Establecimiento de un cultivo primario de Sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente
11 de abril de 2018
El siguiente protocolo se centra en el establecimiento de un cultivo primario de sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente (STS). Este modelo podría ayudarnos a entender mejor el fondo molecular y perfil farmacológico de estos raros tumores malignos y podría representar un punto de partida para futuras investigaciones destinadas a mejorar la gestión de STS.
El objetivo general de este modelo preclínico humano derivado de tejido tumoral resecado quirúrgicamente es lograr el establecimiento de un cultivo primario de sarcoma de tejido blando derivado del paciente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la fisiopatología del sarcoma de tejido blando y representa una herramienta preclínica importante para predecir la respuesta al tratamiento. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un modelo preclínico totalmente humano.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del sarcoma de tejidos blandos, ya que este modelo preclínico se puede probar con fármacos innovadores convencionales para investigar su actividad y mecanismo de acción. Aunque este método puede proporcionar información sobre el sarcoma de tejido blando, también se puede aplicar al estudio de la interacción de las células blandas de las células cancerosas. Las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la heterogeneidad de los tejidos tumorales y al aislamiento de las células tumorales.
La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos iniciales de selección de células de sarcoma de tejido blando y EC requieren cierta experiencia antes de que se pueda lograr la competencia. Las muestras tumorales deben recibirse en un recipiente de orina estéril de 100 mililitros con 50 mililitros de medio DMEM bajo en glucosa sellado con una película de parafina. Las muestras se pueden mantener a cuatro grados centígrados durante un máximo de tres horas después de la resección del tumor.
Esterilice la campana de cultivo de tejidos con etanol al 70% y esterilice las pinzas de acero INOX con etanol al 70%. Retire la película de parafina del recipiente de orina y deséchela. Limpie el exterior del recipiente de orina con etanol al 70%.
Abra una placa de Petri cuadrada, luego abra el recipiente de orina y use las pinzas de acero inoxidable esterilizadas para transferir las muestras tumorales a la placa. Agregue PBS y lave la muestra tumoral dos veces. Después del lavado, triture finamente el espécimen tumoral en pedazos de uno a dos milímetros de tamaño.
Transfiera una cuarta parte de la muestra total a un tubo de dos mililitros. A continuación, añada un mililitro de reactivo TRIzol al tubo y congele inmediatamente a menos 80 grados centígrados. Recoja el resto del material tumoral finamente triturado en un tubo de 15 mililitros y agregue cuatro mililitros de solución de colagenasa tipo uno.
A continuación, diluir la solución de colagenasa tipo uno con cuatro mililitros de medio de cultivo, cerrar el tubo y sellar con una película de parafina. Incubar a 37 grados centígrados en una coctelera rodante durante 15 minutos para activar la digestión. Después de 15 minutos, coloque el tubo con el agitador rodante a temperatura ambiente y déjelo toda la noche.
Al día siguiente, filtre suavemente la suspensión celular a través de un filtro estéril de 100 micras en un tubo de 50 mililitros. A continuación, lave el filtro con medio de cultivo y centrifugue el filtrado a 225 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante invirtiendo el tubo y vuelva a suspender las células con uno o dos mililitros de medio de cultivo.
Después de realizar un recuento de células y calcular el número de células, coloque las células en un cultivo monocapa estándar a una densidad de 80.000 células por centímetro cuadrado. Para preparar una muestra citológica, comience recolectando 100.000 células en 200 microlitros de medio de cultivo. Pipetee la solución en un embudo desechable equipado con un filtro y montado con un portaobjetos de vidrio.
Abra la citocentrífuga e inserte las muestras. Después de la citocentrifugación, deseche el embudo equipado con el filtro. A continuación, fije el portaobjetos en acetona durante 10 minutos, seguido de cloroformo durante cinco minutos.
Paso de las células STS cuando la confluencia es de alrededor del 90%Después de lavar la lámina de células con PBS, agregue de dos a tres mililitros de 1X Tripsina en PBS e incube durante tres a cinco minutos a 37 grados Celsius. Después de la incubación, utilice una pipeta de 200 a 1.000 microlitros para recoger las células desprendidas y transferirlas a un tubo de 15 mililitros. Agregue cuatro mililitros de medio para detener la reacción enzimática.
A continuación, centrifugar a 225 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet de células agregando un mililitro de medio y siembre las células en una nueva placa de cultivo o un matraz. Se aislaron células tumorales de un liposarcoma extirpado quirúrgicamente de un paciente de 54 años.
Se realizó hibridación fluorescente in situ para detectar la amplificación de MDM2 en la muestra de tejido del paciente. El análisis citológico de la amplificación de MDM2 en células tumorales aisladas confirma el establecimiento de un cultivo primario derivado del paciente. Los cambios morfológicos desde la base se indujeron cuando los cultivos se trataron con Ifosfamida, Epirrubicina, Ifosfamida y Epirrubicina, Trabectedina y Eribulina.
