Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

El objetivo general de esta configuración experimental es delinear las principales capas de regulación del ARN y el ADN para descubrir los principales mecanismos moleculares que ocurren en respuesta a un estímulo o tratamiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en muchos campos biológicos diferentes, como las respuestas inmunitarias en general, pero también las respuestas moleculares al tratamiento farmacológico. La principal ventaja de esta técnica es que permite mostrar simultáneamente múltiples capas de regulación génica a lo largo del tiempo.

Por lo tanto, es importante utilizar el mismo grupo de células para cada método. A grandes rasgos, estos tres protocolos implican manipular primero las celdas de interés en diferentes puntos temporales. Después de cada manipulación, las células se agrupan y se dividen en tres grupos, uno para cada ensayo.

Esta sección del video describe el etiquetado y la purificación de las transcripciones producidas más recientemente utilizando el etiquetado 4sU. En última instancia, cada protocolo produce muestras listas para la secuenciación. En primer lugar, busque la concentración de 4sU requerida y el tiempo de incubación necesario para la línea celular de interés.

Por ejemplo, 200 micromolares 4sU se utilizan en las células T durante una hora. Separe el grupo de células después del tratamiento en un plato separado para cada método y punto de tiempo. Luego, descongele completamente el número requerido de alícuotas de 4sU y agregue el 4sU directamente al medio celular e incube los cultivos según las indicaciones.

A continuación, recoja las células marcadas con 4sU en tubos de polipropileno. Luego, centrifuga las células. Vuelva a suspender el pellet en TRIzol a aproximadamente tres millones de células por mililitro e incube las células en TRIzol a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Ahora prepare de 30 a 80 microgramos de ARN, o más, utilizando el método de Radle y compañía. A continuación, mezcle la reacción de biotinilación específica del tiol en este orden. Comience con agua libre de nucleasas, luego tampón 10 veces, luego ARN y finalmente biotina-HPDP.

A continuación, mezclar con el pipeteo e incubar. Continúe con el paso de limpieza para producir muestras de ARN biotinilado recién transcrito mezclado con ARN preexistente sin marcar. A continuación, caliente las muestras a 65 grados centígrados durante 10 minutos.

Luego, colóquelos inmediatamente en hielo. Una vez que cada muestra se enfríe, agregue 100 microlitros de perlas de estreptavidina e incube a temperatura ambiente con rotación durante 15 minutos. Ahora, aísle las perlas decoradas con ARN recién transcrito usando una columna magnética y luego eluya el ARN en 11 microlitros de agua libre de nucleasas para la secuenciación.

En esta sección se describe cómo aislar el ARN que se está traduciendo activamente. La secuenciación de estas transcripciones examina el traslatosoma dinámico. Junto con los datos de secuenciación de ARN, este ensayo permite calcular el recambio de ARN y las tasas de traducción.

Comience agregando cicloheximida a la suspensión y mezclándola usando inversiones. Después de un minuto a temperatura ambiente, centrifugue las células, retire el medio y lave las células con al menos 10 mililitros de PBS suplementado con cicloheximida. A continuación, aspire el medio y reemplácelo con 100 microlitros de tampón de lisis de células de mamíferos por cada 10 millones de células.

Tritura la mezcla para lisar las células con una aguja de calibre 20 a 25. A continuación, transfiera el lisado celular a un tubo preenfriado de 1,50 mililitros e incube el lisado en hielo durante 10 minutos con inversiones periódicas. Después de 10 minutos, centrifuga el lisado y transfiere el sobrenadante a un tubo frío de 1,5 mililitros.

A continuación, prepare una dilución de uno a 10 del lisado en agua libre de nucleasas y mida la absorbancia a 260 nanómetros. A continuación, cree alícuotas de 200 microlitros del lisado sin diluir y trate cada una con 7,5 unidades de nucleasa por cada unidad de absorbancia. Deje que la nucleasa reaccione durante 45 minutos y luego finalice la reacción usando 15 microlitros de inhibidor de RNasa, o almacene a 80 grados centígrados negativos.

A continuación, purifique el ARN RPF utilizando un kit comercial, y siga con una depleción de ARNr, también utilizando un kit. A continuación, realice una purificación de PAGE en 500 nanogramos de ARN RPF aislado. Después de preparar las muestras para cargarlas en el gel, desnaturalizarlas, este último y los controles, con una incubación de cinco minutos a 95 grados centígrados.

