Name: Un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3D sola partícula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprende a implementar un microscopio de seguimiento 3D de partículas individuales en tiempo real. Esta técnica permite monitorear continuamente objetos nanométricos difusos con resolución temporal limitada por fotones, facilitando el estudio de procesos de infección viral.

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Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud con el número de concesión R35GM124868 y por la Universidad de Duke.

1. configuración del diseño y alineación
<ol>
	<li>Instalación y colimación de la excitación de seguimiento láser<ol>
		<li>Coloque el láser para la tabla óptica usando un montaje casa construida. El soporte es una placa de aluminio simple con agujeros para la cabeza del láser y la óptica mesa de montaje. El láser debe sujetarse firmemente a un soporte metálico para la estabilidad y la disipación de calor. Para este trabajo, utilizar un 488 nm láser de estado sólido para la iluminación (figura 1), aunque la longitud de onda se puede seleccionar para adaptarse a un fluoróforo particular o experimento. Un factor crítico es que la longitud de onda de láser ajuste la gama de trabajo 2D-EOD, que está determinada principalmente por la placa de la onda entre los dos deflectores (figura 1: W2). El láser de 488 nm efectivamente puede excitar la verde o amarilla proteína fluorescente (GFP/YFP), que son etiquetas fluorescentes comunes en los experimentos de células vivas.</li>
		<li>Ajustar la altura del rayo láser y la dirección con un par de espejos dieléctricos (figura 1: M). Asegúrese de que el rayo láser es paralelo a la tabla óptica y ajustarlo a una altura adecuada. Nota: La altura debe elegirse en base a la plataforma de microscopio. Esta altura debería mantenerse para todos los espejos posteriores en este protocolo, aunque esto estará no explícitamente indicado.</li>
		<li>Colimar el rayo con un par de lentes (figura 1: L1 y L2). Las distancias focales de lentes debe ser elegidas cuidadosamente para evitar que el foco del láser ser recortado por la abertura de la 2D-EOD. Recorte es evidente por un cambio en la forma de haz láser pasando a través de la 2D-EOD. La calidad de colimación aquí es muy importante porque se amplificarán las aberraciones de lentes posteriores y cualquier divergencia deteriorará el rendimiento de la desviación de 2D-EOD. Idealmente, colimar el rayo concentrándose la viga a un punto por lo menos 20 metros.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque un pequeño agujero (figura 1: PH) de tamaño adecuado en el foco de la primera lente de colimación (figura 1: L1).<ol>
		<li>Elegir un tamaño adecuado del agujero de alfiler. El tamaño del agujero de alfiler puede ser elegido según el siguiente cálculo: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Donde λ es la longitud de onda del laser, f es la distancia focal de la primera lente, y D es el diámetro de la viga de entrada.</li>
		<li>Montaje del agujero de alfiler en una etapa de traducción en 3D por lo que puede ser colocado precisamente en el foco de la primera lente de colimación.</li>
		<li>Ajuste la posición del agujero de alfiler. Coloque un medidor de potencia láser después del agujero de alfiler y ajustar la posición del agujero de alfiler en XYZ para aprovechar al máximo la lectura del medidor de energía. Si se observa un anillo de difracción, bloquear con un diafragma colocado antes de la 2D-EOD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de polarizador de Glan-Thompson<ol>
		<li>Poner el polarizador de Glan-Thompson (figura 1: GP) después de la segunda lente de colimación (figura 1: L2) para limpiar la polarización del haz láser. Girar el polarizador para encontrar la máxima de la transmisión con el medidor de energía.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de EODs<ol>
