Name: Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Aprenda a analizar la unión de factores de transcripción, la transcripción y la traducción en células activadas usando ChIP-seq, 4sU-seq y ribosome profiling. Este método integrado revela los mecanismos moleculares de la regulación génica en tiempo real.

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Damos las gracias a Lars Dölken Consejo establecer 4sU etiquetado para las células T primarias; Elisabeth Graf y Thomas Schwarzmayr ayuda crítica en las generaciones de la biblioteca y la secuencia; Dirk Eick y Andrew Flatley para proporcionar los anticuerpos RNAPII y la célula de T; N. Henriette Uhlenhaut y Franziska Greulich para ayuda en la preparación de la biblioteca de ChIP-seq; Caroline C. Friedel fue apoyado por becas de FR2938/7-1 y CRC 1123 (Z2) de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher fue apoyado por la beca GL 870/1-1 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) y del centro alemán de investigación de Diabetes (DZD), Helmholtz Zentrum München.

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Analizar todo el proceso de regulación génica es necesario comprender las adaptaciones celulares en respuesta a un estímulo específico o tratamiento. La combinación total de RNA-seq, 4sU-seq, ribosome profiling y ChIP-seq en diferentes puntos temporales conduce a un análisis exhaustivo de los principales procesos de regulación génica en el tiempo. Un profundo entendimiento de los procesos biológicos es necesaria para definir la configuración experimental así como los puntos de tiempo óptimo.
Ya que los métodos para el estudio de regulación génica mejoran rápidamente, estos protocolos puede adaptarse a los cambios rápidos. Sin embargo, proporcionan los medios más importantes para el estudio de mecanismos de regulación genética básica en cualquier tipo de célula. Aquí, discutimos algunos de los escollos y hechos que uno tiene que considerar cuando se utilizan estos métodos.
Células: Las células deben ser altamente viables y, si usando las células aisladas primarias, pureza de poblaciones celulares debe garantizarse (por ejemplo, el análisis FACS para las células T primarias). Células un poco estresadas pueden influir en los resultados de estos métodos de secuenciación muy sensibles y disminuir la cantidad de RNA recién transcrito o traducido y conducir a lecturas no deseadas de la respuesta de estrés en los resultados de la secuencia. La velocidad de centrifugación mencionada en este protocolo para que sedimenten las células está optimizada para las células T primarias. Por lo tanto, ajustar la velocidad según el tipo de célula.
4 sU efectos sobre la fisiología de la célula: Además de las opciones mencionadas para verificar la mínima perturbación a la fisiología celular a 4sU además, pueden realizarse análisis más o adicional, especialmente cuando números de celda son limitados. Efectos sobre la proliferación celular pueden ser probados verificando el tiempo de duplicación de células simplemente contando las células etiquetadas y sin etiquetar. Inducción de estrés nucleolares podría probarse también mediante el análisis de la morfología celular mediante tinción de inmunofluorescencia de nucleolin y núcleos. Para verificar más lejos el impacto de 4sU, expresión génica global alterada se podía medir correlacionando leer cuentas de etiquetado ARN ARN total sin etiqueta.
Números de celular: En vitro generados por las células T, se recomienda a partir de por lo menos la cantidad de las células indicadas en la tabla 2. Elegir números apropiados por método según el tipo de células. Puesto que las células T tienen menos citoplasma y el ARN en comparación con otras células, probablemente menos cantidad de otras células será suficiente. Para ChIP-seq, número de células altamente depende el anticuerpo utilizado y el nivel de expresión de la proteína de interés dentro de las células. Para histonas o ChIP RNAPII, pueden utilizarse células particulariz, mientras que el número de células necesita incrementarse cuando se utilizan factores de transcripción, sobre todo si se expresan en niveles bajos.
4 sU etiquetado y RNA Biotinilación: Cuando se utilizan células adherentes, 4sU etiquetado puede dirigir según lo descrito por Rädle et al. 19 desde 4sU incorporan muy rápidamente de las células, puede ser agregado directamente al medio de suspensión, adherente o células semi-adherentes.
Se recomienda comenzar la Biotinilación con 60-80 μg de ARN. Sin embargo, se puede utilizar menos cantidad de RNA, aunque no probamos por menos de 30 μg. Añadir un coprecipitant (e.g., GlycoBlue) cuando precipitando RNA si el precipitado es difícil de ver. Duffy et al también han demostrado que biotina activa methylthiosulfonate (MTS-biotina) reacciona más eficientemente con ARN marcados con 4sU que HPDP-biotina31. Por lo tanto, cabe considerar cambiar a MTS-biotina, en particular, para la recuperación de ARNs pequeños, que tienden a tener menos residuos de uridina (véase el protocolo de Biotinilación mencionado por sede de Duffy et al.; purificación del ARN marcado con 4sU, Procedimientos experimentales).
Para la recuperación del ARN recién transcrito, es posible utilizar granos paramagnéticos o granos de ARN limpieza de su elección. Siempre tener en cuenta que estos kits pueden o no pueden purificar para RNAs específicos. Por ejemplo, si usted está interesado en miRNAs, considere el uso de kits específicos para la secuencia y la captura de miRNA.
Cuantificación de RNA recién transcrito: Para cuantificar con precisión el RNA recién transcrito, la medición debe ser realizada por un fluorómetro adecuado (véase Tabla de materiales). Dentro de 1 h de exposición 4sU, RNA recién transcrito representa alrededor del 1-4% del ARN total. RNA recién transcrito de 1 h con la etiqueta, las células T activadas consiste en ~ 90-94% de ARNr11.
Ribosome Profiling: Cuando se establezca el método, se determinó que utilizando 1.5 x la cantidad de nucleasa que sugerido en el protocolo original garantiza una digestión apropiada. También, efectos adversos no se han divulgado para cantidades elevadas de nucleasa. Ya que es muy difícil de overdigest la PRSA mientras que forman parte del RNA por proteínas ribosomales, todavía un poco puede aumentar la cantidad para valorar la digestión óptima nucleasa.
Si es inferior a 500 ng de RNA del FPR fueron recuperados en paso 4.4.2, repita el agotamiento de los rRNA y piscina purificaron PRSA con ARN Clean & concentrador de 5 columnas. Por otra parte, carga de dos muestras idénticas al lado uno al otro en gel (paso 4.5.3) y láminas de gel de piscina durante la elución de RNA del gel (paso 4.5.6).
Se recomienda cortar la PRSA sobre un gel tan ajustadamente como sea posible a las bandas de nt 28 y 30. Esto ayuda a eliminar fragmentos no deseados de rRNAs y tRNAs, que más tarde se convertirá en parte de su biblioteca y reducir lee la secuencia de la PRSA.
