura descalcificadas y embebidos en parafina en preparación para análisis histológico. Las secciones fueron teñidas con safranina O y deposición de tejido se cuantificó mediante el análisis de la histomorfometría. Callos de fractura de ratones jóvenes contienen más hueso y el tejido menos fibroso que callos de fractura de los ratones envejecidos.
Fractura tibial induce la inflamación sistémica y central6,7,11,15,16. De hecho, periféricos niveles de citoquinas pro-inflamatorias y patrones moleculares asociados de riesgo (humedades) se elevan rápidamente después de la cirugía ortopédica, tanto en ratones y seres humanos7,17,18. Esto contribuye a la activación de las células microgliales en el cerebro a través de varios mecanismos de señalización que involucran las vías neuronales, humorales y celulares7,15,19,20, 21. Después de la cirugía, disfunción endotelial, apertura de la barrera blood - brain y macrófagos periféricos infiltración contribuyen a la aguda neuroinflamación hippocampal en wild-tipos y Ccr2RFP / + Cx3cr1GFP / + de ratones adultos15 , 19y han sido asociados con déficits de memoria posterior que se asemejan a delirio humano y la disfunción cognitiva postoperatoria15,19,22. Esta respuesta capensis se exacerba en animales de edad, con cambios significativos en la morfología de la microglía, ya detectado immunostaining IBA-1 (figura 3).
Utilizando el modelo de fractura tibial descrito aquí, también encontramos neurogénesis hipocampal transitorio deteriorada, según lo evidenciado por una reducción en immunostaining doblecortina (DCX) en la convolución del cerebro dentada20. Medidas electrophysiologic de potenciación a largo plazo (LTP), un sustituto para la función de memoria, revelaron una perturbación dependiente del tiempo en neuroplasticidad postoperatoriamente11. Ratones después de la cirugía también muestran deficiencias en la función de memoria dependiente del hipocampo, por ejemplo usando miedo acondicionado evaluación del comportamiento (figura 4). En el acondicionamiento de miedo, ratones se colocan en una cámara y expuestos a una señal auditiva seguida de un estímulo aversivo (es decir, asociar). Tres días después de la cirugía tibial, ratones se prueban en la cámara de acondicionamiento, esta vez sin ningún estímulo auditivo o aversivo, y congelación comportamiento se registra como un índice de memoria (para un protocolo detallado ver23).
Edad avanzada es un factor crítico de riesgo para la disminución de la memoria. Sin embargo, a medida que envejecemos, la capacidad de regeneración y reparación de los tejidos también disminuye aunque estos mecanismos siguen siendo mal entendidos. Por lo tanto, se utilizan los protocolos descritos para realizar heterocrónicas parabiosis (pareja joven/viejo animales) y evaluaron la fractura cura dentro de ratón (para un protocolo de parabiosis detallada véase24). Intercambio de sangre entre pares parabiotic fue confirmada y se encontró que igual12. Exposición a una reparación de hueso joven circulación mejorada con Unión anterior, aumenta la deposición de hueso y disminución de fibrosis (figura 5)12. Este rejuvenecimiento de la regeneración del hueso ocurrió independientemente de los osteoblastos de osteocalcina-positivo endógenos (células de lafigura 5, marrón), pero más bien dependía de células CD45 positivas que migra de la joven parabiont (células de lafigura 5, azul) . Estos resultados indican que las células hematopoyéticas de CD45 positivas secretan un nicho juvenil y saludable, que es capaz de indicar a las células osteoblásticas de inducirlos a ser más activos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig1.jpg"> Figura 1: representación esquemática de la cirugía de la fractura tibial y parabiosis. (A) línea de tiempo para la realización de parabiosis y fractura tibial (protocolo 1A) o solo de fractura tibial (protocolo 1B). (B) tibias de ratones de 20 meses en pares parabiotic isochronic o heterocrónicas fueron fracturados (pierna derecha del ratón derecho se fractura, como se indica con una X). Los ratones grises representan ratones de tipo salvaje mientras que ratones verdes representan ratones eGFP. (C) diagrama esquemático del modelo de la fractura tibial con fijación intramedular y fracturar el eje medio. Vea también 1 Video complementario para una reconstrucción 3D de las extremidades y la fijación de la tibia. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig2v2.jpg"> Figura 2: fractura Tibial curación en modelos con ratones jóvenes y viejos. Las tibias de los ratones jóvenes y viejos se fracturó y callos de fractura fueron investigados 21 días post lesión. (A) proyección de imagen radiográfica y manchas histologic (safranina O) fueron utilizados para evaluar la fractura callos 21 días post fractura. La coloración muestra tejido colagenoso en azul y proteoglicanos (dentro de cartílago) en rojo. Las líneas punteadas indican la ubicación aproximada del callo de fractura. Histomorfometría (B) se utilizó para evaluar la cantidad de hueso, cartílago y tejido fibrótico depositado dentro de la fractura callo 21 días post fractura. Los datos se expresan como promedio ± intervalos de confianza del 95%, * P &lt; 0.05 estadísticamente significativas (ANOVA de una vía, test de Dunnett), barras de escala representan 2 mm, y se obtuvieron imágenes mediante un microscopio, objetivo x 1.25. n = 9 para cada muestra. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig3.jpg"> Figura 3: cirugía inducida por activación microglial dependiente de la edad en el hipocampo. Cirugía de la fractura tibial induce neuroinflamación mayor hipocampo en ratones envejecidos (20 meses de edad) en comparación con ratones C57BL6/J de 4 meses de edad. Tinción con microglial marcador IBA 1-sección del cerebro muestra más positiva de las células y cambios morfológicos en quirúrgico grupos 24 h después de la cirugía. Imágenes fueron obtenidas con un microscopio epifluorescente con un aumento de 100 x.; barra de escala representa 10 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig4.jpg"> Figura 4: personas con problemas de neurogénesis, potenciación a largo plazo y función de memoria después de la cirugía de fractura tibial. DCX (A), un marcador cuantitativo de la neurogénesis, se reduce significativamente en el giro dentado del hipocampo a las 24 h después de la cirugía. Imágenes fueron obtenidas con un objetivo de microscopio de escaneo láser confocal con un aumento de 10 x; la escala de la barra representa 10 μm. (B) electrofisiología en rebanadas hippocampal de controles o ratones 24 h después de la cirugía. Potenciación a largo plazo (LTP) fue inducida por la estimulación de alta frecuencia (HFS) y registró más de 1 h. potenciales postsinápticos excitatorios (fEPSPs) de campo se registraron desde el radiatum del estrato de CA1 con una pipeta de grabación extracelular con regular líquido cefalorraquídeo artificial. A las 24 h después de la cirugía, inducción de LTP es notablemente reducida en comparación con ratones control. Los datos se expresan como media ± SEM n = 3, * p &lt; 0,05 ANOVA de 1 vía. Dependiente de Hippocampal (C) función de memoria (definido como % de congelación utilizando trace miedo acondicionado) está deteriorada en ratones después de la cirugía en comparación con los controles y animales expuestos a la anestesia sólo. Los datos se expresan como media ± SEM n = 9-10, * p &lt; 0,05 ANOVA de 1 vía. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig5.jpg"> Figura 5: cirugía de Parabiosis conduce al rejuvenecimiento de fractura cura, intercambio de sangre, donantes de células engraftment y. Isochronic y heterocrónicas maridajes de parabiosis fueron establecidos y el ratón de cada par fue fracturado y evaluado para la curación del hueso. (A) fractura callos fueron investigados usando proyección de imagen radiográfica. Las líneas punteadas indican la ubicación aproximada del callo de fractura. (B) el Engraftment de células eGFP + fue confirmado dentro de la médula ósea. (C) Immunohistochemistry del callo de fractura fue utilizado para identificar células de donantes de eGFP+ (azul) y osteocalcina+ células osteoblásticas (marrón) de la parabiont. Barras de escala representan 50 μm y se obtuvieron imágenes utilizando un objetivo de 40 x. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Video complementario 1: reconstrucción 3D de las extremidades y la fijación de la tibia. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/parte_slow.wmv">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo describe un modelo de ratón de cirugía ortopédica que se ha utilizado para estudiar mecanismos de neuroinflamación postoperatoria y cambios de comportamiento y cuando se combina con la parabiosis, para estudiar la regeneración de los tejidos durante el envejecimiento.