		<li>Utilizar 2 EODs (figura 1: EOD1 &amp; EOD2) para desviar el láser en las direcciones X e Y. Maximizar la transmisión de láser mediante el ajuste de la orientación, la echada y la altura de cada EOD.</li>
		<li>Alinee los dos EODs respecto unos a otros con el alineación marcador proporcionado por el fabricante en el costado de cada deflector.</li>
		<li>Aplicar un patrón de prueba con el controlador 2D-EOD para inspeccionar la salida de la EOD. Esto puede ser recorrido de caballero (figura 2) mediante el FPGA se describe a continuación o una simple onda senoidal proporcionada por un generador de funciones. Para el mejor desempeño, la desviación de cada deflector debe ser paralela a X o Y dirección de la nanopositioner piezoeléctrico. Esta dirección es dictada por la dirección angular de los deflectores sobre el eje de transmisión. Para girar la dirección de desviación sin mover el 2D-EOD, colocar un prisma de dove después del 2D-EOD para alinear los ejes de flexión a los ejes de nanopositioner piezo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de placa de media onda<ol>
		<li>Coloque una placa de media onda (figura 1: W1) entre el polarizador de Glan-Thompson (figura 1: GP) y el 2D-EOD para alinear el láser entrante haz de polarización con los ejes de la desviación de la 2D-EOD. Colocar una lente focal larga (300 mm) después de la EOD de 2D y una cámara sCMOS en el foco del láser. A continuación, encienda el 2D-EOD para generar tour del caballero que se describe a continuación (figura 2). Gire la placa de media onda hasta que una distribución de láser uniformemente cuadrado se observa en la cámara.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de una viga gastando lente par y par de lente de relé<ol>
		<li>Coloque un par de lentes (figura 1: L3 y L4) después de la 2D-EOD para expandir el haz para rellenar la abertura posterior de la lente del objetivo (figura 1: OL) y otro par de lentes (figura 1: L5 y L6) a relé del plano focal del objetivo del microscopio. Asegúrese de dejar suficiente espacio entre estos dos pares de lentes como el objetivo de la etiqueta se instalará entre ellos en un paso posterior.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instale el filtro dicroico divisor de viga de 10/90, de enfoque objetivo, APD, objetivo, filtro de emisión de fluorescencia para completar la vía de detección.<ol>
		<li>Instale el filtro dicroico (figura 1: DC) para reflejar el láser hacia el objetivo. Alinear el láser para ir directamente a través del centro de la lente del objetivo con dos iris en la parte superior e inferior de un tubo largo.</li>
		<li>Instalar un divisor de viga de 10/90 (figura 1: BS) por que el 10% de la luz se refleja para la proyección de imagen por una cámara de sCMOS (descrito a continuación) y 90% de pasa a través del APD para el seguimiento.</li>
		<li>Alinee el APD. Enfocar el láser en un cubreobjetos por la lente del objetivo. Utilice la reflexión de lo cubreobjetos para alinear elementos todo abajo por poner un cubreobjetos en el foco objetivo y comprobar la intensidad de la lectura de la APD. Después del divisor de viga, instalar el APD enfoque objetivo (figura 1: L7) seguido por el APD en una etapa de traducción en 3D. Coloque la lente que el reflejo del láser el objetivo pasa por el centro de la lente.</li></ol></li></ol>La posición de APD se puede optimizar ajustando la posición 3D para maximizar la intensidad de la reflexión del láser sobre el cubreobjetos. La posición de la APD está en la posición óptima cuando una medida de la posición del detector en cualquier dirección disminuye la intensidad.
		<li>Instalar un filtro longpass de emisión de fluorescencia (figura 1: F) antes del divisor de viga para eliminar la luz reflejada y dispersada.</li>
	