También es aconsejable evitar la luz durante la purificación del gel UV. Esto puede crear muescas en los fragmentos de ARN, como dímeros de pirimidina, que al final pueden afectar seriamente la preparación de la biblioteca y los resultados de secuenciación.
Preparación de la biblioteca y la secuencia de datos: Ribosoma perfiles de protocolo permite para generar una biblioteca de cDNA adecuada para secuenciación. Las muestras generadas por 4sU etiquetado pueden ser utilizadas directamente para la preparación de la biblioteca con cualquier kit de secuenciación apropiada de RNA. Desde el RNA recién transcrito, especialmente cuando uso corto etiquetado veces, puede no ser aún cofia, ninguna selección de poly-A debe ser realizada. En su lugar, recomendamos agotamiento del rRNA para evitar reducir la profundidad de la secuencia de la muestra real. Usando las células de T, comenzamos con 400 ng de ARN recién transcrito y total (según el kit, ver materiales), realiza rRNA agotamiento y reduce los ciclos para la amplificación de la polimerización en cadena minimizar el sesgo de la polimerización en cadena. Preparación de la biblioteca puede realizarse con menos material de partida. Para tener en cuenta números de complejidad biblioteca de ciclos PCR debe ser optimizado.
Para ChIP-seq también hay muchos kits disponibles para la preparación de la biblioteca. En nuestra biblioteca de manos preparación trabajó bien a partir de 2 ng de DNA ChIP (ver materiales para una sugerencia sobre que kit a utilizar). Asegúrese de comprobar los índices de balance de color durante la secuencia. Se recomienda la secuencia de profundidad ≥ 40 x 106 Lee cada 4sU-seq, total RNA-seq, y muestras de ChIP-seq y ≥ 80 x 106 lecturas para perfiles muestras del ribosoma. La profundidad de la secuencia depende de la muestra y el análisis de aguas abajo de la Bioinformática y se debe considerar cuidadosamente. Analizar lecturas intronic de empalme cotranscriptional, 100 secuenciación del extremo apareado bp debe ser elegido.
Sesgo de secuencia: La secuencia se ha convertido en el estándar de oro para determinar cambios globales en la transcripción, traducción o atascamiento del factor de transcripción. Dentro de estos últimos años, los métodos existentes fueron empujados hasta sus límites o fueron desarrollando nuevas técnicas para secuenciar cada vez más pequeñas cantidades a partir de ARN. Esto requiere la amplificación del cDNA, que introduce ruido o sesgo. Recientemente, identificadores únicos moleculares (UMIs) fueron desarrollados para identificar experimentalmente duplicados introducidos por PCR. Recientemente, fue demostrado que UMIs sólo levemente mejoran el poder de la secuenciación y tarifa falsa del descubrimiento de expresión génica diferencial32. Sin embargo, considerar el uso de identificadores únicos de moleculares (UMIs) para todas las bibliotecas de la secuencia de control para la complejidad de la biblioteca, especialmente cuando a partir de pequeñas cantidades de ARN y se necesitan muchos ciclos PCR.
De buffer y soluciones: Todos los búferes para 4sU-seq y perfiles de ribosoma deben ser preparados bajo estrictas condiciones libre de ARNasa, con agua libre de nucleasa. Se recomienda comprar prefabricada NaCl libre de nucleasa, Tris-HCl, EDTA, citrato de sodio y agua. Para asegurar condiciones libres de nucleasas, una solución descontaminante de Rnasa se puede utilizar para limpiar pipetas o superficies. Todos los búferes para ChIP-seq deben ser menos libres de DNasa y puede almacenarse a temperatura ambiente. Siempre añadir inhibidores de la proteasa y, opcionalmente, los inhibidores de la fosfatasa justo antes de usar y mantener en hielo.
Bioinformática: Análisis de los datos de la secuencia (es decir, ChIP-seq, RNA-seq y ribsosome perfiles) implica el control de calidad (p. ej., con FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), ajuste del adaptador (por ejemplo, con cutadapt20) seguido de asignación para el genoma de referencia de las células bajo estudio. Para datos de RNA-seq (total y 4sU-seq), así como perfiles de datos del ribosoma, un asignador de RNA-seq empalmado se requiere, como ContextMap 221. Para alineaciones de datos unspliced ChIP-seq, usando BWA-MEM22 es suficiente. Expresión génica puede ser calculada usando el RPKM modelo (lecturas por Kilobase de exón por millón fragmentos asignados)1, después de determinar leer cuentas por gene usando un programa, por ejemplo, featureCounts23. Para llamar de pico desde datos de ChIP-seq, un número de programas está disponible, por ejemplo, Mac24 o GEM25. Más análisis descendentes pueden realizarse en R26, en particular mediante herramientas proporcionadas por el proyecto de Bioconductor27.
Aquí, un reto importante en la integración de niveles de ARN 4sU y total y actividad traslacional de ribosome profiling es normalización. Un enfoque clásico para resolver este problema es normalizar niveles de genes de mantenimiento de la casa. Para reducir el ruido debido a las fluctuaciones al azar de los genes individuales de mantenimiento de la casa, se recomienda usar no sólo unos cuantos genes de mantenimiento de la casa pero niveles mediana para un conjunto más amplio, por ejemplo la > 3.000 genes de mantenimiento elaborados por Eisenberg y Levanon28 . Para el cálculo de las tasas de facturación RNA de ratios de 4sU-de que ARN total, normalización se basa en volumen de ventas promedio de precios (por ejemplo, suponiendo un período de RNA de 5 h)29. Sin embargo, puesto que esto no supone ningún cambio general para genes de mantenimiento de la casa, se recomienda utilizar enfoques de análisis independiente de la normalización, por ejemplo, la agrupación de una serie de tiempo de los diferentes tipos de datos para identificar grupos de genes basados en correlación con un comportamiento distinto en la transcripción y traducción durante la activación. Para una descripción detallada sobre la bioinformatical integración de los diferentes tipos de datos, nos referimos a la publicación original11.
Análisis de la integración de tarifas y datos de facturación: Un trabajo recientemente publicado33 determinado por un control de gene multiplexados (MGC) de vida media en comparación con métodos globales podría demostrar que vida media correlaciona mejor con los obtenidos por métodos de etiquetado metabólicos en comparación con otros métodos (p. ej., inhibición general de la transcripción por las drogas). Sin embargo, cabe mencionar que las diferencias entre los cálculos de Half-Life pueden surgir y han descrito 15,34. Responsables de la mayoría de los problemas y diferencias que son introducidas por la respuesta de estrés debido a la exposición prolongada 4sU. Por lo tanto, es indispensable excluir la respuesta de estrés presentada por etiquetado 4sU. Para validar aún más tasas de rotación, se recomienda el uso de MGCs.
Además, un conjunto de datos generado aquí podría emplearse para un análisis (p. ej., Reglamento de ARN largo no codificante) datos más integrante35,36.