Un modelo de ratón de cirugía ortopédica para el estudio de la disfunción cognitiva postoperatoria y regeneración de los tejidos

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and ...

El objetivo general de estos métodos quirúrgicos es observar los efectos del trauma en la disfunción multiorgánica, específicamente la parabiosis se utilizará para la anastomosis de un ratón joven y viejo juntos, lo que resulta en un suministro de sangre compartido. A continuación, se fracturará uno de los ratones de este modelo para observar los efectos regenerativos y el efecto sobre la función cognitiva en relación con el sistema compartido del ratón joven y viejo. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave relacionadas con el campo de la inmunología, el envejecimiento, la regeneración de tejidos y la función cognitiva.La principal ventaja del procedimiento ortopédico es la aplicabilidad clínica de estos hallazgos a las complicaciones comunes después de la cirugía, por ejemplo, el delirio y la disfunción cognitiva postoperatoria. Antes del experimento, mantenga a los ratones en un ambiente con aire acondicionado con ciclos de luz y oscuridad de 12 horas y acceso adecuado a alimentos y agua estándar. No aloje a más de cinco compañeros de camada por jaula y evite las condiciones que podrían fomentar las peleas.Use un ratón hembra a los tres meses de edad y un ratón viejo a los 17 meses de edad. Para la parabiosis, aclimate a dos ratones juntos durante al menos dos semanas antes de la cirugía. Revise la condición corporal y la apariencia general de los ratones a diario.Para prepararse para la cirugía, pesa a los dos ratones. Después de administrar anestesia general, coloque a los ratones en una almohadilla térmica en posición supina. Por último, mantenga el nivel correcto de anestesia para cada ratón.A continuación, afeita a cada uno de los dos ratones a lo largo de una línea continua desde el codo, el flanco y la rodilla del lado que se va a unir. Desinfecte con yodo más un exfoliante cutáneo con 70% de alcohol durante tres ciclos alternos en preparación para la incisión. Comenzar administrando analgesia después de la inducción y antes de la manipulación quirúrgica.Inyecte bupivacaína al 0,25% en los flancos justo antes de abrir. En cada ratón, use un bisturí para hacer una incisión en la piel a lo largo del flanco que vaya desde la proximal hasta la proximal al codo y sin perturbar los músculos debajo de la piel. Unir los tríceps de los animales con dos suturas interrumpidas.A continuación, une las paredes del cuerpo a lo largo de los flancos con una sutura continua de siete a nueve pasadas. A continuación, unir los cuádriceps del animal con dos suturas interrumpidas y cerrar la piel de los dos parabiontes con suturas interrumpidas. Suturas interrumpidas completas con el ratón en posición prona.Permita que los ratones se despierten en el aire ambiente. Aloje cada par individualmente y asegúrese de monitorear los pares diariamente realizando una puntuación de la condición corporal dos veces por semana y pesando los pares dos veces por semana. Por último, permita cuatro semanas de tiempo de recuperación para garantizar la circulación compartida entre los parabiontes si se realiza una cirugía de fractura de tibia.A continuación, afeitar la cara medial de la extremidad trasera derecha del ratón para exponer la zona quirúrgica y desinfectar con yodo más un exfoliante cutáneo con alcohol al 70% durante tres ciclos alternos. Comenzar administrando analgesia después de la inducción y antes de la manipulación quirúrgica. Inyecte bupivacaína al 0,25% en el sitio quirúrgico proximal a la rodilla justo antes de la apertura.Mantener un campo quirúrgico estéril durante todo el procedimiento mediante el uso de instrumentos esterilizados en autoclave. Haga una incisión con unas tijeras proximales a la rodilla a lo largo de la cara medial de la extremidad posterior derecha hasta la diáfisis media de la