	
	<li>Instalación de la lente etiqueta<ol>
		<li>Coloque la lente de la etiqueta entre los dos pares de lentes (entre figura 1: L4 y L5) mencionado antes como se muestra en la figura 1. Ajustar el desvío, paso, altura y posición lateral tal que el rayo perpendicular pasa por la lente del centro de la etiqueta.</li>
	</ol>
	</li>

2. muestra preparación.
<ol>
	<li>Preparación de partícula fija<ol>
		<li>Diluir los granos fluorescentes de 190 nm a ~ 5 × 108 granos/mL en PBS. Añadir 400 μL granos solución sobre un cubreobjetos y Monte en el soporte de la muestra de la etapa piezoeléctrico (el volumen de granos dependerá el portamuestras; el diámetro de la cámara de soporte de muestra utilizada aquí es 18 m m). Para los granos aquí, PBS hace que las partículas en el cubreobjetos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de partículas móviles gratis<ol>
		<li>Diluir los granos fluorescentes de 110 nm a ~ 5 × 108 granos/mL con agua desionizada. Añadir 400 μL solución de granos en un cubreobjetos y montar sobre el soporte de la muestra de la etapa piezoeléctrico.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. optimizar los parámetros de seguimiento
<ol>
	<li>Exploración de trama fijada las partículas<ol>
		<li>Poner una muestra de partículas fijas en el microscopio.</li>
		<li>Activar el láser, controlador micropositioner, piezo nanopositioner controlador, controlador de la lente de etiqueta y EOD controlador. Tenga en cuenta que el orden no es crítico. Ejecute el nanopositioner piezoeléctrico en lazo cerrado.</li>
		<li>Raster scan muestra en XYZ con un personalizado análisis programa de software (Figura S3, software disponible a petición de los autores), que impulsa el 2D-EOD en visita de un caballero (figura 2), recoge las cuentas del APD, conduce el piezo nanopositioner y realiza el cálculo de posición (Figura S2). El tamaño de paso es de 40 nm y la gama de la exploración es 2 μm.<ol>
			<li>Para colocar el cubreobjetos en el foco del objetivo, extraer el filtro de emisión de fluorescencia y utilizar la reflexión del láser de cubreobjetos para maximizar la intensidad de señal en función de la posición Z de la micropositioner. Después de colocar la muestra en el plano focal, coloque nuevamente el filtro de emisión de fluorescencia.</li>
			<li>Abrir el programa de exploración. Fijar la gama de la exploración y el tamaño de paso escribiendo el número en la 'start', 'Finalizar' y 'al paso'. En primer lugar establecer una amplia gama de la exploración y el tamaño de paso para localizar una partícula (por ejemplo, 10 x 10 μm rango con tamaño de paso de 200 nm). Después de encontrar la partícula, la gama de la exploración del encogimiento y disminuir el tamaño de paso (por ejemplo, 2 x 2 μm rango con tamaño de paso de 100 nm). Haga clic en el botón 'scan' para realizar un análisis de trama 3D para encontrar el foco fluorescente.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configuración de la lente de etiqueta (vea la figura 3)<ol>
		<li>Haga clic en el software de control de lente de etiqueta. Haga clic en 'connect', 'encender' secuencialmente.</li>
		<li>Para cambiar la fase de salida de las señales de disparo, es necesario cambiar el modo de disparo de salida. Primero cambiar el modo de 'RGB' a 'Multiplane' y luego cambiar nuevamente. Ahora la fase puede ser cambiado (figura 3b).</li>
		<li>Establecer la fase de salida a 0 °, 90 ° y 270 °. Si bien pueden utilizarse cualquier tres fases que cubren el espacio de fase, estos tres se encuentran trabajando bien empíricamente (Figura 3C).</li>
		<li>Seleccione el ajuste de frecuencia Hz 68.500.</li>
		<li>Para encontrar la frecuencia óptima a menudo es necesario cambiar las frecuencias de búsqueda. Haga clic en 'avanzado', 'ajuste'. Cambio el ' Max. FREQ(Hz)' de la columna 0 de 70.000 Hz a Hz 71.500. Esto se puede ajustar a cualquier rango de frecuencia es apropiado. Haga clic en "Guardar calibración', 'salir de la calibración" (Figura 3d).</li>
		<li>Para hacer la nueva calibración efectiva, cambiar la resonancia a otra frecuencia (por ejemplo, 189.150 Hz) y luego cambiar a la configuración de frecuencia de 68.500 Hz (figura 3e).</li>
		<li>Cambiar gradualmente la amplitud al 35%. Haga clic en 'Bloquear la resonancia'. La frecuencia está bloqueada, haga clic en 'Desbloquear resonancia' (figura 3e). El objetivo de la etiqueta está listo para usar ahora.</li>
		<li>Para calibrar, cambiar los parámetros que se utilizan en la estimación para hacer la posición estimada igual a la posición real, como se muestra en la Figura 4e, f. entrada a la gama de la exploración de x, y y z y haga clic en 'scan' botón para analizar la muestra en XYZ para mover el partícula a través del foco del láser móvil. La posición de la partícula como se analiza a través del foco del laser debe de acuerdo con la posición de la partícula aproximadamente determinada por el lazo de la estimación de posición (Figura S1). La relación entre la posición estimada y la posición real (figura 4 d) se puede extraer de las imágenes de posición estimada (figura 4f). Si no acepta las posiciones, ajuste los valores de la posición del láser (ck) utilizado en el circuito de estimación de posición (Figura S1).</li>
		<li>Alinear la lente etiqueta<ol>
			<li>Cuando el controlador de la lente de etiquetas está desactivada, la trama analiza imágenes de partículas (descritos abajo) tomadas antes de instalar el lente de la etiqueta y después instalación etiqueta debería mirar idéntica. A continuación, realizar pila de partículas fluorescentes Z escaneo moviendo el objetivo con el nanopositioner de z para afinar la posición y el ángulo de la lente de la etiqueta (figura 4). Ajustar la posición de la lente de la etiqueta hasta que no hay deriva en las imágenes de partícula en el plano XY en la dirección Z, que se consigue cuando hay ningún cambio en la posición XY de la partícula en función de la posición de Z (figura 4 d). El sistema de seguimiento está listo para usar después de la alineación de la lente de la etiqueta.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de cámara sCMOS para monitoreo de partículas<ol>
		<li>Instalar una cámara sCMOS para visualizar las partículas mientras que están siendo rastreados. Instale el sCMOS sólo después de que todos los componentes del sistema de seguimiento instalados y optimizados.</li></ol></li></ol>Cargar una muestra fija de partículas fluorescentes en el microscopio y ejecutar el programa de seguimiento para una partícula en el volumen focal objetivo. A continuación, instale la lente de longitud focal de 100 mm (figura 1: L8) y sCMOS. Ajuste la posición del sCMOS por lo que la imagen de la partícula se centra en el punto más pequeño y más brillante.
	
