Name: Disección y la cultura de explante de Allantois murino para el análisis In Vitro del accesorio alantoideo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprende a disecar y cultivar explantes de alantoides murinos para analizar la unión alantoidea in vitro usando integrina α4β1. Este método modela el primer paso crítico en la formación de la placenta.

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Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (a A.G.).

Cría de ratón fue aprobado por el Regierung Unterfranken, y todos los análisis se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con todos los alemanes y la Unión Europea las leyes y reglamentos sobre uso y cuidado de animales de laboratorio.
1. capa de microtitulación las placas con la integrina α4β1 Ex útero alantoides explante cultura
<ol><li>Reconstituir la integrina α4β1 murino liofilizado 200 μg/ml en tampón fosfato salina (PBS). Diluir hasta una concentración final de 10 μg/mL en precalentado (37 ° C) PBS. Pipetear 20 μL/pocillo de la solución de la integrina α4β1 diluido en el número de pocillos de una placa de microtitulación (alantoides 1/pocillo). Nota: Evite la formación de burbujas de aire al recubrimiento de los pocillos de la microplaca.</li>
	<li>Incubar las placas de microtitulación durante 60 min a 37 ° C por colocarlos en una incubadora humidificada cultivo de tejidos.</li>
	<li>Cuidadosamente aspirar el sobrenadante con una pipeta. Usar una succión suave e inclinar la placa para evitar tocar el fondo del pozo con la punta de la pipeta. Lavar los pocillos dos veces añadiendo 50 μl de medio de cultivo de precalentado (37 ° C) como de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) y quitarlo del medio de lavado por succión suave.</li>
	<li>Paso crítico: bloque gratis sitios de Unión mediante la adición de 50 μL/pocillo de 0.1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) / DMEM e incube durante ≥ 30 min a 37 ° C mediante la colocación de las placas de microtitulación en una incubadora humidificada cultivo de tejidos. Nota: Explantes alantoides pueden unir a varias superficies en presencia de suero. Por lo tanto es imperativo para bloquear sitios de Unión inespecífica, después de cubrir los pozos con la integrina y antes de agregar el alantoides disecada para explantación cultura contiene suero en medio (ver paso 4.4).</li>
	<li>Mantenga los pocillos recubiertos en la solución de bloqueo a 37 ° C hasta que se necesite en el paso 4.4.</li>
</ol>2. útero disección de un ratón embarazada en Dpc 8
Nota: Reducir las tasas de falsos positivos embarazo peso ganancia discriminación15.
<ol><li>El ratón de sacrificio mediante dislocación cervical. Desinfectar la capa en la zona abdominal mediante pulverización con etanol al 70% (v/v). Nota: Lleve guantes al manipular ratones. Eutanasia por dislocación cervical sin anestesia evita la contaminación química de la alantoides, que pueden interferir con el accesorio de la alantoides.</li>
	<li>Haciendo una pequeña incisión en la línea media con unas tijeras para abrir la piel abdominal. Use los dedos enguantados para sostener la piel por encima y por debajo de la incisión y separe la piel hacia el pecho y la cola del ratón.</li>
	<li>Agarre el peritoneo con pinzas. Con la otra mano, hacen una incisión en forma de V desde anterior hacia posterior con unas tijeras y mueva el tejido para exponer la cavidad abdominal. Use las pinzas para empujar los intestinos a un lado para acceder al útero.</li>