En los últimos años, la secuenciación del RNA (RNA-seq) se ha convertido en la herramienta estándar para analizar todo expresado ARN dentro de una célula o un organismo1. Sin embargo, para entender todo el proceso de las células en respuesta a una estímulo específica y las drogas, es necesario determinar completamente todos los procesos subyacentes, desde la transcripción de mRNA a procesamiento, rotación y traducción. Cambios a corto plazo en la transcripción del RNA no pueden medirse por RNAseq total, ya que cambios de ARN total dependen de factores por ejemplo RNA vida media y actividad transcripcional, que son una plantilla pobre para reflejar la adaptación de las células efectos ambientales2,3. De hecho, han desarrollado una variedad de nuevas técnicas de secuenciación que permiten un análisis de los diferentes pasos en el proceso de gene Reglamento4 cuando se combinan en la forma correcta. Este protocolo describe cómo combinar algunas técnicas de secuenciación más fácilmente aplicables que permitan el seguimiento de la regulación de las capas esenciales de mRNA de manera comparativa. Para el análisis de actividad transcripcional, se han descrito una variedad de métodos, como el análisis de la tapa de gene expresión (jaula)5, alargamiento natural transcripción secuencia (NET-seq)6y genoma nuclear precisado (GRO-seq)7 , 8, así como secuenciación del bromouridine (Bru-seq) y 4-thiouridine-secuenciación (4sU-seq), que utilizan metabolitos que se incorporan en recién transcripción RNA9,10, sólo por mencionar algunos. Mientras jaula identifica el sitio de inicio de transcripción exacta, red-seq y GRO-seq entregan información más precisa acerca de las direcciones de lectura y 4sU-seq (que es el método descrito aquí) detecta sólo recién transcrito RNA. Sin embargo, 4sU seq es muy sensible y puede ser aplicado en diferentes marcos de tiempo para medir la actividad transcripcional cuantitativa en activamente cambiando las células, así como cambios cuantitativos en el procesamiento del mRNA (que ocurre dentro de minutos)9, 11,12. Además, es ideal para combinar con RNA-seq para calcular tasas de rotación de RNA genes94sU-seq. La transcripción del mRNA se lleva a cabo por ARN polimerasa II (RNAPII), que a su vez está influenciada por una multitud de factores, tales como factores de transcripción, modificaciones de las histonas y general activadores/represores que puede incluso ser parte del transcripcional complejo. Para comprobar cuántas regiones de potenciador de promotor de genes están vinculadas por un factor, se ha desarrollado ChIP-seq, que ahora es el método estándar para este propósito, debido a muchos anticuerpos comercialmente disponibles13. Sin embargo, aunque ChIPseq da información clara sobre donde regula factores de atar, no refleja si en efecto conduce a cambios en la transcripción14. Por lo tanto, realizar ChIP-seq con 4sU seq es la combinación ideal para este tipo de preguntas biológica. Regulación de la expresión génica puede también ocurrir en una etapa posterior, ya que los niveles de mRNA y proteína no necesariamente se correlacionan15,16, indicando potencialmente significativo regulación traduccional o poste-de translación nivel, dependiendo del contexto. En el año 2011, ribosome profiling había sido primero combinado con RNA-seq y ahora es el método de elección para cuantificar los cambios que se producen rápidamente en la proteína, puesto que todavía hay algunos límites de sensibilidad con espectrometría de masa17. De hecho, las tasas de traducción obtenidas de tales métodos han demostrado entregar una relativamente buena estimación de cambios en los niveles de proteína (menos medidos para cambios a largo plazo) y permite una visión más detallada sobre el proceso de traducción, por ejemplo, la determinación de traducción alternativa y el inicio Marcos17. El uso de la combinatorio de los cuatro métodos puede utilizarse en estado estacionario, entre los diversos tipos de células, o en una serie de tiempo el experimento de un cambiante celda11. Este uso proporciona un resumen de todo el genoma de los cambios en el atascamiento del factor de transcripción que influyen en la transcripción de ARN, procesamiento y traducción.

