Un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3D sola partícula
3 de enero de 2018
Datos de este protocolo la construcción y operación de un microscopio de seguimiento en tiempo real 3D sola partícula capaz de seguimiento nanoescala fluorescente puntas de prueba a altas velocidades difusivos y tasas de conteo de fotones baja.
El objetivo general de este protocolo es implementar un microscopio de seguimiento de una sola partícula en 3D en tiempo real. La principal ventaja de esta técnica es que un solo objeto difusor a escala nanométrica puede ser monitoreado continuamente con una resolución temporal limitada por fotones. Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la virología, como el seguimiento de un solo virión a lo largo de todo el proceso de infección.
Prepare el aparato sobre una mesa óptica. Esta configuración está lista para la calibración. Los componentes clave incluyen un láser de estado sólido de 488 nanómetros, dos deflectores electroópticos que se encuentran a lo largo de la trayectoria del haz, una lente de gradiente acústico sintonizable y una etapa de muestra con micro y nano posicionadores.
Este esquema de la configuración proporciona detalles adicionales. Aquí está la trayectoria del rayo láser hasta la etapa de muestra. Los deflectores electroópticos y la lente acústica sintonizable se encuentran a lo largo de la trayectoria del haz.
Estos dispositivos impulsan dinámicamente el punto láser en la etapa de muestra. Los fotones de la muestra son contados por un fotodiodo de avalancha. Una cámara monitorea la posición de la partícula.
La posición de la muestra se establece mediante micro y nano controladores. Un conjunto de puertas programables en campo controla el punto láser, el cálculo de la posición de las partículas en tiempo real, la retroalimentación de la etapa y el recuento de fotones. Hay que preparar dos muestras.
El primero, requiere perlas fluorescentes de 190 nanómetros diluidas en solución salina tamponada con fosfato. Utilice un cubreobjetos para preparar una muestra de partículas fijas. Coloque 400 microlitros de la solución de cuentas en el cubreobjetos.
Ahora, produzca la muestra de partículas que se mueven libremente. Requiere perlas fluorescentes de 110 nanómetros diluidas en agua. Cree una muestra de partículas en movimiento libre colocando 400 microlitros de la solución en un cubreobjetos.
Lleve la muestra de partícula fija al microscopio para montarla. La muestra se encuentra en el posicionador nano XY. Encienda el láser, el fotodetector, los controladores de los elementos de la línea de haz y los posicionadores.
Ejecute el posicionador Piezo nano en un circuito cerrado. A continuación, retire el filtro de emisión de fluorescencia de delante del fotodetector. A continuación, varíe la posición z de la muestra con el microposicionador.
A medida que varía la posición, utilice el fotodetector para controlar la intensidad del reflejo del láser. Maximice la intensidad para identificar el plano focal de la lente del objetivo. Con la muestra en el plano focal, reemplace el filtro de emisión de fluorescencia.
Ahora, trabaje con el software de control de la computadora. Utilice un software personalizado para escanear la muestra en trama. Primero, establezca un rango de escaneo grande, la diferencia entre el inicio y el final.
Aquí, el rango es de 10 micrómetros en Y y 10 micrómetros en X. Además, establezca un tamaño de paso grande en cada dirección. Aquí, 200 nanómetros. Establezca ambos campos Z en la posición previamente identificada del plano focal.
Al pulsar escanear, se iniciará el escaneo ráster. Inicie el escaneo. El software acciona los deflectores electroópticos en un recorrido nocturno, recopila recuentos del fotodetector, acciona el nanoposicionador y realiza cálculos de posición.
El escaneo encontrará una partícula que es identificable en el software a través de una fluorescencia de plata. Para cada sitio en el escaneo, el software también determinará estimaciones de la posición de la partícula en X e Y, en relación con el centro del escaneo del deflector de electro-objeto. Después de encontrar la partícula, reduzca el rango de escaneo a su alrededor a dos micrómetros en X e Y.Además, disminuya el tamaño del paso para ambos a 100 nanómetros.
Agregue un rango de escaneo en la dirección Z de dos micrómetros para horquillar el foco fluorescente. Establezca el tamaño del paso Z en 200 nanómetros. Inicie el escaneo ráster 3D para encontrar el foco fluorescente.
Los datos producidos a partir del escaneo muestran el plano focal antes de que se encienda la lente de gradiente acústico sintonizable. Continúe trabajando con la configuración de la lente acústica sintonizable dentro de su software de control. Primero, haga clic en conectar, luego, encender.