	<li>Localice los dos cuernos uterinos. Sostenga el cuello del útero (el segmento caudal) con pinzas y corte los ligamentos con tijeras finas. Luego separar ambos cuernos uterinos, cortar los oviductos con tijeras.</li>
	<li>Utilice pinzas para transferir al útero en un plato de 10 cm estéril que contiene estéril, PBS de temperatura (RT). Eliminar el tejido adiposo, vasos y nervios que rodean los cuernos uterinos con finas pinzas o tijeras (figura 1A).</li>
</ol>3. embrión disección
Nota: Realice los siguientes pasos bajo un estereomicroscopio equipado con una gama zoom 8:1.
<ol><li>Separar los embriones por el corte entre los sitios de implantación con las tijeras. Sujete la guarnición uterina muscular de los cogollos de útero con pinzas y tire de ella aparte para exponer la decidua (figura 1B).</li>
	<li>Con unas pinzas, transferencia de los brotes del útero en una nueva placa de 10 cm que contienen estéril, RT PBS.</li>
	<li>Fijar la decidua en el embrión con las puntas del fórceps.</li>
	<li>Hacer una incisión en la parte de anti-mesometrial de la decidua con pinzas finas (figura 1) y retire la decidua con fórceps para exponer el embrión (figura 1). Nota: El polo mesometrial de la decidua está altamente vascularizado y puede ser más ancho en su base que la parte anti-mesometrial, que contiene el embrión y aparece más pálido.</li>
	<li>Diseccionar el embrión con el fórceps (Figura 1E, F).</li>
	<li>Usando una cuchara de micro, transferir el embrión en una gota de PBS estéril contenida en un recipiente estéril de 3,5 cm.</li>
	<li>Transferir el embrión en una dulce gota de PBS en el mismo plato de 3,5 cm con una cuchara de micro y disecar el embrión del saco de yema de huevo con unas pinzas (figura 1, H).</li>
	<li>Opcionalmente, si es necesario (por ejemplo, para la genotipificación por reacción en cadena de polimerasa), traslado del saco de yema de huevo en un tubo estéril aspirando con ~ 5 μl PBS en una punta de pipeta de orificio grande 200 μl. Almacenar a-20 ° C. Nota: Tejido materno (es decir, el saco vitelino parietal como membrana de Reichert y el cono de ectoplacental) que podría contaminar la preparación saco vitelino puede conducir a resultados erróneos de genotipificación. Eliminación de estos tejidos es más fácil antes de la disección del embrión desde el saco vitelino.</li>
</ol>4. alantoides disección y cultura Ex Utero en la integrina α4β1 inmovilizados
<ol><li>Corte el alantoides desde su sitio de inserción basal en el extremo posterior del embrión con unas pinzas finas (figura 1 H).</li>
	<li>Opcionalmente, si se requiere el desarrollo puesta en escena, contar los pares somite del embrión por inspección visual utilizando un microscopio equipado con óptica de contraste de fase y un 5 × 10 × objetivo. Nota: El embrión puede ser extendido con fórceps para facilitar el conteo del somite. Fusión y accesorio corioalantoideas ocurren entre E 8.0 y 9.0 E en embriones con pares ≥ 6 somite. Giro comienza en embriones con 6-8 pares de somite.</li>
	<li>Pipeta de 40 μL/pocillo de DMEM suplementado con suero bovino fetal 10% (v/v), L-glutamina y antibióticos en el número requerido de prelacado pocillos de la placa (véase sección 1).</li>
	<li>Recoger el alantoides flotante aspirando con ~ 5 μl PBS en un gran orificio de una pipeta de 200 μl. Transferencia 1 alantoides/bien.</li>