<table><tbody><tr><td><Marcaje>4sU-fuerte<></td><td></td><td></td><td></td>/</tr><tr><td>4-tiouridina fuerte (100 mg)</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>Prepare 50 mM de caldo en H2O/PBS estéril; almacene en &ndash; 20&deg; C en alícuotas de 50-500 y micro; l; No vuelva a congelar.</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml con cierre de seguridad</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno con tapa de rosca de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>72692005 Compatible con Dimetilformamida</td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatible con Dimetilformamida</td></tr><tr><td>2,0 ml Tubos de polipropileno con tapa de rosca</td><td>Sarstedt 72694005</td><td></td><td>Compatible con Dimetilformamida</td></tr><tr><td>50 ml tubos</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatible con Dimetilformamida</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>Recomendamos utilizar estas perlas paramagnéticas. Alícuota y tienda a 4&deg; C</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma Aldirch</td><td>372978</td><td>ADVERTENCIA &ndash; PELIGROSO PARA LA SALUD</td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotrietol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>Preparado como 100 mM de DTT en H2O libre de nucleasas; preparar siempre fresco</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg)</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Prepare 1 mg/ml de solución madre disolviendo 50 mg de Biotina-HPDP en 50 ml de DMF. Un calentamiento suave mejora la solubilización. Tienda en 4&deg; C en alícuotas de 1 ml. El DMF disuelve algunos materiales plásticos. Recomendamos utilizar pipetas de vidrio para transferir DMF de la botella de vidrio en stock a tubos Falcon de 50 ml.</td></tr><tr><td>Kit de ADN de alta sensibilidad</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>Solución madre</td></tr><tr><td>sin nucleasa EDTA (500 mM ), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Solución madre</td></tr><tr><td>Sin nucleasa H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td>Solución madre</td></tr><tr><td>sin nucleasa Tris Cl (1M), pH 7,4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Solución madre</td></tr><tr><td>Gel Phase Lock Tubos pesados (2,0 ml)</td><td>5Prime</td><td>2302830</td><td>Utilizar en el paso 1.3.4.</td></tr><tr><td>Polipropileno 15&nbsp; ml tubos de centrífuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>O equivalente; tienen que tolerar hasta 15.000 & veces; g Reactivo</td></tr> de <tr><td>lisis QIAzol (200 ml)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Utilice este reactivo TRI o equivalente para el aislamiento de ARN, ADVERTENCIA &ndash; ¡CORROSIVO Y PELIGROSO PARA LA SALUD! Garantice el acceso inmediato al antídoto de fenol (PEG-metanol)</td></tr><tr><td>Qubit RNA kit de ensayo HS</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td><td>Utilice este kit para cuantificar la cantidad de ARN en el paso 1.4.11</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Opcional; incluye Tampón RLT</td></tr><tr><td>Citratos de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>Prepare una solución madre de 1,6 M con agua sin nucleasas</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr> <tr><td>y micro; Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Tienda en 4&deg; C, incluye &micro; Columnas de Mac utilizadas en el paso 1.4.6. (tienda en RT)</td></tr><tr><td><Ensayo > de viabilidad celular y estrés</PE fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Anexina V Kit de detección de apoptosis I</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>p53</td><td>abcam</td><td>ab26</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>p-EIF2a (Ser51)</td><td>Señalización celular</td><td>9721</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>Opcional</td></tr><tr><td><tampones > lavado fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 sU</td><td></td><td>Almacenamiento en RT</td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Ténder 20 en H2O sin nucleasas</td></tr><tr><td>Tampón de biotinilación (10x)</td><td></td><td>almacenar a 4 & grados; C</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA en agua libre de nucleasas; haga alícuotas de 1 ml; almacene a 4 grados; Almacenamiento</td></tr><tr><td>tampón de precipitación de ARN</td><td>C a RT</td> 1,2 M de NaCl, 0,8 M de citrato de sodio en agua libre de nucleasa.<td></td><td> Prepárese con anticipación en condiciones libres de nucleasas. Almacenar a temperatura ambiente en tubos falcon de 50 ml.</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Instrumento bioanalizador</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Utilice este kit para verificar la integridad del ARN en el paso 1.3.10</td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV/VIS</td> opcional <td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>O equivalente. Uso en el paso 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidad</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>O equipo equivalente capaz de alcanzar 13.000&nbsp; y tiempos; &nbsp; g</td></tr><tr><td>Rotor de alta velocidad</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>Adaptadores para tubos de</td><td></td><td></td><td></td>15 ml</tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>O equivalente.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td>O equivalente.</td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>Un soporte tiene capacidad para 8 &micro; Columnas de Macs.</td></tr><tr><td>Escala ultrafina</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML204T</td><td>o equivalente.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>Para geles de ARN; o equivalente.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% geles prefabricados de agarosa</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>Para geles de ARN; o equivalente.</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet-1 cada uno</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Kit de</td></tr><tr><td>preparación de biblioteca de ARN total trenzado TruSeq</td> opcional <td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>O equivalente. Para los linfocitos T se utilizaron 400 ng 4sU y ARN total con 11 ciclos para la amplificación por PCR. La depleción de ARNr está incluida en este kit</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>utiliza un Nanodrop o un instrumento equivalente para medir la concentración</td></tr> <tr><td>de ARN<fuerte>Perfil de ribosoma</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (mamífero o levadura)</td><td>Illumina</td><td>RPYSC12116 (levadura)</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (mamífero o levadura)</td><td>Illumina</td><td>RPHMR12126 (Mamífero)</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin S-400 HR Columnas</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Kit concentrador-25</td><td>Zymo Research</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Kit concentrador-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero Gold Kit de eliminación de ARNr (humano/ratón/rata)</td><td>Illumina</td><td>MRZG126 o MRZG12324</td><td></td></tr><tr><td>(kit de ADN de alta sensibilidad)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Ya se necesita para 4sU-seq</td></tr><tr><td>Todos los demás consumibles y equipos se enumeran en la guía del usuario</td><td>!!</td><td></td><td>Lea atentamente la guía del usuario y pida los consumibles necesarios con antelación (tenga en cuenta un plazo de entrega largo para algunos consumibles, por ejemplo, geles)</td></tr><tr><td>ChIP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>proveedor de laboratorio</td><td></td><td></td>gereral</tr><tr><td>100 bp Plus Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0323</td><td></td></tr><tr><td>16 % Formaldehído</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Añadir a una concentración final de 1 %</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>proveedor de laboratorio gereral Prepare</td><td></td><td>siempre fresco</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>proveedor</td><td></td><td></td>de laboratorio gereral</tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP perlas</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>Recomendamos utilizar estas perlas paramagnéticas. Alícuota y tienda a 4&deg; C</td></tr><tr><td>Kit de preparación de la biblioteca ChIP</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK8504</td><td>O utilice el kit de su elección</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de ADN de baja unión</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td>Utilice estas perlas superparamagnéticas acopladas a la proteína G en el paso 4.3.1.; Llevar a RT antes de usar</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>proveedor de laboratorio</td><td></td> gereral <td>Prepare una solución madre 2M</td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>Roche</td><td>10-901-393-001</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Utilice este kit (o equivalente) para purificar la cromatina en el paso 4.2.4.</td></tr><tr><td>Inhibidor de la fosfatasa (PhosStop)</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>Añadir recién hecho al tampón y mantener en hielo</td></tr><tr><td>Power SYBRgreen Master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa (completo, sin EDTA)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Añadir recién hecho al tampón y mantener en hielo</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Utilice este kit para cuantificar la cantidad de ADN en el paso 4.6.4. en un fluorímetro Qubit</td></tr><tr><td>Rnasa, libre de DNasa</td><td>Roche</td><td>11-119915001</td><td></td></tr><tr><td>Esperma de salmón (sonicado a alrededor de 100 pb)</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8.0</td><td>proveedor de laboratorio</td><td></td><td></td> gereral</tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos (grado ChIP si es posible)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-ARN Pol II [8WG16]</td><td>abcam</td><td>ab817</td><td></td></tr><tr><td>anti-Histon H3K36me3</td><td>abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>o anticuerpo de interés</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><tampones > fuertes</tampón</td> > <td></td><td></td><td>unión</td></tr><tr><td>/bloqueo</td><td>Almacene en RT</td><td>PBS con 0,5 % de BSA y 0,5 % de tampón</td>de lisis celular Tween 20 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Almacene en tuberías RT</td><td>5 mM [pH 8.0], 85 mM KCl y tampón</td></tr><tr><td></td><td>NP40 ChIP</td> al 0.5 % <td>Almacene en RT</td><td>0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100; 1.2&nbsp; mM EDTA; 16.7 y nbsp; mM Tris-HCl, pH 8,1; 16.7 y nbsp; tampón</td></tr><tr><td></td> de<td>elución</td> de NaCl <td>mM Almacene en RT hasta 6 meses</td><td>10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM de EDTA (pH 8,0), 300 mM de NaCl y 0,5 % de SDS</td></tr><tr><td>Tampón de nuclei-lisis</td><td>Almacene en RT</td><td>50 mM de Tris [pH 8,0], 10 mM de EDTA y 1 % de SDS</td>Tampón de lavado I Almacene en RT 0,1 % de SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM de EDTA; 20 mM de Tris-HCL pH 8,1; 150 mM de NaCl Tampón de lavado II Almacene en RT <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>0,1 % de desviación de gasto; 1 % Tritón X-100; 2&nbsp; mM EDTA; 20&nbsp; mM Tris-HCL pH 8,1; 500&nbsp; mM NaCl</td></tr><tr><td>Tampón de lavado III</td><td></td><td>Almacenar a RT</td><td>0.25&nbsp; M LiCl; 1% NP-40; 1&nbsp; mM EDTA; 10&nbsp; mM Tris-HCl, pH 8,1</td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Instrumento bioanalizador</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>utilizar este instrumento para el análisis electroforético</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor TBX microtubos 1,5 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010</td><td></td></tr><tr><td>o tubos especiales para su dispositivo de sonicación</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de sonicación Bioruptor o dispositivo de sonicación de su elección</td><td></td><td></td><td>Sonicación de células T con Bioruptor: 20 - 25 ciclos (30 s encendido, 30 s apagado a alta en dos microtubos bioruptor de 1,5 ml con 500 &micro; l cada tubo)</td></tr><tr><td>Soporte magnético para tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroforesis</td><td></td><td></td><td></td>en gel de agarosa</tr><tr><td>Qubit Fluorímetro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Utilice este fluorímetro para cuantificar cantidades bajas de ARN/ADN</td></tr></tbody></table>