	

4. en tiempo real seguimiento 3D de nanopartículas que difunde libremente
<ol>
	<li>Poner el 110 nm libre movimiento muestra de partículas en el microscopio.</li>
	<li>Encienda láser, regulador micro-posicionador, piezo nanopositioner controlador, controlador de la lente de etiqueta y controlador EOD. Ejecute el nanopositioner piezoeléctrico en lazo abierto. Configure el software de la lente de la etiqueta según el paso 3.2.</li>
	<li>Abra y ejecute el software de seguimiento (disponible a petición de los autores). Establecer la posición de parámetros de estimación los valores optimizados, que fueron encontrados en la sección 3.</li>
	<li>Para colocar el cubreobjetos en el foco del objetivo, extraer el filtro de emisión de fluorescencia y utilizar la reflexión del láser de cubreobjetos para maximizar la intensidad de señal en función de la posición Z de la micropositioner. Después de encontrar el cubreobjetos, aumentar el foco posición 15 μm para centrar el láser del cubreobjetos y en la solución. Coloque nuevamente el filtro de emisión de fluorescencia.</li>
	<li>Establecer las constantes de control integral. Las constantes de control integral pueden establecerse a partir de un valor bajo y aumentando lentamente hasta que las oscilaciones pueden verse en lecturas de posición de la partícula. Una vez que se observan oscilaciones, ajustar las constantes de control integral hasta el 80% del valor que causan las oscilaciones. Valores típicos será alrededor de 0.012 fines el XY' integral' y de 0.004 para el Z 'ganancia integral'.</li>
	<li>Establecer los umbrales de seguimiento en el 'Umbral de la pista' y 'Pista mínimo' y comienza el experimento de seguimiento haciendo clic en 'Buscar' y 'Auto Track'. El umbral para el rastreo de terminación es ligeramente más alto que el nivel de fondo y el umbral para la activación de seguimiento es aproximadamente dos veces mayor que el fondo. Aquí, el umbral para la activación de seguimiento es de 3 kHz y el umbral para poner fin a la trayectoria es 1,5 kHz.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Aunque muchas variedades de 3D sola partícula seguimiento métodos han surgido en los últimos años, robusto rastreo en tiempo real de la difusión de 3D de alta velocidad en tasas de conteo de fotones bajo con una configuración simple es todavía un reto, que limita su aplicación a la biológica importante problemas. El método 3D-DyPLoT había descrito en esta dirección estos retos en varios sentidos. En primer lugar, las vías de excitación y detección se simplifican considerablemente en comparación con otras implementaciones...