tibia en el ratón izquierdo. Exponga el eje medio de la tibia y localice visualmente la diáfisis.Flexiona la rodilla y visualiza la meseta tibial utilizando el ligamento patelofemoral como punto de referencia. Visualiza el tendón rotuliano. A continuación, perfore manualmente un orificio en el canal intramedular con una aguja de calibre 25 con un movimiento giratorio del dedo y el pulgar.A continuación, inserte un alfiler de acero inoxidable de 0,38 milímetros a través del orificio unos 15 milímetros en la cavidad medular hasta que se sienta resistencia y corte la carne con la meseta tibial con un cortador de alambre. A continuación, utilice unas tijeras de unión recta para fracturar la diáfisis media de la tibia. Observe visualmente el sitio de la fractura y los tejidos adyacentes para inspeccionar la estabilización del sitio de la fractura.A continuación, cierre la piel con grapas dérmicas. Por último, inyecte un mililitro de solución salina normal precalentada a 37 grados centígrados por vía subcutánea en cada ratón para la reposición de líquidos. Coloque a los ratones en almohadillas térmicas para que se recuperen antes de devolverlos a una jaula casera limpia.Revise a los ratones diariamente para detectar signos de cojera, infección o sangrado. Las radiografías de la tibia fracturada de la diáfisis media indicaron más deposición de tejido en los callos de fractura de ratones jóvenes que en los callos de fractura de ratones envejecidos. Además, los callos de fractura de ratones jóvenes contenían más hueso y menos tejido fibrótico que los callos de fractura de ratones envejecidos.La cirugía de fractura tibial indujo una mayor neuroinflamación del hipocampo en ratones de 20 meses de edad en comparación con ratones de cuatro meses de edad. Además, los ratones después de la cirugía también muestran deficiencias en la función de memoria dependiente del hipocampo, por ejemplo, utilizando la evaluación conductual del condicionamiento del miedo. La exposición a una circulación juvenil mejoró la reparación ósea con una unión más temprana, aumentó la deposición ósea y disminuyó la fibrosis.Este rejuvenecimiento de la regeneración ósea se produjo independientemente de los osteoblastos endógenos osteocalcina positivos, sino que se basó en células CD45 positivas que migraron desde el joven parabionte. Una vez dominada, la técnica de parabiosis se puede realizar en 1-1/2 horas y el modelo de fractura tibial se puede realizar en 15 minutos. Si es necesario, los dos procedimientos también se pueden realizar de forma independiente entre sí.Al intentar el procedimiento de fractura de tibia, es importante mantener un campo quirúrgico esterilizado y garantizar la colocación adecuada del clavo y la osteotomía adecuada. Por último, recuerde vigilar cuidadosamente a los ratones durante toda la vida útil del estudio. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el modelo de parabiosis y la cirugía de fractura tibial.

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Pseudofracture, un modelo reproducible murino de trauma musculoesquelético estéril, permite la evaluación de finales de término post-traumático respuestas inmunes. En este artículo se describe el procedimiento de ejecución de la etapa de modelo a paso, incluyendo el potencial de las combinaciones de modelos experimentales para permitir el estudio de un politraumatismo.

Pseudofracture: Un Modelo periférica aguda trauma tisular

Aprende a realizar cirugía ortopédica en ratones para estudiar la disfunción cognitiva postoperatoria y la regeneración de tejidos mediante parabiosis entre animales jóvenes y adultos.

Un modelo de ratón de cirugía ortopédica para el estudio de la disfunción cognitiva postoperatoria y regeneración de los tejidos (Video) | JoVE Journal

Un modelo de ratón de cirugía ortopédica para el estudio de la disfunción cognitiva postoperatoria y regeneración de los tejidos

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