	<li>Incubar el allantoides colocando las placas de microtitulación en una incubadora humidificada cultivo de tejidos (37 ° C, 5% CO2) para p. ej., 6, 12 y 24 h. Para evitar interferencias con el accesorio de la alantoides, no se mueven las placas de microtitulación entre estos puntos de tiempo.</li>
	<li>En cada momento, anotar accesorio alantoides (p. ej., no alantoides accesorio/flotante alantoides parcial o totalmente Unido; totalmente propagación alantoides) utilizando un microscopio equipado con óptica de contraste de fase contraste o diferencial de interferencia y un x 5 o 10 x objetivo (figura 2). Nota: Ejemplos representativos de allantoides recién aislados y totalmente conectados se muestran en la figura 2. Ex utero, la punta distal del allantoides aislados de ratones C57BL/6J de tipo salvaje se fija dentro de las 4-6 h (esto se denomina fijación parcial de la alantoides) y accesorio completo de allantois todo se logra dentro de ~ 12 h de la cultura. Por 18-24 h, el explante ha aplanado y asumió una forma circular (que se refiere como totalmente extendido alantoides) con CD31-positivo del plexo vascular9,16.</li>
</ol>5. confirmación la coloración de la alantoides Explanted de la célula endotelial marcador CD31
<ol><li>Aspire el medio de cultivo de los explantes de extensión completamente y fijar las células añadiendo 40 μL/pocillo de paraformaldehído al 4% (w/v) / PBS. Nota: Paraformaldehido es tóxico. Use guantes y gafas de seguridad para evitar contacto con los ojos y la piel.</li>
	<li>Incubar por 10 min a temperatura ambiente y luego aspirar el sobrenadante. Lavar tres veces al agregar 40 μL/pocillo de PBS y quitarlo del medio de lavado por succión suave.</li>
	<li>Permeabilizar las células y bloquear sitios de Unión inespecíficos mediante la adición de 40 μL/pocillo de 0,1% (v/v) suero de cabra normal BSA/10% Triton X-100/0.1% (w/v) (v/v) en PBS durante 30 min a RT. Wash dos veces añadiendo 40 μL/pocillo de PBS y quitarlo del medio de lavado por succión suave. Nota: El protocolo puede hacer una pausa durante la noche en este punto.</li>
	<li>Mancha las células añadiendo 20 μL/pocillo de anticuerpos primarios anti-CD31 diluido 1:50 en 0.1% (p/v) BSA/PBS durante la noche a 4 ° C. Lavar tres veces al agregar 40 μL/pocillo de PBS y quitarlo del medio de lavado por succión suave.</li>
	<li>Detectar anticuerpos primarios Unidos añadiendo 20 μL/pocillo de marcada con fluorescencia secundaria cabra anticuerpos anti rata diluido 1: 200 en 0.1% (p/v) BSA/PBS para 1 h en placas de microtitulación RT. proteger de la luz por envolver en papel de aluminio o colocando en una cámara oscura. Lavar tres veces al agregar 40 μL/pocillo de PBS y quitarlo del medio de lavado por succión suave.</li>
	<li>Incrustar las células añadiendo 20 μL/pocillo de medio de montaje. Incubar durante ~ 1 h a temperatura ambiente hasta que haya solidificado el medio de montaje. Almacenar las placas de microtitulación a temperatura ambiente o a 4 ° C, protegido de la luz.</li>
	<li>Imagen el plexo vascular de la alantoides explantes bajo un microscopio de fluorescencia equipado un × 5 o 10 × objetivo y filtros de fluorescencia adecuado. Nota: Imágenes representativas del plexo vascular CD31-positivo de un alantoides completamente propagación se muestran en la figura 3. Otros marcadores para el plexo vascular, tales como anticuerpos dirigen contra Flk-1, capitán, Tie-1 Tie-2 puede utilizarse o bien16.</li>
</ol>