análisis en tiempo real del factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Después de la activación, las células cambian rápidamente sus programas funcionales y, por tanto, su perfil de expresión génica. Ocurren grandes cambios en la expresión génica, por ejemplo, durante la diferenciación celular, morfogénesis y estimulación funcional (por ejemplo, la activación de células inmunes), o después de la exposición a las drogas y otros factores del entorno local. Dependiendo del tipo de estímulo y de la célula, estos cambios ocurren rápidamente y en cualquier nivel de regulación génica. Mostrando todos los procesos moleculares de una célula responde a un determinado tipo de estímulo y las drogas es una de las tareas más difíciles en biología molecular. Aquí, describimos un protocolo que permite el análisis simultáneo de múltiples capas de regulación génica. Comparar, en particular, factor de transcripción vinculante (cromatina-inmunoprecipitación-secuenciación (ChIP-seq)), transcripción de novo (4-thiouridine-secuenciación (4sU-seq)), procesamiento de mRNA y facturación, así como traducción (ribosoma profiling). Mediante la combinación de estos métodos, es posible visualizar un plan de acción detallado y genoma.
Secuencia de RNA recién transcrito es especialmente recomendada cuando se analizan rápidamente adaptar o cambiar sistemas, ya que esto representa la actividad transcripcional de los genes durante el tiempo de exposición 4sU (independientemente de si son para arriba - u o). La combinatoria total RNA-seq y perfiles de ribosoma además permite el cálculo de las tasas de rotación y traducción de RNA. Análisis Bioinformático de los resultados de secuenciación de alto rendimiento permite muchos medios para el análisis e interpretación de los datos. Los datos generados también permite seguimiento co-transcriptional y alternativa de empalme, por citar algunos resultados posibles.
El enfoque combinado descrito aquí puede ser aplicado para organismos diferentes modelos o tipos de células, incluyendo células primarias. Además, ofrecemos protocolos detallados para cada método utilizado, incluyendo controles de calidad y discutir posibles problemas y dificultades.

