Name: Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprende a visualizar la formación de biofilms de Candida albicans en tiempo real utilizando un dispositivo microfluídico automatizado. Este método permite evaluar agentes antimicrobianos y mutantes genéticos.

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Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Nobile para discusiones útiles en ensayos de biofilm. Este estudio fue apoyado por los institutos nacionales de salud (NIH) subsidio AI125801 R21 (C.J.N.). D.L.R. fue apoyado por una Beca doctoral de la Universidad de California y el Instituto para México y los Estados Unidos (UC MEXUS) y el Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

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Clarissa J. Nobile es uno de los fundadores de BioSynesis, Inc., una empresa de desarrollo de inhibidores y diagnósticos de C. albicans biofilms.

El ensayo de biofilm microfluídicos personalizable aquí descrito permite la visualización de la formación de biofilm en tiempo real a un nivel unicelular cuando se expone a una tasa fija de flujo laminar y temperatura constante. Proporciona un medio poderoso para el desarrollo de biopelículas en cepas de tipo salvaje y mutantes, y los efectos de los tratamientos de agente antimicrobiano en biofilms bajo condiciones que imitan las condiciones fisiológicas observaron en entornos clínicos. A diferencia de la mayoría en ...

Candida albicans es un comensal miembro de la microbiota humana, sin embargo, es también un patógeno oportunista, capaz de causar infecciones fúngicas superficiales y graves1,2. Un rasgo importante de la virulencia de C. albicans es su capacidad de forma resistente y biofilms resistentes a los fármacos, comunidades de células adhirieron a una superficie y encerrado en una matriz extracelular de material1,3. Biopelículas de C. albicans son altamente estructurados, que contiene varias capas de varios tipos de células (alrededor de florecimiento levadura forma células, ovales células pseudohyphal y células hyphal tubulares)4. Desarrollo de biopelículas de C. albicans se inicia con la adherencia de las células de levadura-forma redonda a una superficie (siembra el biofilm), seguida de la proliferación de estas células en la superficie, y luego de la maduración del biofilm inmaduro la estructura en un biofilm formado completamente rodeada por material de matriz extracelular4. El biofilm madurito se compone predominante de las células hyphal alargadas que forman redes densas y comunicadas, proporcionando la estabilidad arquitectónica al biofilm4. Durante todo el ciclo de vida del biofilm, levadura de florecimiento las células dispersan de la biopelícula madura y pueden viajar a otras regiones del cuerpo para causar infecciones diseminadas o semilla nuevos biofilms en otros sitios4,5. C. albicans puede formar biofilms en superficies bióticas, tales como superficies de la mucosa y tejido anfitrión y en superficies abióticas, como catéteres, marcapasos, prótesis y articulaciones protésicas. Debido a las propiedades recalcitrantes de biopelículas, que son extremadamente difíciles de erradicar y en muchos casos la estrategia del único tratamiento eficaz es retiro del dispositivo infectado4. Por lo tanto es crucial investigar formación de biopelículas en condiciones similares a los observados en contextos clínicos.
Hay varias críticas en vivo modelos animales usados para el estudio de C. albicans biofilm formación6,7,8; sin embargo, estos estudios pueden ser costoso, desperdiciador de tiempo y están limitados por el número de cepas y de agentes antimicrobianos que se pueden probar en un momento dado. In vitro biofilms ensayos, por el contrario, permiten la evaluación rápida, alto rendimiento de compuestos antifúngicos y de cepas mutantes y son mucho más rentables y ético que biofilm ensayos llevados hacia fuera en animales modelos9, 10,11,12,13,14. Aquí se describe un ensayo en vitro que hemos desarrollado y optimizado para observar la formación de biopelículas temporal bajo flujo laminar utilizando dispositivo microfluídico personalizable14,15. El ensayo permite la visualización de cada etapa de formación de biopelículas, como el paso de adherencia inicial, proliferación celular, maduración de la biopelícula y dispersión de células. El ensayo también es útil para visualizar cambios de morfología de la célula durante el desarrollo de un biofilm.
Las placas de microtitulación, que normalmente se utilizan para en vitro los ensayos de biofilm, mientras que de alto rendimiento, no se permiten para condiciones de flujo controlado. Flujo laminar tradicional célula sistemas permiten la evaluación continua de la formación de biofilm en condiciones de controlar el flujo, pero éstos a menudo son lentos y suelen tener limitados rendimiento y control de rango dinámico. El dispositivo de microfluidos utilizado aquí supera estas limitaciones mediante la combinación de placas de alto rendimiento (contiene 48 pozos) con una cámara de flujo laminar incorporado y es altamente reproducible, versátil y personalizable.
Aquí, describimos un protocolo para el uso de un dispositivo microfluídico automatizado disponible en el mercado para evaluar la formación de biopelículas de un tipo salvaje C. albicans cepa, los efectos de un agente antifúngico conocido en el desarrollo de un biofilm y biofilm defectos de formación en dos cepas mutantes (bcr1Δ/Δ y efg1 Δ/Δ) que se reportaron anteriormente que biofilm in vitro e in vivo16,17,18. El protocolo descrito puede utilizarse para probar la eficacia de los agentes antimicrobianos en la inhibición de formación de biopelículas en el desarrollo de un biofilm y para identificar los genes requeridos para el desarrollo de biofilm normal por detección mutantes bibliotecas.