<ol><li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
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<li>Kwee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+development+of+the+embryonic+and+extraembryonic+circulatory+systems+in+vascular+cell+adhesion+molecule+%28VCAM-1%29+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice.</a> Development. 121 (2), 489-503 (1995).</li>
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<li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).</li>
<li>Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+murine+allantois+by+allantoic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Study of the murine allantois by allantoic explants.</a> Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).</li>
<li>Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+pre-placental+tissues+reveals+that+the+allantois+is+required+for+maintained+expression+of+Gcm1+and+Tpbpalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha.</a> Placenta. 47, 12-23 (2016).</li>
<li>Zeigler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allantois+and+chorion%2C+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion%2C+have+hematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li>
<li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17671451">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En presencia de suero, que es una rica fuente de moléculas de matriz extracelular adhesiva Pro como la fibronectina, alantoides explantes concederá fácilmente a varios plástico, vidrio o filtro superficies9,16. Por lo tanto, si del análisis realizado se pretende investigar específicamente el efecto de una modificación genética o cualquier otro tratamiento accesorio de la alantoides a inmovilizado α4β1, es fundamental para bloquear sitios de Unión inespecíficos (<...

La placenta es indispensable para el crecimiento embrionario y desarrollo en el ambiente uterino. Constituye la interfaz para oxígeno, metabolitos y nutrientes intercambio entre la circulación fetal y materna y también funciona como un órgano endocrino e inmunológico. Cualquier insulto endógeno o exógeno que deteriora el desarrollo placentario puede conducir a retraso de crecimiento intrauterino, pérdida fetal o complicaciones del embarazo, tanto en ratones como en seres humanos1. Mientras que el número de mutaciones de ratón específicos causantes de la fisiología placentaria anormal continúa aumentando2, con 219 genotipos actualmente listados en el sitio web de informática de genoma de ratón (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), muchos de estos fenotipos no están bien entendidas desde un punto de vista mecanicista. Además de alteraciones genéticas, fármacos de molécula pequeña, anticuerpos monoclonales, toxinas, patógenos, exceso metabolitos o diversos agentes ambientales pueden afectar desarrollo de placenta y función3,4,5 , 6 , 7. sin embargo, simple en vitro ensayos que pasos críticos del modelo en el desarrollo de la placenta son escasos.
Desarrollo placentario murino se inicia en el midgestation temprano, cuando el alantoides (precursor del desarrollo del cordón umbilical) emerge desde el extremo posterior del embrión como un brote que crece hacia el corion8. Chorioadhesive las células en la capa externa de la yema alantoidea median el accesorio y separarse de la alantoides en la superficie del corión (corioalantoideas "fusión"). El corion posteriormente dobla en las vellosidades en las que crece la vasculatura de la alantoides para formar el laberinto, la capa interna de placenta donde se intercambian nutrientes y oxígeno entre la sangre materna estrechamente yuxtapuestas sinusoides y vasos embrionarios9 ,10.
La fijación de la alantoides al corión es el paso inicial y fundamental en la formación del laberinto, y defectos en este proceso se encuentran entre las causas más comunes de mortalidad embrionaria en el midgestation1. Aunque un número de mutantes de ratón se ha descrito donde corioalantoideas accesorio no ocurren10, y la base de datos MGI enumera actualmente 108 mutantes de ratón que se caracterizan por la fusión anormal corioalantoideas (http:// www.informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), la interacción intercelular entre el vascular cell adhesión molecule-1 (VCAM-1, expresado en el mesodermo alantoideo) y la integrina α4β1 (expresado en el mesotelio coriónico, que es derivado de mesoderm extraembrionarias) parece ser indispensable para la fijación corioalantoideas y fusión11,12,13. La coloración de Immunohistochemical de montaje en todo tipo de salvaje embriones ha mostrado que VCAM-1 se expresa dentro de los dos tercios distales del tallo alantoideo por día aproximadamente embrionario (E) 7.513 (1-4 etapa de somite), y que su expresión sigue siendo alta durante corioalantoideas apego y fusión11,12. Normalmente se detecta fallo de accesorio alantoideo en el corion por análisis histológicos del útero brotes. Sin embargo, los tamaños alantoides son fisiológicamente muy variables entre y dentro de camadas de la misma etapa de desarrollo14y allantois solamente puede conectar al corion cuando ha alcanzado un tamaño suficiente para hacer contacto físico. Reflejando esta variabilidad natural, corioalantoideas accesorio ocurre en algún momento entre ~ E 8.0 y 9.0 E en el úteroy una evaluación estadísticamente fiable de este proceso por histología, por tanto, es dependiente en el análisis de un gran número de conceptuses obtener suficientes muestras en la etapa de desarrollo apropiada.
Aquí, describimos un método para evaluar apego alantoideo ex utero que es menos dependiente en tamaño del alantoides. Demostramos la disección de embriones de ratón y sus allantoides de los úteros de ratones embarazadas ~ 8 días post coitum (dpc; dpc 0.5 señala la detección de un tapón vaginal), y la posterior cultura del alantoides explantes de α4β1 inmovilizados integrinas. Este método permite una evaluación rápida y funcional de la fijación y propagar el comportamiento de los explantes de allantois múltiples en paralelo y en diferentes momentos sucesivos. El protocolo puede ser utilizado para detectar los efectos de las mutaciones específicas, drogas o diversos factores ambientales sobre alantoides accesorio ex vivo.