Vaya a la sección de control de pulso y compuerta, cambie el modo de disparo de salida de RGB a multiplano. Luego, cámbielo nuevamente a RGB para permitir cambiar la fase de salida. Utilice los controles deslizantes para establecer la fase de salida entre cero grados, 90 grados y 270 grados.
A continuación, vaya a la sección de control de frecuencia. Allí, seleccione una frecuencia de resonancia de 68, 500 hercios. Muévase a la parte superior de la pantalla y haga clic en avanzado.
A continuación, elija la pestaña de configuración. En la nueva pantalla, busque la frecuencia máxima de la columna cero. Ajústelo para cambiar el rango de búsqueda de frecuencia.
Haga clic en Guardar calibración y, a continuación, salga de la calibración. Regrese a los controles de frecuencia y cambie la frecuencia de resonancia. Cámbielo inmediatamente a 68.500 hercios para que la calibración surta efecto.
En la sección de control de amplitud, use el control deslizante para aumentar lentamente la amplitud al 35%Después de esto, haga clic en bloquear resonancia. Cuando la frecuencia esté bloqueada, haga clic en desbloquear resonancia. Vuelva al software de escaneo ráster.
Introduzca dos rangos de escaneo de micrómetros centrados en la partícula en X e Y.Utilice un tamaño de paso de 100 nanómetros. Centre la partícula en un rango de cuatro micrómetros en Z, con un tamaño de paso de 200 nanómetros. En la imagen de escaneo resultante, la región de iluminación que representa la partícula tiene aproximadamente un micrómetro de ancho.
En función de esto, ajuste el parámetro de escala XY para que las posiciones estimadas en X e Y oscilen entre 0,5 micrómetros negativos y 0,5 micrómetros. Después de un procedimiento similar con la escala Z, coloque el posicionador nano en la posición cero. Apague la alimentación del nano posicionador antes de continuar.
Sustituya la muestra de partículas fija por la muestra de partículas que se mueve libremente. Luego, asegúrese de que todo el equipo esté encendido. Ejecute el posicionador Piezo nano en bucle abierto.
En la computadora, configure el software de lente de gradiente acústico sintonizable como antes. Retire el filtro de emisión de fluorescencia de la ruta hacia el fotodetector. Encuentre el plano focal variando la posición Z de la muestra y maximizando la intensidad de la reflexión láser, desde el cubreobjetos.
Después de encontrar el plano focal, aumente la posición de enfoque 15 micrómetros en la solución. Reemplace el filtro de emisión de fluorescencia. Abra el software de seguimiento personalizado.
Establezca los parámetros de estimación de posición en los valores encontrados durante la optimización. Ahora, establezca las constantes de control integral, que dictan la velocidad de respuesta del nano posicionador. Comience con la constante X.
Introduzca un valor bajo y auméntelo lentamente. Cuando comiencen las oscilaciones en la lectura de la posición de la partícula, observe el valor de la constante de control. Reduzca la constante de control integral a aproximadamente el 70% de su valor al inicio de la oscilación.
Repita los pasos con las constantes de control Y y Z. Configure el disparador para iniciar el seguimiento del umbral de la pista a tres kilohercios. Establezca el mínimo de pista, el gatillo para finalizar el seguimiento, en 1,5 kilohercios.
Para iniciar el experimento, haga clic en Buscar y, a continuación, haga clic en Seguimiento automático. Esta película muestra el resultado del uso del microscopio de seguimiento de localización de fotones dinámico y tridimensional para rastrear el movimiento difusivo de una nanopartícula fluorescente de 110 nanómetros en el agua. La posición de la partícula, medida mediante la lectura de posición del nanoposicionador, se muestra en los ejes 3D.
El recuadro es la lectura de la cámara científica de musgo marino. Demuestra que la partícula es retenida, bloqueada en el volumen focal, por el sistema de seguimiento. Se rastreó la partícula y se registró su posición durante más de dos minutos.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 50 minutos, si el sistema está correctamente alineado y los parámetros de calibración establecidos. Tras su desarrollo, esta técnica ayudará a los investigadores en el campo de la administración de fármacos a explorar las vías de internalización y transporte de la carga celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo operar un microscopio de seguimiento de partícula única en 3D de tiempo cero.
