En Vivo Control de la expresión de genes del reloj circadiano en el núcleo supraquiasmático de ratón usando fluorescencia Reporteros

Este método proporciona una forma de monitorear la expresión génica del reloj circadiano en tiempo real en alta resolución temporal en ratones que se mueven libremente. La principal ventaja de esta técnica es que funciona tanto en condiciones de luz-oscuridad como de oscuridad-oscuridad, que son de vital importancia para los estudios del reloj circadiano. Con un cuchillo de fibra óptica, corte una fibra de 17 milímetros de longitud.

Asegurándose de que cada lado de la fibra óptica esté liso. Inserte la fibra óptica en la férula cerámica y fije la fibra óptica a una férula cerámica con peróxido de metiletilcetona. Asegurándose de que las superficies de la fibra óptica y la férula cerámica estén al ras.

Limpie la fibra óptica con un bastoncillo de algodón empapado con 75% de etnol. Y manténgalo limpio hasta que esté listo para la inserción. Comience el procedimiento de inyección cargando primero cinco microlitros de AAV recombinante en una microjeringa.

Luego, después de anestesiar a un ratón adulto utilizando un protocolo aprobado institucionalmente, verifique que haya una profundidad suficiente de anestesia por la falta de una respuesta de pellizco del dedo del pie. A continuación, use unas tijeras para quitar el pelo de la cabeza del ratón. Y luego montar la cabeza del ratón en un aparato estereotáxico.

Después de hacer una incisión en el cuero cabelludo, exponga el cráneo. Y ajustar el aparato estereotáxico para que bregma y lambda estén en el mismo plano horizontal. A continuación, utilice un bastoncillo de algodón empapado en peróxido de hidrógeno al 4% y agua, para corroer el periostio cerebral.

Seguido con un hisopo de algodón limpio para limpiar y secar la superficie del cráneo. Utilizando el brazo estereotáxico, identifique el sitio quirúrgico, 0,46 milímetros posterior y 0,25 milímetros lateral al brugma. Luego, con un microtaladro, haga un agujero de aproximadamente un milímetro de diámetro en este punto.

Use un hisopo de algodón transparente con solución salina fisiológica para eliminar los fragmentos óseos de la superficie expuesta del cerebro. A continuación, inserte una microjeringa en el cerebro a una profundidad de 5,7 milímetros de la superficie del cráneo. E inyectar 500 nanolitros de AAV recombinante a una velocidad de 50 nanolitros por minuto en el SCN.

Deje la microjeringa en su lugar durante 10 minutos después de la inyección para garantizar la difusión completa del AAV recombinante. Después de 10 minutos, retire lentamente la microjeringa. Inmediatamente después de la inyección de AAV recombinante, inserte la férula cerámica que contiene la fibra óptica en el SCN.

A continuación, fije la férula de cerámica y la fibra óptica en el cráneo con resina dental y deje secar. Después del secado, unta la superficie de la resina dental con esmalte de uñas negro. Coloque el ratón en una jaula de recuperación calentada y vigílelo a medida que sale de la anestesia.

Una vez que el animal ha recuperado la decúbito esternal, se le puede alojar en solitario y devolverlo a la sala de alojamiento con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. Ocho días después de la cirugía, se midió la señal fluorescente en el SCN de ratones de control operados simuladamente para establecer la señal de fondo. Primero, conecte la fibra en la cabeza del mouse con el monitor de señal fluorescente.

Configure el software para medir la fluorescencia durante 15 segundos cada 10 minutos a una frecuencia de 100 hercios. Registre la señal del ratón inyectado falso. Repita el proceso para evaluar la señal fluorescente de los ratones inyectados con el reportero de cromo criptográfico AAV recombinante.

Excluya los ratones que han recibido el vector viral, pero solo muestren una señal de fondo, ya que esto probablemente indica que la punta de la fibra óptica no ha alcanzado el SCN. Después de estas medidas iniciales, regrese a los ratones a sus jaulas domésticas durante otras tres semanas, para permitir que la señal fluorescente se estabilice. Al final del experimento, verifique la ubicación de la fibra óptica en los cerebros fijos.

Excluir los ratones del análisis si la punta de la fibra óptica no está correctamente implantada en el SCN. Utilizando el enfoque detallado anteriormente, se inyectaron con éxito 500 nanolitros de virus que albergaban el reportero del gen criptocromo en el SCN de un ratón adulto. Se observó una expresión robusta de Venus ocho días después de la inyección del virus.

Esta imagen ampliada demuestra el alto nivel de expresión de Venus en el SCN. Aquí se ve la florescencia de fondo en el SCN para un animal operado simuladamente durante los períodos de encendido y apagado de luz. Este animal no mostró un ritmo detectable tanto en condiciones de luz-oscuridad como de oscuridad-oscuridad.

Esta imagen muestra la expresión del gen reportero de cromocromo criptográfico en el transcurso de siete días en una condición de 12, 12 claros-oscuros. Y más de siete días en una condición oscura. Esta imagen muestra el análisis del ritmo circadiano en la condición de luz-oscuridad.

La línea roja indica el ajuste convergente en la curva sin. El resultado de lo cual se muestra aquí. Aquí se muestra el análisis del ritmo circadiano en la condición de oscuridad-oscuridad.

De nuevo, la línea roja indica el ajuste convergente en la curva sin. Y el resultado del ajuste se muestra aquí.