4 sU etiquetado: verificar óptimo 4 las condiciones de sU etiquetado (apoptosis, tensión nuclear, citoplasmático estrés), el tiempo y la concentración: 4sU elevada puede inhibir la producción y procesamiento del rRNA e inducen citoplásmicos como nucleares estrés30. Por lo tanto, las células de interés deben analizarse para 4sU inducida por estrés, así como apoptosis. Se recomiendan análisis de Western blot para la visualización de la acumulación de p53, que indica la tensión nuclear, aumentando los niveles de EIF2a fosfo que muestran tensión citoplasmática y celular activado por fluorescencia clasificación análisis (FACS) de apoptosis. Altos niveles y la larga exposición a 4sU o drogas como thapsigargin o arsenito se pueden utilizar para inducir estrés celular. Para inducir la apoptosis, muerte celular, las células fueron tratadas con BH3I-1 (500 ng/μL) o incubados por 5 min a 95 ° C (choque térmico). Anexina V/7-AAD tinción se utilizó para determinar apoptosis (anexina V) y las células muertos (7-AAD). Etiquetado de in vitro generados por las células Th1 primarias durante 0,5 h con 500 μm 4sU (concentración final) apoptosis (figura 1) sino provocar suficiente 4sU Constitución ni 1 h con 200 μm 4sU ni induce señales de estrés celular.
RNA etiquetado tiempo también puede ser acortado (≤5 min) que conduce a un aumento de breve duración intronic secuencias veces Etiquetadoras comparados más de largo. Para visualizar las tasas co-transcriptional de empalmes, etiquetado 4sU veces no deben exceder de 30 minutos. Para más detalles sobre 4sUlabeling, consulte Rädle et al. 19
Control de calidad: Integridad del RNA es de gran importancia cuando se procesa el RNA. Es más conveniente para comprobar la calidad del RNA del RNA marcado con 4sU después de Biotinilación análisis electroforéticos (véase Tabla de materiales). Considerar la verificación de RNA aislado de paso 2.2.2, especialmente cuando se usa para la secuencia de ARN total. Número de integridad del RNA (RIN) debe ser ≥8 para asegurar la integridad del RNA para tratamiento posterior (figura 3).
Análisis electroforéticos pueden utilizarse también para verificar el RNA recién transcrito. Tenga en cuenta que el RNA recién transcrito contiene significativamente menos maduras rRNAs comparado con ARN total con las típicas bandas de rRNA es mucho menos prominente.
Ribosome profiling: amplificación por PCR de la biblioteca de cDNA: amplificación de cDNA (paso 4.9.1) es un paso crítico para asegurar buena secuencia resultados. Analizar las bibliotecas amplificadas por análisis electroforéticos. Una buena muestra de bibliotecas amplificadas muestra un pico alrededor de 140-160 bp (Figura 4A). Cantidades excesivas de adaptador dímeros deben ser evitado (Figura 4B) y las muestras deben ser purificadas más mediante el procedimiento de purificación de página según protocolo del fabricante (purificación de la página de productos de la polimerización en cadena). Pueden ocasionar demasiada plantilla o demasiados ciclos PCR amplificación excesiva caracterizada por la aparición de bandas de peso molecular mayor de lo esperado, untadas de PCR de productos y productos de dímero de adaptador (figura 4). Para la mayoría de las muestras 1-5 μl de cDNA circular y 9 ciclos PCR para la amplificación típicamente producirá cantidades suficientes del correcta del producto de PCR.
ChIP: cromatina de corte: Condiciones de corte óptimas deben ajustarse para cada tipo de célula. Determinar de antemano las condiciones de corte (por ejemplo, el número de ciclos de potencia alta o baja). Utilice el mismo número de células y el mismo volumen para probarlos, ya que una menor densidad celular aumenta la eficacia del corte. Trate de evitar la sobre - o bajo-corte la cromatina. Fragmentos de cromatina grande pueden afectar dramáticamente resultados ChIP por obstrucción y exceso de corte puede destruir epítopes de la proteína de interés, llevando a una menor eficacia vinculante por el anticuerpo. En este experimento, los mejores resultados se obtienen cuando la principal fracción de la cromatina esquilada fue alrededor de 1.000 bp o ligeramente inferior (figura 5A).
Verificación de ChIP por qPCR: Antes de empezar el ChIP, es recomendable comprobar si el anticuerpo utilizado es adecuado para el ChIP (si es posible, utilizar anticuerpos grado de ChIP) de ChIP-qPCR. Verificar el ChIP para la secuenciación por qPCR antes de iniciar la preparación de biblioteca (ver paso 5.6.5). Diseño de cebadores que se unen a un sitio de destino conocido de la proteína de interés. Si el sitio de destino exacto dentro de un gen es desconocido, varios pares de cartilla pueden utilizarse para analizar el gene y elementos reguladores asociados. Para RNAPII ChIP de Th1 células interferón, que es transcripcionalmente alza sobre el estímulo, y cartillas de actina pueden ser utilizados como control positivo. Sox9 e insulina sirven como un control negativo, dado que estos genes no se expresan en células Th1 (figura 5B). Recuerde no utilizar imprimaciones que abarca el exón, que normalmente se utilizan para qPCR de mRNA. También se puede usar un control de IgG para probar la especificidad del anticuerpo usado. Immunoprecipitated ADN puede medirse con un fluorómetro adecuado (véase Tabla de materiales). Cantidades de ADN hibridada por el control de IgG deben ser significativamente inferior comparados con la cantidad de ADN que el anticuerpo de interés.
Replica: prueba de importancia biológica: Es muy recomendable para realizar el experimento cinético para todos los métodos a partir de la misma agrupación de células para las células tengan la misma identidad de las muestras sin tratar y tratadas (figura 2). Sin embargo, se recomienda tomar pequeñas alícuotas de momentos principales de cada método comparar muestras biológica reproduce (por ejemplo, por qPCR, análisis FACS). Esto permite evaluar si el tratamiento para ambas repeticiones fue reproducible y podría continuar con la secuencia. Validación de las repeticiones debe realizarse mediante análisis de bioinformatical. Reproducibilidad de los resultados puede ser evaluada en términos de correlación entre los valores FPKM entre repeticiones y visualizados usando diagramas de dispersión (figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> Figura 1: Verificación de las condiciones óptimas de etiquetado 4sU sin perturbar la fisiología de la célula (figura de Davari, et al. 11) (A) detección de apoptosis de las células por el análisis FACS: In vitro genera Th0 células fueron tratadas con diferentes concentraciones de 4sU (indicado entre paréntesis) de 0.5 h, 1 h y 2 h, respectivamente. Tratamiento de BH3I-1 fue utilizado para inducir apoptosis determinada por anexina V, mientras que el choque del calor (a 5 min a 95 ° C) fue utilizado para inducir la muerte celular determinada por 7-AAD. (B) análisis de Western blot para p53 de 4sU tratados y las células T activadas: las muestras fueron etiquetadas con 200 μm 4sU para el tiempo indicado de la activación, excepto el punto de tiempo de 0.5 h que fue etiquetado con 500 μm 4sU. (C) análisis de Western blot de fosfo-EIF2a y total EIF2a en células Th1 activadas con las mismas condiciones de etiquetado como en (B). Thapsigargin fue utilizado como control positivo. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> Figura 2: Resumen esquemático de una instalación cinética para seguimiento de los cambios del genoma Este esquema muestra la configuración para combinar 4sU-seq, total RNA-seq, Ribosome Profiling y ChIP-seq para estudiar cambios de genoma sobre el tratamiento de la célula. Las células de la piscina y apartar el número de células de control no tratados. Tratar células restantes y para cada punto de método y tiempo. Células de etiqueta sin tratamiento/tratada para 4sU-seq con 4sU como se describe. Puntos del tiempo y las muestras de cada método dependen de la pregunta biológica específica examinada. Tomar muestras para cada punto del tiempo y método y seguir el dedicado parte del protocolo. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> Figura 3: control de calidad de ARN marcado con 4sU Total RNA y biotinilado RNA de las células Th1 activadas se analizaron en un equipo Bioanalyzer. 18S rRNA y 28S rRNA se muestran y número de integridad del RNA (RIN) está dada por el instrumento para determinar la integridad del ARN. RIN debe ser ≥8 para asegurar la integridad del RNA. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> Figura 4: Perfiles de equipo Bioanalyzer de ribosoma perfiles de bibliotecas (A) A buena biblioteca: muestra un pico en el rango de tamaño esperado (140-160 PB) y purificación adicional no es necesario. (B) este ejemplo muestra excesiva adaptador dimer producto amplificado (120 bp) en relación con el producto deseado (bp 140-160). Esta biblioteca requiere más purificación. (C) una muestra demasiado amplificada: picos de peso molecular mayor de lo esperado y borrosos los amplicones PCR son accesibles (indicado por las flechas). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> Figura 5: Tamaño de cromatina óptimo después de la esquila y la verificación de ChIP por qPCR (A) Agarose gel imagen muestra el tamaño óptimo del fragmento de la cromatina esquilado de tres muestras que fueron esquiladas para 25 ciclos en un sonicador y purificado como se describe antes en el protocolo. (B) resultados de la Q-PCR de un ChIP de RNAPII total (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) se representa como un porcentaje de entrada. IFNg y actina cartillas fueron utilizados como un positivo mientras que Sox9 y la insulina son controles negativos (ambos genes no se expresan en las células Th1 activadas). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> Figura 6: Comparación de biológico Replica (figura de Davari et al. 11) Diagrama de dispersión representante comparando valores de expresión (FPKM) entre réplicas de recién transcrito (4sU) RNA 4 h después de la estimulación de las células Th1 activadas. La línea verde indica valores iguales de FPKM y correlación de rango se indica en cada parcela.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Duración de etiquetado (min)</td>
			<td>4sU recomendada concentración (μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 - 30</td>
			<td>500 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>&lt; 10</td>
			<td>500 - 2000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Se recomienda concentraciones de 4sU (de Rädle, et al. 19) El rango de concentraciones recomendadas 4sU está indicado para diferentes tiempos de etiquetado.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Método</td>
			<td>Número de células</td>
			<td>Cantidad de RNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>etiquetado 4sU</td>
			<td>≥ 2 x 107
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ribosome profiling</td>
			<td>≥ 2 x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ChIP-seq</td>
			<td>≥ 2 x 107 - 3 x 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Cantidad necesaria de las células T primarias Cantidad mínima requeridas primarias de células de T para cada método. Cantidades pueden ser menos tratándose de otros tipos de células.