La aparición de técnicas de imagen avanzadas ha abierto una ventana para ver la estructura cada vez más detallada de los fenómenos celulares, hasta el nivel molecular. Métodos tales como la reconstrucción óptica estocástica (tormenta) la microscopia1,2,3, Foto-activado localización microscopia (Palma)4,5,6,7 , estructurado iluminación microscopia (SIM)8,9,10,11y estimuló la emisión (STED) la microscopia de agotamiento de12,13, 14 han ido mucho más allá del límite de difracción para entregar de detalle sin precedentes en la estructura y función de células vivas. Sin embargo, el completo entendimiento de cómo estos sistemas se comportan requiere información dinámica así como la información estructural. Los métodos de resolución súper mencionados implican una relación inversa entre la resolución espacial y resolución temporal, limitando la precisión temporal con la que pueden ser explorados procesos dinámicos. Un método que proporciona alta precisión espacial y resolución temporal es RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Aquí, dibujamos una distinción entre tradicionales 3D-SPT30 y RT-3D-designado tradicional SPT 3D simplemente requiere de una serie temporal de datos de imagen tridimensional (que se pueden adquirir ya sea mediante un microscopio confocal o un microscopio de epifluorescencia Dada la configuración correcta). En tradicional 3D-SPT, las coordenadas de la partícula se determinan después de la recolección de datos de localización de la partícula en cada pila imagen y concatenación de las ubicaciones en sucesivos volúmenes para crear una trayectoria. Estos métodos, la máxima resolución temporal está determinada por la tasa de proyección de imagen volumétrica. Para microscopios confocales, es fácilmente en la escala de segundos a decenas de segundos. Métodos de epifluorescencia, en donde el camino óptico es manipulado para que la información de localización axial puede ser extraída, la resolución temporal está limitada por el tiempo de exposición o lectura de cámara. Estos métodos epifluorescente están limitados en la gama que puede recopilarse información axial, aunque recientes avances en la fase del plano de Fourier máscaras diseño y óptica adaptativa está ampliando estas gamas a 10 μm o más31,32 , 33 , 34.
Por el contrario, RT-3D-SPT no se basa en adquirir una pila de imágenes 3D y la búsqueda de las partículas después del hecho. Por el contrario, se extrae información de ubicación en tiempo real a través de detectores de punto único y regeneración se aplica a efectivamente "bloquear" la partícula en el volumen focal de la lente del objetivo mediante el uso de una etapa piezoeléctrico de alta velocidad. Esto permite la medición continua de la posición de la partícula limitada sólo por cuántos fotones se pueden recoger. Además, este método permite interrogatorio espectral de la partícula que se mueve en gamas largas. RT-3D-SPT en efecto funciona similar a una trampa óptica fuerza-libre para objetos de escala nanométrica, donde la partícula continuamente es explorada y medida en tiempo real sin necesidad de poderes grandes láser u óptica de las fuerzas. Dado que RT-3D-SPT constituye una forma de interrogatorio continuo de objetos rápida difusión (hasta 20 μm2/s)25,29 en tres dimensiones en el fotón bajo cuenta tarifas20,29, 35, debe proporcionar una ventana en procesos biológicos rápidos o transitorios como transporte de carga intracelular, Unión ligando-receptor y la dinámica extracelular de viriones individuales. Sin embargo, a este punto, la aplicación de la RT-3D-SPT se ha limitado a ese puñado de grupos de trabajo para avanzar en esta tecnología.
Una barrera es la complejidad del diseño óptico requerida métodos de RT-3D-SPT, que son muy variados. Para la mayoría de los métodos, la retroalimentación óptica proporciona una etapa piezoeléctrica. Como los partícula hace pequeños movimientos en X, Y, o Z, lecturas de punto único detectores están convertidos a funciones de error y en alta velocidad a un nanopositioner piezoeléctrico, que en su vez mueve la muestra para contrarrestar el movimiento de la partícula, con eficacia bloqueo en su lugar con respecto a la lente del objetivo. Para medir pequeños movimientos posicionales en X, Y y Z, múltiples detectores (4 o 5 dependiendo de la implementación)15,18,21 o múltiples puntos de excitación (2-4, el menor de los cuales se puede aplicar si una amplificador de bloqueo se utiliza para extraer X y posición Y mediante una rotación láser spot) se aplican25,28 . La superposición de estas múltiples puntos de detección y emisión de hacer los sistemas difíciles de alinear y mantener.
Adjunto, presentamos un método de alta velocidad 3D objetivo bloqueado-SPT con un diseño óptico simplificado llamado 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT utiliza una EOD 2D y una etiqueta lente36,37,38 para mover dinámicamente un punto láser enfocado a través del volumen focal objetivo a una velocidad alta (50 kHz XY, Z de 70 kHz). Combinando la posición de foco del láser y el tiempo de llegada de fotones permite posición 3D del objeto a obtenerse rápidamente incluso en tasas de conteo de fotones baja. 2D-EOD conduce el enfoque láser en visita patrón39 con un tamaño de cuadrado de 1 x 1 μm en el plano X-Y de un caballero y el objetivo de la etiqueta mueve el enfoque láser en dirección axial con una gama de 2-4 μm. La posición de la partícula 3D se obtiene con una posición optimizada estimación algoritmo29,40 en 3D. El control del 3D dinámicamente móviles laser punto, fotón contando desde el fotodiodo de avalancha (APD), cálculo de posición de partículas en tiempo real, piezoeléctrico etapa retroalimentación y registro de datos se realizan en un arreglo de compuertas programables en campo (FPGA).En este protocolo, se describe cómo construir un microscopio 3D-DyPLoT paso a paso, incluyendo alineación óptica, calibración con partículas fijas y finalmente libre seguimiento de partículas. Como demostración, perlas fluorescentes de 110 nm fueron seguidos continuamente en el agua durante minutos a la vez.
El método descrito en este documento es una opción ideal para cualquier aplicación donde se desea monitorear continuamente una sonda fluorescente rápidos en niveles de luz bajos, incluyendo virus, nanopartículas y vesículas de endosomas. En contraste con los métodos anteriores, existe sólo una única excitación y detección solo camino, hacer alineación y mantenimiento sencillo. Además, el área de detección grande permite este microscopio fácilmente recoger rápidamente difundiendo partículas, mientras que la capacidad de seguimiento de nivel de señal baja (hasta 10 kHz) hace este método ideal para aplicaciones de baja luz29.

