Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

El objetivo general de este protocolo es visualizar la formación de biopelículas de Candida albicans en tiempo real en condiciones fisiológicas del huésped. Este método permite observar la formación de biopelículas a medida que se desarrolla en tiempo real y puede utilizarse para probar la eficacia de los agentes antimicrobianos o para evaluar los mutantes genéticos. Esta técnica se puede utilizar para evaluar la actividad de posibles terapias contra biopelículas de una manera de alto rendimiento y su eficacia se puede medir, visualizar y comparar con los tratamientos actuales.

La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para analizar la formación de biopelículas en varias condiciones diferentes que son de interés para los investigadores. Aunque este método se desarrolló específicamente para estudiar la formación de biopelículas de Candida albicans, también se puede aplicar a otros microorganismos formadores de biopelículas, incluidas otras especies de hongos y bacterias. Para comenzar, prepare cultivos de colonias individuales de diferentes cepas de C. albicans a partir de células colocadas en extracto de levadura, peptona dextrosa o agar medio YPD siguiendo las prácticas microbiológicas estándar.

A continuación, encienda el sistema microfluídico que incluye el controlador, las dos fuentes de alimentación, el microscopio, la cámara y la computadora conectada al sistema. Una vez que se cargue la computadora, abra el software que controla el sistema. Localice el número de código de barras de la placa en uso e introduzca el número cuando el software se lo solicite.

Luego, en el módulo de control, ajuste la temperatura del sistema microfluídico a 37 grados centígrados. A continuación, haga clic en los pozos de entrada I1, I7, I13 e I19 y haga fluir aire estéril a través de los tubos de la placa de interfaz durante cinco minutos para eliminar la condensación. Cuando toda la condensación se evapore, coloque la placa microfluídica de 48 pocillos 0-20 dinas en la platina del microscopio.

Para un experimento de formación de biopelícula de 12 horas, comience agregando 600 microlitros de medio precalentado a los pozos de entrada. Baje lentamente la placa de interfaz limpia sobre la placa microfluídica de 48 pocillos. A continuación, deslice la placa de interfaz ligeramente hacia la izquierda hasta que los tubos se coloquen en la parte superior de los pozos de entrada y salida y queden bloqueados en su posición.

En la sección de control de cizallamiento del software, establezca el modo de flujo en constante y establezca el cizallamiento máximo en una dina por centímetro cuadrado. A continuación, haga clic en los pozos de entrada con medios para iniciar el flujo de medios desde los pozos de entrada hasta los pozos de salida con el fin de cebar el canal. Después de cinco minutos de flujo, haga clic en el botón de parada en la sección de control de la placa de pocillos del software.

A continuación, retire la placa de interfaz y observe los pocillos de la placa microfluídica. Solo una pequeña gota de medio debe ser visible en los pozos de salida. Para probar cepas de C. albicans de tipo salvaje y mutante, agregue 50 microlitros de cultivo celular SC5314 de tipo salvaje en medio de araña a dos pocillos de salida, agregue el mutante bcr1 en medio de araña a dos pocillos de salida y agregue el mutante EFG1 en medio de araña a dos pocillos de salida.

Vuelva a colocar la placa de interfaz en la placa microfluídica y bloquee la tapa en su lugar. De vuelta en la sección de control de cizallamiento del software, establezca el modo de flujo en constante y establezca el cizallamiento máximo en dos dinas por centímetro cuadrado. Haga clic en los pozos de salida con celdas para comenzar el flujo de medios desde la salida hasta los pozos de entrada para comenzar la siembra de C.albicans.

Después de tres segundos, haga clic en el botón de parada en la sección de control de la placa de pocillos para evitar que las celdas ingresen a los pozos de entrada. Permita que las células permanezcan estacionarias sin flujo durante 10-20 minutos en el canal de visualización para la adherencia inicial de las células. En la ventana del módulo de imagen, abra el módulo de adquisición multidimensional y haga clic en la pestaña de la etapa en el menú de la izquierda.

En la sección de etapas, cargue la lista de etapas maestras para la placa microfluídica de 48 pocillos 0-20 dinas. A continuación, abra el ajuste de recarga de muestra y mueva la etapa a los módulos de posición absoluta. En el módulo de ajuste de recarga de muestra, presione el botón en vivo para ver una vista previa de la imagen con retícula.

Con el joystick, coloque la placa del pocillo de modo que la punta de la flecha adyacente al canal de visualización cuatro se alinee con el punto de mira del software. Luego vaya al menú de la etapa de movimiento a la posición absoluta y presione el botón establecer origen. A continuación, regrese al módulo de ajuste de recarga de muestra, haga clic en la sección del punto de referencia inicial en el menú de la izquierda y cargue el archivo para la placa microfluídica de 48 pocillos 0-20 dinas.

En la sección de la platina del módulo de adquisición multidimensional, haga doble clic en la posición de la platina 22.2 para acercar la platina de visualización del microscopio y el enfoque de la cámara al marcador de flecha visualizando el canal 22. A continuación, utilice el joystick para colocar la placa del pocillo de forma que la punta de la flecha adyacente al canal de visualización 22 se alinee con el punto de mira. Copie la coordenada Y en el módulo de adquisición multidimensional en la posición Y de.