Este protocolo describe el uso combinatorio de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq y perfiles para las líneas celulares y células primarias del ribosoma. Permite el seguimiento de cambios en el factor de transcripción vinculante, novo de transcripción, procesamiento de RNA, rotación y traducción con el tiempo y viendo el curso general de los acontecimientos en las células activadas o cambiantes.

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

El objetivo general de esta configuración experimental es delinear las principales capas de regulación del ARN y el ADN para descubrir los principales mecanismos moleculares que ocurren en respuesta a un estímulo o tratamiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en muchos campos biológicos diferentes, como las respuestas inmunitarias en general, pero también las respuestas moleculares al tratamiento farmacológico. La principal ventaja de esta técnica es que permite mostrar simultáneamente múltiples capas de regulación génica a lo largo del tiempo.Por lo tanto, es importante utilizar el mismo grupo de células para cada método. A grandes rasgos, estos tres protocolos implican manipular primero las celdas de interés en diferentes puntos temporales. Después de cada manipulación, las células se agrupan y se dividen en tres grupos, uno para cada ensayo.Esta sección del video describe el etiquetado y la purificación de las transcripciones producidas más recientemente utilizando el etiquetado 4sU. En última instancia, cada protocolo produce muestras listas para la secuenciación. En primer lugar, busque la concentración de 4sU requerida y el tiempo de incubación necesario para la línea celular de interés.Por ejemplo, 200 micromolares 4sU se utilizan en las células T durante una hora. Separe el grupo de células después del tratamiento en un plato separado para cada método y punto de tiempo. Luego, descongele completamente el número requerido de alícuotas de 4sU y agregue el 4sU directamente al medio celular e incube los cultivos según las indicaciones.A continuación, recoja las células marcadas con 4sU en tubos de polipropileno. Luego, centrifuga las células. Vuelva a suspender el pellet en TRIzol a aproximadamente tres millones de células por mililitro e incube las células en TRIzol a temperatura ambiente durante cinco minutos.Ahora prepare de 30 a 80 microgramos de ARN, o más, utilizando el método de Radle y compañía. A continuación, mezcle la reacción de biotinilación específica del tiol en este orden. Comience con agua libre de nucleasas, luego tampón 10 veces, luego ARN y finalmente biotina-HPDP.A continuación, mezclar con el pipeteo e incubar. Continúe con el paso de limpieza para producir muestras de ARN biotinilado recién transcrito mezclado con ARN preexistente sin marcar. A continuación, caliente las muestras a 65 grados centígrados durante 10 minutos.Luego, colóquelos inmediatamente en hielo. Una vez que cada muestra se enfríe, agregue 100 microlitros de perlas de estreptavidina e incube a temperatura ambiente con rotación durante 15 minutos. Ahora, aísle las perlas decoradas con ARN recién transcrito usando una columna magnética y luego eluya el ARN en 11 microlitros de agua libre de nucleasas para la secuenciación.En esta sección se describe cómo aislar el ARN que se está traduciendo activamente. La secuenciación de estas transcripciones examina el traslatosoma dinámico. Junto con los datos de secuenciación de ARN, este ensayo permite calcular el recambio de ARN y las tasas de traducción.Comience agregando cicloheximida a la suspensión y mezclándola usando inversiones. Después de un minuto a temperatura ambiente, centrifugue las células, retire el medio y lave las células con al menos 10 mililitros de PBS suplementado con cicloheximida. A continuación, aspire el medio y reemplácelo con 100 microlitros de tampón de lisis de células de mamíferos por cada 10 millones de células.Tritura la mezcla para lisar las células con una aguja de calibre 20 a 25. A continuación, transfiera el lisado celular a un tubo preenfriado de 1,50 mililitros e incube el lisado en hielo durante 10 minutos con inversiones periódicas. Después de 10 minutos, centrifuga el lisado y transfiere el sobrenadante a un tubo frío de 1,5 mililitros.A continuación, prepare una dilución de uno a 10 del lisado en agua libre de nucleasas y mida la absorbancia a 260 nanómetros. A continuación, cree alícuotas de 200 microlitros del lisado sin diluir y trate cada una con 7,5 unidades de nucleasa por cada unidad de absorbancia. Deje que la nucleasa reaccione durante 45 minutos y luego finalice la reacción usando 15 microlitros de inhibidor de RNasa, o almacene a 80 grados centígrados negativos.A continuación, purifique el ARN RPF utilizando un kit comercial, y siga con una depleción de ARNr, también utilizando un kit. A continuación, realice una purificación de PAGE en 500 nanogramos de ARN RPF aislado. Después de preparar las muestras para cargarlas en el gel, desnaturalizarlas, este último y los controles, con una incubación de cinco minutos a 95 grados centígrados.A continuación, ejecute las muestras a 180 voltios durante unos 75 minutos y evalúe los resultados. Para la recolección de rebanadas de gel, haz agujeros en el fondo de un tubo de 0,5 mililitros con una aguja estéril de calibre 20. A continuación, extirpe las rodajas de gel correspondientes a la región de nucleótidos de base 28 a 30 y transfiéralas a los tubos de 0,5 mililitros preparados.Incluya una muestra del control de ARN y una muestra del control negativo para verificar si hay contaminación. A continuación, cargue los tubos de muestra pequeños y tapados en tubos de microcentrífuga más grandes. A continuación, centrifuga los conjuntos para triturar el gel y transfiere la muestra al tubo de 1,5 mililitros.A continuación, agregue agua, acetato de amonio y SDS a los tubos de muestra para eluir el ARN en una reacción nocturna a cuatro grados centígrados. A continuación, utilice un kit comercial para crear una biblioteca de ADNc a partir del ARN pequeño y proceda a secuenciar la biblioteca de ADNc. ChIP-seq se utiliza para mapear la unión de un factor de transcripción de interés a lo largo de un genoma.Combinado con los datos del perfil de ribosomas y el estudio de todas las nuevas transcripciones, ChIP-seq revela el impacto real de la unión del factor de transcripción. Para comenzar, reticular las muestras de células usando formaldehído hasta una concentración final de 1%Después de 10 minutos a temperatura ambiente con un balanceo suave, detenga la reacción elevando la concentración de glicina a 0,125 molar. Luego, recoja las células y lávelas tres veces con PBS helado, y congele la pastilla de celda a menos 80 grados centígrados.Más tarde, vuelva a suspender el gránulo celular en un mililitro de tampón de lisis celular helado con inhibidores de la proteasa recién añadidos e incube las células en hielo durante 10 minutos. Después de 10 minutos, centrifugar las células, aspirar el sobrenadante y repetir la adición e incubación del tampón de lisis. A continuación, utilice la sonicación para generar cromatina cortada entre 200 y 1.000 pares de bases.A continuación, acople la cromatina a perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos y eluya los complejos proteína-ADN en 50 microlitros de tampón de elución. A continuación, agregue los cinco microlitros de 40% de RNasa y tampón de elución, e incube la muestra durante 30 minutos. A continuación, se añade una unidad de proteinasa K y 20 microgramos de glucógeno a la muestra, y se incuba durante dos horas.A continuación, mueva la muestra a 65 grados centígrados durante la noche para revertir la reticulación. Al día siguiente, coloque la muestra contra el imán durante al menos 30 segundos y luego recoja el sobrenadante, que contiene el ADN de interés. A continuación, purifique el ADN, utilice la PCR cuantitativa para la verificación y secuencie el ADN.El marcado 4sU puede estresar las células y provocar apoptosis. Se utilizó la tinción con anexina V y 7-AAD para identificar células apoptóticas y muertas. Después de marcar las células Th1 con 4sU mediante tratamientos de 30 o 60 minutos, las células no murieron ni sufrieron apoptosis.La integridad del ARN siempre se comprobó antes de la secuenciación mediante un ensayo estándar, ya que esto es de gran importancia cuando se procesa el ARN. Las bibliotecas amplificadas tenían una gama saludable de nucleótidos. El exceso de dímeros adaptadores necesitó una mayor purificación por parte de PAGE.Demasiada plantilla o demasiados ciclos da como resultado nucleótidos pesados, productos manchados y productos de dímeros adaptadores Se encontró que el cizallamiento de la cromatina funcionaba mejor cuando la fracción principal de la cromatina cortada era de alrededor de 1,000 pares de bases o un poco menos. Se utilizó PCR cuantitativa para probar la aplicabilidad del anticuerpo a la secuenciación de la inmunoprecipitación de cromatina. Los cebadores de control negativo son para genes que no se expresan en las células de interés.Al intentar este procedimiento, es importante recordar hacer un plan detallado de la configuración experimental, incluido un cronograma de cuándo agregar 4sU y cuándo cosechar las células para cada método. Verifique siempre las condiciones óptimas de etiquetado de 4sU probando por adelantado el impacto de 4sU en la viabilidad de la célula y la respuesta al estrés. En resumen, este enfoque nos permite visualizar todos los eventos de regulación génica que podrían ocurrir durante un proceso de activación celular.Este método también podría utilizarse para las células inmunitarias primarias y su respuesta a un estímulo o a un fármaco.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este protocolo describe cómo inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se utiliza para estudiar las alteraciones dinámicas de la plantilla de la cromatina que regulan la transcripción inducida por una vía de transducción de señal.