<table><tbody><tr><td>Deflector electroóptico 2D&nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 requerido</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación para EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>Convierte la salida de FPGA a alto voltaje para EOD</td></tr><tr><td>TAG&nbsp; Lente</td><td>TAG Optics</td><td>TAG 2.0</td><td>Se utiliza para desviar el láser a lo largo de la dirección axial</td></tr><tr><td>Nanoposicionador piezoeléctrico XY</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Se utiliza para mover la muestra para bloquear la partícula en el volumen focal del objetivo en&nbsp;</td></tr><tr><td>Z nanoposiitoner piezoeléctrico</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>Se utiliza para mover la lente del objetivo para seguir la partícula difusora</td></tr><tr><td>Microposicionador</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>Se utiliza para posicionar la muestra de forma aproximada y evaluar la</td></tr><tr><td>lente del objetivo</td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td> Se <td>requiere una apertura numérica alta para obtener la mejor sensibilidad. Cámara 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Se utiliza para monitorear la posición de la partícula</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Recuentos oscuros más bajos beneficiosos</td></tr><tr><td>Matriz de puertas programables de campo</td><td>Software</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>de</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Láser de excitación de seguimiento</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Lente</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>L1 Lente</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Estenopeico</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarizador</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>Placa de media onda</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lente</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td></td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td> Lente <td>L4</td></tr><tr><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L5 Lente</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>Espejo dicroico</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640RPC</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión de fluorescencia</td> DC <td>Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 divisor de haz</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas fluorescentes de 190 nm</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/9942</td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas fluorescentes de 110 nm</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/10617</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs DCC1545M</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Microscopio SM1D12D <td></td><td>Iris</td><td>Thorlabs</td></tr><tr><td></td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3d sola partícula