<table><tbody><tr><td>Ratones de tipo salvaje C57BL/6J</td><td>El laboratorio Jackson</td><td>Nº de inventario:&nbsp; </td><td></td>000664</tr><tr><td>70 % (v/v) de etanol</td><td>VWR International 930031006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de patrón estándar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Pinzas utilizadas para abrir la cavidad abdominal.</td></tr><tr><td>Pinzas de microdisección</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 forcepts de biología médica con punta fina y afilada.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras finas&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Cuchillas rectas.</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte&nbsp;</td>Tijeras de muelle Noyes <td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>con hojas de 14 mm para la disección de yemas uterinas.</td></tr><tr><td>Microcuchara</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5 mm Diámetro de la cuchara.</td></tr><tr><td>Placas de microtitulación</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>Utilizamos portaobjetos de angiogénesis estériles y sin recubrimiento (volumen interno 50 y micro; L) con una superficie hidrofóbica que no esté tratada con cultivo de tejidos para reducir la no &#945; 4&#946; 1-Fijación mediada al plástico.</td></tr><tr><td>Plato de 10 cm</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Platos estériles de cultivo de tejidos.</td></tr><tr><td>Plato de 3,5 cm</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>Platos estériles de cultivo de tejidos.</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de orificio grande&nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>Puntas de pipeta de baja fijación, 200 &micro;L.</td></tr><tr><td>&#945; 4&#946; 1 integrina</td><td>R& D Sistemas</td><td>6054-A4</td><td>Murine &#945; 4&#946; 1 integrina expresada y purificada recombinantemente a partir de una línea celular de ovario de hámster chino.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de DulbeccoSigma</td> <td>Aldrich</td><td>D8537</td><td>sin Ca2+ y Mg2+.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>La formulación contiene 4,5 g/L de glucosa, 110 mg/L de piruvato de sodio y 3,7 g/L de NaHCO3 pero no L-glutamina, que se añade por separado.</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10.000 U/mL de penicilina y 10.000 &micro; g/mL de estreptomicina) solución madre.&nbsp; Prepare y almacene alícuotas a -20 &deg; C para evitar la congelación/descongelación.</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) Solución madre. Prepare y almacene alícuotas a -20 &deg; C para evitar la congelación/descongelación.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>Utilizamos FBS inactivado por calor (calentado a 56 &deg; C durante 30 min con mezcla para inactivar el complemento).</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Utilizamos albúmina libre de proteasas y ácidos grasos. Prepare una solución al 0,1 % (p/v) en DMEM. Filtre estérilmente la solución a través de un filtro de cultivo celular desechable con un 0.22 &micro; m tamaño de poro y membrana de baja unión a proteínas, y almacene las alícuotas a -20 °C.</td></tr><tr><td>para-Formaldehído</td><td>Carl Roth</td><td>0335.2</td><td>Para hacer una solución de formaldehído en PBS, pese para-formaldehído en polvo en una campana ventilada y agréguelo a PBS precalentado a aprox. 60 °C; C en un vaso de precipitados sobre una placa para remover. Agregue 1 N de NaOH gota a gota hasta que la solución se aclare. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente y filtre a través de una jeringa de filtro de 0,22 mm. Ajuste el pH con HCl diluido a aprox. 6,9 y ajuste el volumen final con PBS. Alícuota y congelamos la solución, pero también se puede almacenar a 4 & grados; C durante aproximadamente cuatro semanas.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Utilice puntas de pipeta de orificio ancho para manipular Triton X-100 sin diluir.</td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>Para bloquear la unión inespecífica de anticuerpos en análisis de inmunofluorescencia.</td></tr><tr><td>&#945;-Anticuerpos CD31</td><td>BD Biosciences 550274</td><td></td><td>Anticuerpos monoclonales anti-ratón de rata purificados, clon MEC 13.3.</td></tr><tr><td>Anticuerpos secundarios anti-ratas de cabra</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>IgG anti-rata de cabra (cadenas pesadas y ligeras), adsorbidos cruzados, marcados con fluorescencia con Alexa Fluor 488. También son posibles otras etiquetas fluorescentes.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>Medio de montaje para citoquímica. MW ~31.000</td></tr><tr><td>Labovert&nbsp;</td><td>Leitz</td><td>Labovert&nbsp;</td><td>Microscopio de contraste de fase invertida equipado con un objetivo de 4 x y 10 x para el conteo de pares de somitas. Otros microscopios de contraste de fase (como los que se utilizan habitualmente en el cultivo de tejidos) también son adecuados. &nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td>Microscopio estereoscópico con un rango de zoom de 8:1 (con un aumento entre 7,5 x y 60 x) para la disección de embriones y alantoides.</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>Sistema de microscopio para histología con iluminación LED. Utilizamos objetivos HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 y HC PL FLUOTAR 10 x/0.30. Otros microscopios equipados con contraste de fase y óptica de fluorescencia se pueden utilizar para marcar la unión de alantoides.</td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>Cámara de captura digital 3-CCD acoplada al microscopio LED DM4000B. Utilizamos el software Diskus (Hilgers) para operar tanto el microscopio como la cámara.</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Microscopio confocal para la obtención de imágenes de alta resolución de endotelios en el plexo vascular de explantes de alantoides. Las imágenes de inmunofluorescencia se tomaron con un objetivo de 40x.</td></tr></tbody></table>