<table><tbody><tr><td>BioFlux 1000z</td><td>Fluxion</td><td></td><td>Dispositivo microfluídico automatizado para el análisis de células vivas</td></tr><tr><td>Placa de 48 pocillos 0-20 dinas</td><td>Fluxion</td><td>910-0047</td><td>Placa microfluídica</td></tr><tr><td>Software de montaje</td><td>Fluxion Versión</td><td>7.8.4.0</td><td>Software de análisis de visualización</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Extracto de levadura</td><td>Criterio</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptona</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa (D-Glucosa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de nutrientes</td><td>Criterio</td><td>C6471</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-manitol</td><td>BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Criterion</td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>Asas de inoculación estériles</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri con tapa transparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Papel para lentes</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca y cubeta espectrofotómetro</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>incubadora agitadora</td><td>Eppendorf</td><td>M12820004</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de la formación de biofilm de candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans es el hongo más común patógeno de seres humanos, causando aproximadamente el 15% de los casos de sepsis adquirida en el hospital. Un atributo importante de la virulencia de C. albicans es su capacidad de forma biofilms, comunidades estructuradas de células a superficies bióticas y abióticas. Pueden formar biopelículas de C. albicans en los tejidos del anfitrión, como capas de mucosa y en dispositivos médicos, tales como catéteres, marcapasos, prótesis y prótesis mixtas. Biofilms plantean desafíos clínicos significativos ya que son altamente resistentes a las perturbaciones físicas y químicas y pueden actuar como reservorios a semilla habían diseminada infecciones. Varios ensayos en vitro se han utilizado para estudiar la formación de biopelículas de C. albicans , como ensayos de placa de microtitulación, mediciones de peso seco, ensayos de viabilidad celular y la microscopia confocal de exploración láser. Todos estos ensayos son ensayos de punto final único, donde se evalúa la formación del biofilm en un punto de tiempo específico. Aquí, describimos un protocolo para estudiar la formación de biopelículas en tiempo real usando un dispositivo microfluídico automatizado bajo condiciones de flujo laminar. Este método permite la observación de la formación de biopelículas, el biofilm se convierte con el tiempo, usando condiciones personalizables que imitan a los del huésped, tales como los encontrados en catéteres vasculares. Este protocolo puede utilizarse para evaluar los defectos de biofilm de mutantes genéticos, así como los efectos inhibitorios de agentes antimicrobianos en el desarrollo de biofilm en tiempo real.

Realizamos microfluídicos biofilm ensayo descrito aquí usando un tipo de salvaje cepa de C. albicans bajo condiciones de dos medios de comunicación (medios RPMI-1640 y araña), la cepa de tipo salvaje en presencia de los conocidos antimicóticos anfotericina B (16 μg/mL) en RPMI, y dos cepas mutantes previamente divulgados a tener defectos en la formación de biopelículas (bcr1Δ/Δ y efg1 Δ/Δ) en los medios de la araña.
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Este protocolo describe el uso de un dispositivo microfluídico automatizado personalizable para visualizar la formación de biopelículas de Candida albicans en condiciones fisiológicas de host.

Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

El objetivo general de este protocolo es visualizar la formación de biopelículas de Candida albicans en tiempo real en condiciones fisiológicas del huésped. Este método permite observar la formación de biopelículas a medida que se desarrolla en tiempo real y puede utilizarse para probar la eficacia de los agentes antimicrobianos o para evaluar los mutantes genéticos. Esta técnica se puede utilizar para evaluar la actividad de posibles terapias contra biopelículas de una manera de alto rendimiento y su eficacia se puede medir, visualizar y comparar con los tratamientos actuales.La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para analizar la formación de biopelículas en varias condiciones diferentes que son de interés para los investigadores. Aunque este método se desarrolló específicamente para estudiar la formación de biopelículas de Candida albicans, también se puede aplicar a otros microorganismos formadores de biopelículas, incluidas otras especies de hongos y bacterias. Para comenzar, prepare cultivos de colonias individuales de diferentes cepas de C. albicans a partir de células colocadas en extracto de levadura, peptona dextrosa o agar medio YPD siguiendo las prácticas microbiológicas estándar.A continuación, encienda el sistema microfluídico que incluye el controlador, las dos fuentes de alimentación, el microscopio, la cámara y la computadora conectada al sistema. Una vez que se cargue la computadora, abra el software que controla el sistema. Localice el número de código de barras de la placa en uso e introduzca el número cuando el software se lo solicite.Luego, en el módulo de control, ajuste la temperatura del sistema microfluídico a 37 grados centígrados. A continuación, haga clic en los pozos de entrada I1, I7, I13 e I19 y haga fluir aire estéril a través de los tubos de la placa de interfaz durante cinco minutos para eliminar la condensación. Cuando toda la condensación se evapore, coloque la placa microfluídica de 48 pocillos 0-20 dinas en la platina del microscopio.Para un experimento de formación de biopelícula de 12 horas, comience agregando 600 microlitros de medio precalentado a los pozos de entrada. Baje lentamente la placa de interfaz limpia sobre la placa microfluídica de 48 pocillos. A continuación, deslice la placa de interfaz ligeramente hacia la izquierda hasta que los tubos se coloquen en la parte superior de los pozos de entrada y salida y queden bloqueados en su posición.En la sección de control de cizallamiento del software, establezca el modo de flujo en constante y establezca el cizallamiento máximo en una dina por centímetro cuadrado. A continuación, haga clic en los pozos de entrada con medios para iniciar el flujo de medios desde los pozos de entrada hasta los pozos de salida con el fin de cebar el canal. Después de cinco minutos de flujo, haga clic en el botón de parada en la sección de control de la placa de pocillos del software.A continuación, retire la placa de interfaz y observe los pocillos de la placa microfluídica. Solo una pequeña gota de medio debe ser visible en los pozos de salida. Para probar cepas de C. albicans de tipo salvaje y mutante, agregue 50 microlitros de cultivo celular SC5314 de tipo salvaje en medio de araña a dos pocillos de salida, agregue el mutante bcr1 en medio de araña a dos pocillos de salida y agregue el mutante EFG1 en medio de araña a dos pocillos de salida.Vuelva a colocar la placa de interfaz en la placa microfluídica y bloquee la tapa en su lugar. De vuelta en la sección de control de cizallamiento del software, establezca el modo de flujo en constante y establezca el cizallamiento máximo en dos dinas por centímetro cuadrado. Haga clic en los pozos de salida con celdas para comenzar el flujo de medios desde la salida hasta los pozos de entrada para comenzar la siembra de C.albicans.Después de tres segundos, haga clic en el botón de parada en la sección de control de la placa de pocillos para evitar que las celdas ingresen a los pozos de entrada. Permita que las células permanezcan estacionarias sin flujo durante 10-20 minutos en el canal de visualización para la adherencia inicial de las células. En la ventana del módulo de imagen, abra el módulo de adquisición multidimensional y haga clic en la pestaña de la etapa en el menú de la izquierda.En la sección de etapas, cargue la lista de etapas maestras para la placa microfluídica de 48 pocillos 0-20 dinas. A continuación, abra el ajuste de recarga de muestra y mueva la etapa a los módulos de posición absoluta. En el módulo de ajuste de recarga de muestra, presione el botón en vivo para ver una vista previa de la imagen con retícula.Con el joystick, coloque la placa del pocillo de modo que la punta de la flecha adyacente al canal de visualización cuatro se alinee con el punto de mira del software. Luego vaya al menú de la etapa de movimiento a la posición absoluta y presione el botón establecer origen. A continuación, regrese al módulo de ajuste de recarga de muestra, haga clic en la sección del punto de referencia inicial en el menú de la izquierda y cargue el archivo para la placa microfluídica de 48 pocillos 0-20 dinas.En la sección de la platina del módulo de adquisición multidimensional, haga doble clic en la posición de la platina 22.2 para acercar la platina de visualización del microscopio y el enfoque de la cámara al marcador de flecha visualizando el canal 22. A continuación, utilice el joystick para colocar