El establecimiento de un ensayo de colonización pulmonar para la visualización de células tumorales en tejidos pulmonares de la circulación

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metástasis del cáncer sobre el papel de la colonización pulmonar en el logro de la metástasis del cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que las células cancerosas extravasadas tempranas se pueden visualizar en los pulmones durante la metástasis del cáncer. La demostración del procedimiento estará a cargo de Cheng-Han Yang, un estudiante de doctorado de mi laboratorio.

Cuando el cultivo de células tumorales haya alcanzado una confluencia del 70 al 80 por ciento, lave el cultivo dos veces en dos mililitros de PBS estéril por lavado y agregue un mililitro de tripsina-EDTA al 0,5 % a la placa de cultivo. Retire inmediatamente 800 microlitros del sobrenadante y coloque la placa de cultivo a 37 grados centígrados durante 30 a 60 segundos hasta que la mayoría de las células se hayan desprendido de la placa. Agregue un mililitro de medio fresco, complementado con 10% de FBS para detener la reacción y use una pipeta de 1000 microlitros para mezclar vigorosamente la solución celular.

Transfiera la suspensión de una sola celda resultante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y recoja las celdas por centrifugación. A continuación, vuelva a suspender el gránulo de células tumorales en 1,5 mililitros de medio suplementado con 20% de FBS, y gire las células de extremo a extremo durante dos horas, a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, se cuentan las células viables por exclusión de azul de tripano y se recogen por centrifugación.

Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS estéril para una segunda centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de PBS suplementado con 10% de FBS y 20 micro mililitros de CFSE. Después de diez minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad, centrifugar las células y volver a suspender el pellet en cuatro mililitros de medio suplementado con un uno por ciento de FBS para otra centrifugación. Después del último lavado, vuelva a suspender las células a cinco veces diez a la sexta células tumorales por mililitro de medio fresco sin concentración de FBS, y coloque las células en hielo.

A continuación, caliente la cola de un ratón macho C570 Black Six de cuatro a seis semanas de edad durante cinco a diez minutos para dilatar las venas de la cola y use una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26 y medio para mezclar completamente las células hasta lograr una suspensión de una sola célula. Cargue con cuidado la jeringa con 200 microlitros de células y coloque el ratón en un retenedor. A continuación, inyecte todo el volumen de células en la luz de una vena caudal dilatada.

En el momento adecuado después de la inyección, haga una incisión longitudinal en la piel y el tejido subcutáneo desde el abdomen hasta el tórax y abra la cavidad pleural para exponer el corazón y los pulmones. Usando suturas quirúrgicas estériles, ligar las venas cavas superior e inferior para evitar el reflujo de la solución de profusión y usar tijeras para hacer una fisura de dos a cuatro milímetros en el ventrículo izquierdo para facilitar el drenaje de la perfusión de los pulmones. Luego use una jeringa de tres mililitros para inyectar PBS en el ventrículo derecho y use succión continua para extraer la solución drenada hasta que los pulmones cambien de un color rojizo a completamente pálido.

Tenga cuidado de asegurar correctamente la vena cava superior e inferior para una perfusión pulmonar exitosa. Después de extraer los pulmones, coloque los lóbulos en un soporte de pulmón hecho a medida en un plato de seis centímetros y asegure los pulmones en la textura reticulada del soporte. Cubra y humedezca los lóbulos con PBS, y coloque la placa de cultivo en la platina de imágenes de un microscopio confocal.

Seleccione el objetivo 5x y gire la rueda de filtros a NIBA. Usando un láser de 488 nanómetros, excite el CFSE para permitir una visualización clara de las células tumorales marcadas con azul fluorescente dentro de los lóbulos pulmonares. Gire la rueda de filtros a R690 para escanear con una velocidad de escaneo de dos microsegundos por píxel y optimizar la ganancia de alto voltaje y los niveles de compensación.

A continuación, capture cinco imágenes fluorescentes de 12 por cinco píxeles utilizando una velocidad de escaneo de 10 microsegundos por píxel. Utilizando el método de tinción, como se acaba de demostrar, las células tumorales se marcan eficazmente con CFSE de una manera dependiente de la dosis. Con la intensidad de fluorescencia del marcaje, casi alcanzando una meseta en seis veces 10 a la quinta células de carcinoma de pulmón de Lewis por mililitro a la concentración de 20 micromolares.

La perfusión pulmonar antes de la recolección, como se acaba de demostrar, limpia la vasculatura pulmonar de células tumorales circulantes no picadas específicamente antes del análisis por imágenes. La microscopía confocal de fluorescencia revela la presencia de las células tumorales colonizadoras marcadas con CFSE dentro de los lóbulos pulmonares recolectados y perfundidos. El uso de un programa de software de análisis de imágenes adecuado para convertir las imágenes fluorescentes a blanco y negro, facilita la cuantificación de la colonización pulmonar.

La administración intravenosa de células de carcinoma de pulmón de Lewis que expresan fibronectina o fibronectina codificada que expresa muestra un número significativamente menor de células que expresan fibronectina en el tejido pulmonar recolectado 38 y 45 horas después de la inyección, lo que subraya el papel de la fibronectina en la colonización del lóbulo pulmonar y el desarrollo tumoral. Al intentar este procedimiento, es importante recordar perfundir cuidadosamente los pulmones para que las células no adheridas puedan lavarse. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la metástasis del cáncer exploraran la colonización pulmonar por células tumorales circulantes en un modelo de ratón de cero gramos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar con fluorescencia suspensiones de células tumorales, inocular las células tumorales por vía intravenosa, perfundir pulmones de ratón y usar la microscopía de florescencia confocal para obtener imágenes de las células tumorales metástasicas.