disección y la cultura de explante de allantois murino para el análisis in vitro del accesorio alantoideo

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

La placenta es fundamental para el crecimiento y desarrollo de los embriones mamíferos. Por esta razón, numerosas alteraciones genéticas e insultos también ambientales probables que perturbe el desarrollo de la placenta o función pueden causar la pérdida temprana del embarazo en ratones y seres humanos. Sin embargo, se carecen de ensayos simples en vitro para detectar posibles efectos en la formación de la placenta. Aquí, nos centramos en el primer y fundamental paso en la formación de la placenta, que consiste en la fijación de la alantoides en el corion de modelado. Se describe un método para evaluar rápidamente el accesorio de explantes alantoideo de la integrina α4β1 inmovilizados, que sirve como un substrato chorio-mimético. Este enfoque en vitro permite una evaluación cualitativa de la fijación y propagar el comportamiento de los explantes de allantois múltiples en diferentes momentos consecutivos. El protocolo puede utilizarse para investigar el efecto de las mutaciones de ratón específicos, drogas o diversos factores ambientales que se han relacionado con complicaciones del embarazo o pérdida fetal en el alantoides accesorio ex vivo.

Este protocolo describe un método para aislar y explante allantoides murino ex vivoy detalles de la evaluación cualitativa de la alantoides accesorio a la integrina α4β1, un proceso crítico en vivo corioalantoideas fusión. Los resultados representativos que se muestra en la figura 1A–H demuestran los pasos sucesivos de aislamiento alantoides a partir de útero durante el embarazo. Se retiran los tejidos mater...

Se describe un ensayo en vitro al accesorio corioalantoideas de modelo, el primer paso en la formación de la placenta. El protocolo muestra la cultura disección y explante de murinos allantoides de la integrina α4β1 inmovilizados. Accesorio de la alantoides se evalúa microscópicamente en momentos predeterminados.

Disección y la cultura de explante de Allantois murino para el análisis In Vitro del accesorio alantoideo

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

El objetivo general de este procedimiento es la disección y el cultivo de explantes de alantois murinos para el análisis de la fijación alantoidea in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo embrionario de mamíferos, como el control de la unión alantoidea para la formación de placenta. La principal ventaja de esta técnica es que modela el primer y crítico paso en la formación de placenta in vitro.La demostración del procedimiento estará a cargo de Kerstin Hadamek, una técnica de mi laboratorio. Para colocar las placas, primero agregue 20 microlitros de solución de integrina Alpha 4 / Beta 1 recién hecha en cada pocillo. Planifique un allantois por pozo.No deposite ninguna solución con burbujas de aire, ya que esto impedirá un recubrimiento adecuado. Después de cargar los pocillos, incube la placa durante una hora en una incubadora humidificada. Después de la incubación, aspire el sobrenadante de los pocillos mientras sostiene la placa inclinada, de modo que la pipeta pueda succionar suavemente la solución sin tocar el fondo de los pocillos.A continuación, lave los pocillos dos veces con 50 microlitros de medio de cultivo tibio. Al retir

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Principios de la cultura de órganos embrionarios de pulmón es un sistema muy útil para estudiar las interacciones epitelio-mesenquimal. Epiteliales y mesenquimales procede morfogénesis en condiciones específicas que pueden ser fácilmente manipulados en este sistema.