la placa del pocillo de forma que la punta de la flecha adyacente al canal de visualización 22 se alinee con el punto de mira. Copie la coordenada Y en el módulo de adquisición multidimensional en la posición Y de.2 en la pestaña Actualizar puntos de referencia del módulo de ajuste de recarga de muestra. Finalmente, en la pestaña de posiciones de la etapa de actualización del módulo de ajuste de recarga de muestra, haga clic en aplicar a la lista de etapas de MDA. En la ventana del módulo de imágenes, utilice el módulo de adquisición multidimensional y haga clic en la pestaña Guardar en el menú de la izquierda.A continuación, seleccione el nombre de archivo del experimento y la carpeta para almacenar las imágenes adquiridas en el equipo. A continuación, haga clic en la pestaña de lapso de tiempo y configúrela para adquirir 145 imágenes en total cinco minutos entre cada imagen. Luego, en la pestaña de longitudes de onda, establezca el número de longitudes de onda en uno y capture al 50% de campo claro y 50% de cámara con un tiempo de exposición de 12 a 20 milisegundos.Ajuste la ganancia a 0,6 y el digitalizador a 20 milihercios. Después de establecer el foco como se describe en el protocolo de texto adjunto, seleccione adquirir para comenzar a capturar imágenes de limpieza previa de las celdas adheridas para todas las subetapas. En la sección de control de cizallamiento, establezca el modo de flujo en constante y el cizallamiento máximo en una dina por centímetro cuadrado.A continuación, haga clic en los pozos de entrada para iniciar el flujo de medios desde los pozos de entrada hasta los pozos de salida con el fin de eliminar las células no adheridas. Después de cinco minutos, haga clic en el botón de parada en la sección de control de la placa de pocillo. Permita que se adquiera una segunda ronda de imágenes y luego, en la sección de control de cizallamiento, ajuste el flujo de cizallamiento máximo a 0,5 dinas por centímetro cuadrado y confirme el cambio.En la ventana del módulo de imágenes, seleccione la pestaña de herramientas de análisis y haga clic en revisar datos multidimensionales en el menú desplegable. A continuación, haga clic en seleccionar archivo base. Esto abrirá la ventana de utilidades del conjunto de datos multidimensionales.A continuación, haga clic en el botón seleccionar directorio y elija la carpeta que se utilizó para guardar el experimento. En la lista de conjuntos de datos, seleccione el registro del archivo del experimento. Una vez cargado el registro, haga clic en el botón de visualización.Seleccione la longitud de onda haciendo clic en las opciones en el menú de longitudes de onda de la izquierda y elija la posición del escenario para ver en un menú desplegable. Elija la imagen que desea cargar de los números en la parte superior del módulo haciendo clic con el botón derecho en el número de imagen. A continuación, selecciona todas las imágenes para hacer un vídeo timelapse.Las imágenes seleccionadas se abrirán como un video en una nueva ventana. Haga clic en la pestaña de archivo en la ventana del módulo de imágenes y elija guardar como en el menú desplegable. Guarde el vídeo resultante como formato de archivo predeterminado.Finalmente, abra y cargue el archivo de video guardado en la imagen J.In imagen J, haga clic en la pestaña de archivo y luego haga clic en guardar como. Elija AVI en el menú desplegable y convierta el archivo en un archivo AVI utilizando la conversión JPEG establecida en 10 fotogramas por segundo. En condiciones de tipo salvaje en medios RPMI 1640, varias células se adhirieron fuertemente al canal.Forman hifas y se puede observar una biopelícula espesa con hifas y células de levadura intercaladas. Hacia el final del experimento microfluídico, la biopelícula de tipo salvaje llena completamente este canal de visualización. Sin embargo, la presencia de anfotericina B tiene un efecto pronunciado en la reducción de la formación de biopelícula.Específicamente, la adherencia de las células disminuye y se puede ver que varias células se alejan con el flujo de cizallamiento del medio. Las células de control de tipo salvaje, esta vez cultivadas en medio de araña, formaron una biopelícula similar a la que se acaba de mostrar creciendo en RPMI. También se cultivan en este medio dos mutantes defectuosos en biopelícula.Ambas cepas muestran una formación de biofilm severamente reducida en comparación con el control. En esta población celular, las células adheridas no forman hifas y la biopelícula resultante es gravemente defectuosa. Esta otra cepa es defectuosa en la formación de biopelículas y en su capacidad para adherirse al canal.Una vez dominado, este experimento se puede configurar en menos de una hora. Con este método, se puede aprender mucho sobre una serie de aspectos diferentes de la formación de biopelículas, incluida la adherencia celular inicial, la maduración de la biopelícula y la dispersión celular. Este protocolo es altamente personalizable y versátil.Se puede ajustar para evaluar diferentes especies microbianas en todos los reinos. Los caudales, las temperaturas, los tiempos de incubación y los medios también se pueden utilizar para estudiar las biopelículas de especies mixtas. Recomendamos encarecidamente este ensayo de biopelícula microfluídica como ensayo in vitro para ser utilizado antes de las pruebas in vivo en animales.En nuestra experiencia, los resultados de este ensayo se correlacionan muy bien con los ensayos de biofilm in vivo existentes.