2 en la pestaña Actualizar puntos de referencia del módulo de ajuste de recarga de muestra. Finalmente, en la pestaña de posiciones de la etapa de actualización del módulo de ajuste de recarga de muestra, haga clic en aplicar a la lista de etapas de MDA. En la ventana del módulo de imágenes, utilice el módulo de adquisición multidimensional y haga clic en la pestaña Guardar en el menú de la izquierda.

A continuación, seleccione el nombre de archivo del experimento y la carpeta para almacenar las imágenes adquiridas en el equipo. A continuación, haga clic en la pestaña de lapso de tiempo y configúrela para adquirir 145 imágenes en total cinco minutos entre cada imagen. Luego, en la pestaña de longitudes de onda, establezca el número de longitudes de onda en uno y capture al 50% de campo claro y 50% de cámara con un tiempo de exposición de 12 a 20 milisegundos.

Ajuste la ganancia a 0,6 y el digitalizador a 20 milihercios. Después de establecer el foco como se describe en el protocolo de texto adjunto, seleccione adquirir para comenzar a capturar imágenes de limpieza previa de las celdas adheridas para todas las subetapas. En la sección de control de cizallamiento, establezca el modo de flujo en constante y el cizallamiento máximo en una dina por centímetro cuadrado.

A continuación, haga clic en los pozos de entrada para iniciar el flujo de medios desde los pozos de entrada hasta los pozos de salida con el fin de eliminar las células no adheridas. Después de cinco minutos, haga clic en el botón de parada en la sección de control de la placa de pocillo. Permita que se adquiera una segunda ronda de imágenes y luego, en la sección de control de cizallamiento, ajuste el flujo de cizallamiento máximo a 0,5 dinas por centímetro cuadrado y confirme el cambio.

En la ventana del módulo de imágenes, seleccione la pestaña de herramientas de análisis y haga clic en revisar datos multidimensionales en el menú desplegable. A continuación, haga clic en seleccionar archivo base. Esto abrirá la ventana de utilidades del conjunto de datos multidimensionales.

A continuación, haga clic en el botón seleccionar directorio y elija la carpeta que se utilizó para guardar el experimento. En la lista de conjuntos de datos, seleccione el registro del archivo del experimento. Una vez cargado el registro, haga clic en el botón de visualización.

Seleccione la longitud de onda haciendo clic en las opciones en el menú de longitudes de onda de la izquierda y elija la posición del escenario para ver en un menú desplegable. Elija la imagen que desea cargar de los números en la parte superior del módulo haciendo clic con el botón derecho en el número de imagen. A continuación, selecciona todas las imágenes para hacer un vídeo timelapse.

Las imágenes seleccionadas se abrirán como un video en una nueva ventana. Haga clic en la pestaña de archivo en la ventana del módulo de imágenes y elija guardar como en el menú desplegable. Guarde el vídeo resultante como formato de archivo predeterminado.

Finalmente, abra y cargue el archivo de video guardado en la imagen J.In imagen J, haga clic en la pestaña de archivo y luego haga clic en guardar como. Elija AVI en el menú desplegable y convierta el archivo en un archivo AVI utilizando la conversión JPEG establecida en 10 fotogramas por segundo. En condiciones de tipo salvaje en medios RPMI 1640, varias células se adhirieron fuertemente al canal.

Forman hifas y se puede observar una biopelícula espesa con hifas y células de levadura intercaladas. Hacia el final del experimento microfluídico, la biopelícula de tipo salvaje llena completamente este canal de visualización. Sin embargo, la presencia de anfotericina B tiene un efecto pronunciado en la reducción de la formación de biopelícula.

Específicamente, la adherencia de las células disminuye y se puede ver que varias células se alejan con el flujo de cizallamiento del medio. Las células de control de tipo salvaje, esta vez cultivadas en medio de araña, formaron una biopelícula similar a la que se acaba de mostrar creciendo en RPMI. También se cultivan en este medio dos mutantes defectuosos en biopelícula.

Ambas cepas muestran una formación de biofilm severamente reducida en comparación con el control. En esta población celular, las células adheridas no forman hifas y la biopelícula resultante es gravemente defectuosa. Esta otra cepa es defectuosa en la formación de biopelículas y en su capacidad para adherirse al canal.

Una vez dominado, este experimento se puede configurar en menos de una hora. Con este método, se puede aprender mucho sobre una serie de aspectos diferentes de la formación de biopelículas, incluida la adherencia celular inicial, la maduración de la biopelícula y la dispersión celular. Este protocolo es altamente personalizable y versátil.

Se puede ajustar para evaluar diferentes especies microbianas en todos los reinos. Los caudales, las temperaturas, los tiempos de incubación y los medios también se pueden utilizar para estudiar las biopelículas de especies mixtas. Recomendamos encarecidamente este ensayo de biopelícula microfluídica como ensayo in vitro para ser utilizado antes de las pruebas in vivo en animales.

En nuestra experiencia, los resultados de este ensayo se correlacionan muy bien con los ensayos de biofilm in vivo existentes.