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Sola partícula tridimensional en tiempo real (RT-3D-SPT) de seguimiento tiene el potencial de arrojar luz sobre procesos rápidos y 3D en sistemas celulares. Aunque varios métodos de RT-3D-SPT han presentado en los últimos años, seguimiento de alta velocidad 3D difundiendo partículas en tasas de conteo de fotones baja sigue siendo un desafío. Por otra parte, configuraciones RT-3D-SPT son generalmente complejas y difíciles de implementar, limitar su aplicación generalizada a problemas biológicos. Este protocolo presenta un sistema RT-3D-SPT llamado 3D dinámica del fotón localización seguimiento (3D-DyPLoT), que puede rastrear partículas con difusores de alta velocidad (hasta 20 μm/s2) en tasas de conteo de fotones bajas (hasta 10 kHz). 3D-DyPLoT emplea un deflector de electro-óptico 2D (2D-EOD) y una lente de gradiente acústico armonioso (etiqueta) para conducir un único centrado láser punto dinámicamente en 3D. Combinado con un algoritmo de estimación de posición optimizada, 3D-DyPLoT puede trabar sobre partículas individuales con seguimiento de alta velocidad y precisión de localización alta. Debido a la excitación individual y diseño de ruta solo detección, 3D-DyPLoT es robusto y fácil de configurar. Este protocolo describe cómo construir paso a paso de 3D-DyPLoT. En primer lugar, se describe el diseño óptico. A continuación, el sistema es calibrado y optimizado por trama exploración una tira fluorescente de 190 nm con el nanopositioner piezoeléctrico. Finalmente, para demostrar la capacidad de seguimiento de tiempo real 3D, perlas fluorescentes de 110 nm se realiza un seguimiento en el agua.

Partículas fijas (figura 4) la exploración y difusión libremente 110 nm fluorescente rastreo de partículas (figura 5) fueron realizadas siguiendo el protocolo anterior. El análisis de partículas se realizó moviendo los fotones nanopositioner y bin piezoeléctricos mientras que simultáneamente, calcular la partícula había estimado posición en cada punto en la exploración. La exploración muestra un cuadrado de la intensidad uniforme...

Datos de este protocolo la construcción y operación de un microscopio de seguimiento en tiempo real 3D sola partícula capaz de seguimiento nanoescala fluorescente puntas de prueba a altas velocidades difusivos y tasas de conteo de fotones baja.

Un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3D sola partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

El objetivo general de este protocolo es implementar un microscopio de seguimiento de una sola partícula en 3D en tiempo real. La principal ventaja de esta técnica es que un solo objeto difusor a escala nanométrica puede ser monitoreado continuamente con una resolución temporal limitada por fotones. Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la virología, como el seguimiento de un solo virión a lo largo de todo el proceso de infección.Prepare el aparato sobre una mesa óptica. Esta configuración está lista para la calibración. Los componentes clave incluyen un láser de estado sólido de 488 nanómetros, dos deflectores electroópticos que se encuentran a lo largo de la trayectoria del haz, una lente de gradiente acústico sintonizable y una etapa de muestra con micro y nano posicionadores.Este esquema de la configuración proporciona detalles adicionales. Aquí está la trayectoria del rayo láser hasta la etapa de muestra. Los deflectores electroópticos y la lente acústica sintonizable se encuentran a lo largo de la trayectoria del haz.Estos dispositivos impulsan dinámicamente el punto láser en la etapa de muestra. Los fotones de la muestra son contados por un fot

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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