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Inmunología e Infección

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Fuente: Kurz, D. L., et al. Plataforma microfluídica para estudiar el biobloqueo en medios porosos. J. Vis. Exp. (2022)El vídeo demuestra el uso de un dispositivo microfluídico para estudiar la formación de biopelículas. Se introduce una suspensión bacteriana en el microcanal, seguida de incubación para permitir el desarrollo de biofilm. Luego se reanuda el flujo y se utiliza la monitorización de la presión junto con la imagen para detectar la formación de biofilm y la obstrucción de los poros...

Un dispositivo microfluídico para imágenes en tiempo real y seguimiento de presión durante la formación de biopelículas

Este video demuestra el desarrollo de un modelo de ratón in vivo para estudiar la formación de biopelículas de Candida albicans en tejido subcutáneo. El experimento consiste en implantar dispositivos infectados con Candida en la región posterior del animal para el desarrollo de la biopelícula.

Candida albicans Formación de biopelículas en un modelo de ratón in vivo

Este video describe un método para cultivar y analizar cualitativamente biopelículas bacterianas en hifas fúngicas utilizando microscopía. Las biopelículas bacterianas se forman con frecuencia en las superficies fúngicas e involucran numerosos procesos de interacción bacteriano-fúngico, como la cooperación metabólica, la competencia o la depredación.

Un método para la preparación de muestras para visualizar bacterias formadoras de biopelículas en hifas fúngicas

Se discuten los protocolos para el estudio de la formación de biopelículas en un dispositivo microfluídico que imita medios porosos. El dispositivo microfluídico consta de una matriz de micropilares y se investiga la formación de biopelículas por Pseudomonas fluorescens en este dispositivo.

Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares

Presentamos un procedimiento experimental de desarrollo de biofilm de Candida albicans en un modelo subcutáneo de ratón. Las biopelículas fúngicas se cuantificaron determinando el número de unidades formadoras de colonias y mediante una imagen de bioluminiscencia no invasiva, donde la cantidad de luz que se produce se corresponde con el número de células viables.

Candida albicans biopelícula Desarrollo de Cuerpos Extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea Seguido por bioluminiscencia Imaging

El objetivo de este documento métodos es describir el uso de un sistema de microfluidos para el desarrollo de biopelículas de especies múltiples que contienen especies típicamente identificados en la placa dental supragingival humano. Métodos para describir la arquitectura de biopelículas, la viabilidad de biopelículas, y un acercamiento a la cosecha biofilm para los análisis dependientes de la cultura o la cultura independiente se destacan.

El uso de un gran procesamiento<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema de microfluidos para el Desarrollo de biopelículas orales múltiples especies

Este protocolo describe un nuevo método para hacer crecer y cualitativamente analizar biopelículas bacterianas en hifas de los hongos por microscopía confocal y electrónica.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Describimos el montaje, operación y limpieza de un aparato de flujo diseñado para la formación de biopelículas fúngicas de imagen en tiempo real bajo flujo. También ofrecemos y discutir los algoritmos cuantitativos para ser utilizado en las imágenes adquiridas.

Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico

Para ver y cuantificar las características internas de las biopelículas de Candida albicans, preparamos especímenes fijos intactos que se clarifican mediante la coincidencia del índice de refracción. A continuación, la microscopía de seccionamiento óptico se puede utilizar para obtener datos de imagen tridimensionales a través del espesor completo de la biopelícula.

Aclaración e imagen de Candida albicans Biofilms

Aprende a visualizar la formación de biofilms de Candida albicans en tiempo real utilizando un dispositivo microfluídico automatizado. Este método permite evaluar agentes antimicrobianos y mutantes genéticos.

Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

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