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Visión general
Este protocolo detalla la implementación de un microscopio de seguimiento de partículas individuales en tiempo real, 3D, diseñado para monitorear sondas fluorescentes a nanoescala. Esta técnica permite la observación continua de objetos individuales en difusión, incluso en condiciones limitadas por fotones.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microscopía
- Seguimiento de partículas individuales
- Virología
Fundamentos
- El seguimiento en tiempo real de partículas a nanoescala es crucial en varios campos científicos.
- Entender la dinámica de viriones individuales puede proporcionar información sobre los procesos de infección.
- Esta técnica mejora la capacidad para estudiar partículas a altas velocidades difusivas.
- Las limitaciones del conteo de fotones se abordan mediante configuraciones ópticas avanzadas.
Propósito del estudio
- Desarrollar un microscopio que pueda rastrear partículas individuales en tiempo real.
- Facilitar el estudio de infecciones virales monitoreando viriones individuales.
- Mejorar la resolución temporal del seguimiento de objetos a nanoescala.
Métodos utilizados
- Construcción de un microscopio de seguimiento de partículas individuales en 3D.
- Utilización de un láser de estado sólido de 488 nanómetros.
- Incorporación de deflectores electro-ópticos y una lente acústica de gradiente ajustable.
- Calibración del aparato en una mesa óptica con posicionamiento preciso.
Resultados principales
- El microscopio rastrea exitosamente sondas fluorescentes a nanoescala.
- Capacidad demostrada para monitorear partículas a bajas tasas de conteo de fotones.
- Permite la observación continua de viriones individuales durante la infección.
- Proporciona información sobre la dinámica de procesos virales.
Conclusiones
- Este protocolo establece un método robusto para el seguimiento de partículas en tiempo real.
- Abre nuevas vías para la investigación en virología y campos relacionados.
- La técnica puede mejorar significativamente nuestra comprensión del comportamiento viral.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Real-time 3D single particle tracking enables continuous monitoring of nanoscale objects under photon-limited conditions, addressing a critical gap in observing fast, three-dimensional cellular processes. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by providing high-resolution dynamic data on molecular interactions and trafficking pathways. The method enhances predictive confidence in target validation and lead identification by delivering quantitative, reproducible spatiotemporal data essential for informed go/no-go decisions in drug delivery and virology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking single virions or nanoparticles through infection processes with high spatiotemporal resolution.
- Operational Value: Provides functional target validation through direct observation of molecular dynamics in near-native environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative data on particle diffusion, binding, and transport kinetics under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements (position, trajectory, diffusion coefficient) essential for assay standardization and hit confirmation.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening via precise 3D localization and tracking of fluorescent probes.
- Scalability: Supports platform reuse through robust single-excitation/single-detection layout and calibrated electro-optic and acoustic gradient lens control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling real-time observation of cellular cargo internalization and transport pathways relevant to drug delivery.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in viral entry and intracellular trafficking models through direct visualization of single-particle behavior in solution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing reproducible, high-fidelity data on nanoparticle behavior under low photon flux conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for studies requiring dynamic, nanoscale resolution in three dimensions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling continuous tracking of single particles in 3D space under physiological mimicry.
- Screening: Enhances assay readiness through reproducible particle localization and tracking, facilitating reliable compound or nanoparticle evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs (position, velocity, confinement) that allow objective comparison of experimental conditions and therapeutic candidates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling drug delivery pathways and viral infection dynamics in biologically relevant systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability due to its modular optical layout, calibration protocol, and adaptability to different sample types and tracking objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nanoscale biological processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through calibrated raster scanning, position estimation algorithms, and feedback-controlled nano-positioning.
- Strategic Value: Improves capital efficiency and reduces late-stage biological risk by enabling early, data-driven decisions on target druggability and delivery mechanism feasibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, high-resolution tracking data that inform advancement criteria in drug delivery and antiviral development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and real-time control systems including FPGA-based feedback loops.
- Depends on specialized instrumentation: 488 nm solid-state laser, 2D electro-optic deflectors, tunable acoustic gradient lens, avalanche photodiode, and nano-positioning stages.
- Necessitates cross-team standardization for calibration protocols, position estimation parameters, and integral control constant tuning across users and labs.
- Involves adaptation considerations when transitioning from fixed bead samples to freely moving particles in viscous or complex biological media.
- Practical limitations include sensitivity to photon count rates and the need for careful optimization of tracking thresholds (e.g., 3 kHz start, 1.5 kHz end) to maintain lock-on under low-signal conditions.