A continuación, ejecute las muestras a 180 voltios durante unos 75 minutos y evalúe los resultados. Para la recolección de rebanadas de gel, haz agujeros en el fondo de un tubo de 0,5 mililitros con una aguja estéril de calibre 20. A continuación, extirpe las rodajas de gel correspondientes a la región de nucleótidos de base 28 a 30 y transfiéralas a los tubos de 0,5 mililitros preparados.

Incluya una muestra del control de ARN y una muestra del control negativo para verificar si hay contaminación. A continuación, cargue los tubos de muestra pequeños y tapados en tubos de microcentrífuga más grandes. A continuación, centrifuga los conjuntos para triturar el gel y transfiere la muestra al tubo de 1,5 mililitros.

A continuación, agregue agua, acetato de amonio y SDS a los tubos de muestra para eluir el ARN en una reacción nocturna a cuatro grados centígrados. A continuación, utilice un kit comercial para crear una biblioteca de ADNc a partir del ARN pequeño y proceda a secuenciar la biblioteca de ADNc. ChIP-seq se utiliza para mapear la unión de un factor de transcripción de interés a lo largo de un genoma.

Combinado con los datos del perfil de ribosomas y el estudio de todas las nuevas transcripciones, ChIP-seq revela el impacto real de la unión del factor de transcripción. Para comenzar, reticular las muestras de células usando formaldehído hasta una concentración final de 1%Después de 10 minutos a temperatura ambiente con un balanceo suave, detenga la reacción elevando la concentración de glicina a 0,125 molar. Luego, recoja las células y lávelas tres veces con PBS helado, y congele la pastilla de celda a menos 80 grados centígrados.

Más tarde, vuelva a suspender el gránulo celular en un mililitro de tampón de lisis celular helado con inhibidores de la proteasa recién añadidos e incube las células en hielo durante 10 minutos. Después de 10 minutos, centrifugar las células, aspirar el sobrenadante y repetir la adición e incubación del tampón de lisis. A continuación, utilice la sonicación para generar cromatina cortada entre 200 y 1.000 pares de bases.

A continuación, acople la cromatina a perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos y eluya los complejos proteína-ADN en 50 microlitros de tampón de elución. A continuación, agregue los cinco microlitros de 40% de RNasa y tampón de elución, e incube la muestra durante 30 minutos. A continuación, se añade una unidad de proteinasa K y 20 microgramos de glucógeno a la muestra, y se incuba durante dos horas.

A continuación, mueva la muestra a 65 grados centígrados durante la noche para revertir la reticulación. Al día siguiente, coloque la muestra contra el imán durante al menos 30 segundos y luego recoja el sobrenadante, que contiene el ADN de interés. A continuación, purifique el ADN, utilice la PCR cuantitativa para la verificación y secuencie el ADN.

El marcado 4sU puede estresar las células y provocar apoptosis. Se utilizó la tinción con anexina V y 7-AAD para identificar células apoptóticas y muertas. Después de marcar las células Th1 con 4sU mediante tratamientos de 30 o 60 minutos, las células no murieron ni sufrieron apoptosis.

La integridad del ARN siempre se comprobó antes de la secuenciación mediante un ensayo estándar, ya que esto es de gran importancia cuando se procesa el ARN. Las bibliotecas amplificadas tenían una gama saludable de nucleótidos. El exceso de dímeros adaptadores necesitó una mayor purificación por parte de PAGE.

Demasiada plantilla o demasiados ciclos da como resultado nucleótidos pesados, productos manchados y productos de dímeros adaptadores Se encontró que el cizallamiento de la cromatina funcionaba mejor cuando la fracción principal de la cromatina cortada era de alrededor de 1,000 pares de bases o un poco menos. Se utilizó PCR cuantitativa para probar la aplicabilidad del anticuerpo a la secuenciación de la inmunoprecipitación de cromatina. Los cebadores de control negativo son para genes que no se expresan en las células de interés.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar hacer un plan detallado de la configuración experimental, incluido un cronograma de cuándo agregar 4sU y cuándo cosechar las células para cada método. Verifique siempre las condiciones óptimas de etiquetado de 4sU probando por adelantado el impacto de 4sU en la viabilidad de la célula y la respuesta al estrés. En resumen, este enfoque nos permite visualizar todos los eventos de regulación génica que podrían ocurrir durante un proceso de activación celular.

Este método también podría utilizarse para las células inmunitarias primarias y su respuesta a un estímulo o a un fármaco.