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas

ARN polimerasa II cinética de transcripción se miden en genes específicos en células vivas. ARNm transcrito a partir del gen de interés están marcados con fluorescencia y el uso de recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP), la vivo en la cinética de la elongación de la transcripción se obtienen.

La medición de la cinética de la transcripción de ARNm en las células vivas solo

Se describe un método de microscopía de fluorescencia, co-translacional de activación por escisión (COTRAC), a la imagen de la producción de moléculas de proteína en células vivas con precisión una sola molécula sin perturbar la funcionalidad de la proteína. Este método se ha utilizado para seguir la dinámica de expresión estocásticos de un factor de transcripción, el λ represor...

Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene<em&gt; En vivo</em&gt; Utilización de la activación cotraduccional por escisión (COTRAC)

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

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En este trabajo proponemos una estrategia para estudiar el efecto de un factor de transcripción de interés en el transcriptoma de microARN utilizando datos disponibles públicamente, recursos computacionales y datos de alto rendimiento de matrices de microARN después de transfectar células con ARN de horquilla pequeña (sh)dirigido a un factor de transcripción de interés.

Descripción de una regulación dependiente de factor de transcripción del transcriptoma MicroARN

La inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética. Sin embargo, el método implica dificultades para obtener fragmentación de cromatina reproducible mediante cizallamiento mecánico. Aquí, proporcionamos un protocolo mejorado para un ensayo ChIP usando digestión enzimática.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

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Monitorización de la dinámica de interacción proteína-ARN in vivo a alta resolución temporal utilizando χCRAC

Los dominios intrínsecamente desordenados son importantes para la función del factor de transcripción de fusión oncogénica. Para dirigirse terapéuticamente a estas proteínas, se requiere una comprensión más detallada de los mecanismos reguladores empleados por estos dominios. Aquí, utilizamos transcriptómica para mapear características estructurales importantes del dominio EWS intrínsecamente desordenado en el sarcoma de Ewing.

Mapeo de las relaciones estructura-función de los factores de transcripción oncogénicos desordenados utilizando el análisis transcriptómico

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Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular (Video) | JoVE Journal

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

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