Cultura de embriones de ratón de pulmón, un sistema para evaluar los mecanismos moleculares de la ramificación

El mesénquima craneal experimenta movimientos dramáticos morfogénicas probable que proporciona una fuerza motriz para la elevación de los pliegues...

Un ensayo de explante para evaluar el comportamiento celular del mesénquima craneal

Cultivo celular primaria es una técnica útil para el análisis de poblaciones específicas de células, en particular a partir de embriones de ratones transgénicos en etapas de desarrollo específicas. En esto, los ventrículos embrionarias se disecan y se disociaron, y los granos de anticuerpos conjugados reconocen y se separan las células endoteliales para su posterior análisis.

Aislamiento de células endoteliales embrionarias ventriculares

Se presenta un ensayo in vivo la migración ex célula que permite la cuantificación precisa de los nervios potencial de migración de células de la cresta entérica en la presencia de varios factores de crecimiento.

Un ensayo de migración celular cuantitativa para murinos entéricas Neuronales Progenitores

Se describe la disección y el cultivo ex vivo de la piel del ratón embrionario. El sistema de cultivo mantiene una interfase aire-líquido a través de la superficie del tejido y permite formación de imágenes en un microscopio invertido. Melanoblastos, un componente de la piel en desarrollo, están marcados con fluorescencia que permite su comportamiento que debe observarse mediante microscopía confocal.

Ex vivo Cultura de embriones de ratón con la piel y en vivo de imágenes de melanoblasto Migración

La tecnología de imagen mejorada está permitiendo la obtención de imágenes tridimensionales de los órganos durante el desarrollo. Aquí describimos un sistema de cultivo de órganos completo que permite obtener imágenes en vivo de las vellosidades en desarrollo en el intestino fetal del ratón.

Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para Ex Vivo Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

El cultivo de gotas verticales ex vivo es una alternativa a las técnicas experimentales actuales in vitro e in vivo. Este protocolo es fácil de realizar y requiere cantidades más pequeñas de reactivo, a la vez que permite la capacidad de manipular y estudiar la vascularización, morfogénesis y organogénesis fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) se derivan de las células endoteliales especializadas (hemogenic) durante el desarrollo, sin embargo, se sabe poco sobre el proceso por el cual algunas células endoteliales especifican a convertirse en la formación de la sangre. Demostramos un método basado en citometría de flujo permite el aislamiento simultáneo de las células endoteliales y hemogenic HSPC de tejidos embrionarios murinos.

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

Se describe un método simple para establecer la placenta humana primaria (vellosidades) y cultivos de órganos de la decidua. cultivos de órganos de las vellosidades y decidua son herramientas muy valiosas para el estudio de la patogénesis en la interfase materno-fetal humano. La infección con la bacteria intracelular Listeria monocytogenes facultativos se demuestra.

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

Se presenta un método para el aislamiento y cultivo de conducto de Wolff ratón (WD). También demostramos un procedimiento detallado para toda la inmunotinción monte de WDS cultivadas / recién aisladas con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio del desarrollo de WD, bobinado, y la diferenciación.

Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos

Este protocolo describe el uso cultivadas Aorta-gónada-mesonefros para análisis de expresión, unidades formadoras de colonias en la cultura y el bazo y la reconstitución a largo plazo para determinar el efecto de factores reguladores y vías de señalización de vástago de hematopoietic desarrollo de la célula. Esto ha sido demostrado como un sistema eficaz para el estudio de la función y biología de células madre hematopoyéticas.

Aplicación de sistema de cultivo de explantes de Aorta-gónada-mesonefros en hematopoyesis del desarrollo

Aprende a disecar y cultivar explantes de alantoides murinos para analizar la unión alantoidea in vitro usando integrina α4β1. Este método modela el primer paso crítico en la formación de la placenta.

Disección y la cultura de explante de Allantois murino para el análisis In Vitro del accesorio alantoideo

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