Se realizaron tres réplicas independientes para cada experimento de viabilidad. Los resultados confirmaron la sensibilidad de los cultivos a la quimioterapia. El tratamiento más activo fue la combinación de ifosfamida y epirrubicina, una terapia de primera línea utilizada en ALT-DDLPS avanzados o metastásicos.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 15-16 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar triturar finamente la muestra tumoral. Después de este procedimiento, se pueden realizar una variedad de análisis posteriores, como el perfil de expresión génica, el análisis inmunohistoquímico o el ensayo de citotoxicidad para responder preguntas adicionales sobre la biología del sarcoma de tejido blando.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del sarcoma de tejidos blandos estudiaran la historia natural de estas neoplasias malignas poco exploradas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo establecer un cultivo primario de sarcoma de tejido blando derivado del paciente. No olvide que trabajar con muestras biológicas y medicamentos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y trabajar con una campana extractora mientras se realiza este procedimiento.
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Resumen
Este protocolo describe el establecimiento de un cultivo primario de sarcoma de tejidos blandos (STS) derivado de pacientes. Este modelo preclínico humano tiene como objetivo mejorar la comprensión de la fisiopatología del STS y las respuestas terapéuticas.
Componentes clave del estudio
Área de la Ciencia
- Oncología
- Biología celular
- Investigación preclínica
Antecedentes
- Los sarcomas de tejidos blandos son malignidades raras.
- Comprender su base molecular es crucial para una gestión eficaz.
- Los modelos actuales pueden no replicar completamente el comportamiento del tumor humano.
- Este método utiliza tejido tumoral humano para obtener información más relevante.
Objetivo del estudio
- Establecer un cultivo primario a partir de STS derivado de pacientes.
- Investigar la fisiopatología del STS.
- Evaluar las respuestas terapéuticas mediante este modelo.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de células tumorales a partir de tejido resecado quirúrgicamente.
- Establecimiento de un cultivo primario para uso experimental.
- Prueba de fármacos convencionales e innovadores.
- Análisis de la actividad del fármaco y su mecanismo de acción.
Resultados principales
- El modelo proporciona información sobre la biología del STS.
- Permite la evaluación de agentes terapéuticos.
- Demuestra la heterogeneidad de los tejidos tumorales.
- Facilita la comprensión de las interacciones entre células cancerosas.
Conclusiones
- Este modelo es una herramienta valiosa para la investigación preclínica.
- Mejora la comprensión de las respuestas al tratamiento del STS.
- Estudios futuros pueden basarse en este trabajo fundamental.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de cultivos primarios derivados de pacientes con sarcoma de tejidos blandos aborda la necesidad crítica de modelos preclínicos biológicamente relevantes en el descubrimiento de fármacos oncológicos. Este sistema derivado de humanos permite la eliminación mecanicista de riesgos de candidatos terapéuticos al preservar la heterogeneidad tumoral y la biología específica del paciente, lo que respalda la confianza predictiva en los esfuerzos de validación de dianas y la identificación de compuestos líderes. El modelo facilita la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la evaluación preclínica, reduciendo el riesgo biológico en etapas avanzadas en líneas de desarrollo enfocadas en sarcomas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en un sistema relevante para el ser humano que mantiene la citomorfología nativa del tumor y los marcadores moleculares.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de dianas mediante el perfilado de sensibilidad a fármacos utilizando agentes quimioterapéuticos estándar.
- Valor estratégico: Mejora la confianza predictiva al modelar mecanismos fisiopatológicos directamente a partir de muestras de pacientes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera cultivos estandarizados en monocapa adecuados para ensayos cuantitativos de viabilidad y citotoxicidad.
- Valor operativo: Proporciona entradas celulares reproducibles para análisis posteriores, incluidos el perfilado de expresión génica e inmunohistoquímico.
- Valor estratégico: Permite la evaluación escalable de compuestos con densidades de siembra definidas y protocolos de pase.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la biología relevante para la enfermedad mediante la preservación de las características del tumor derivado del paciente, incluido el estado de amplificación de MDM2 cuando sea aplicable.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el aislamiento inicial hasta el cultivo a largo plazo para ciclos repetidos de pruebas de fármacos.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance ajustadas al riesgo al demostrar respuestas dependientes de la dosis frente a regímenes clínicamente relevantes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo del descubrimiento al proporcionar un modelo celular humano para la prueba de hipótesis en las primeras etapas del descubrimiento, sistemas listos para ensayos para tamizaje y resultados fenotípicos medibles para la validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la investigación patofisiológica y la reducción de riesgos mecanicistas mediante la observación directa de cambios morfológicos inducidos por fármacos.
- Cribado: Proporciona cultivos estandarizados y adherentes a densidades definidas para ensayos de compuestos consistentes y la determinación de la CI50.
- Análisis: Permite mediciones cuantitativas de variables dependientes mediante ensayos de viabilidad, imágenes de fluorescencia y análisis molecular de cultivos tratados con fármacos.
- Investigación Translacional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la continuidad preclínica mediante pases seriados y ciclos repetidos de tratamiento.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma preclínica renovable aplicable a múltiples clases de fármacos y terapias combinadas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al vincular la exposición a fármacos con cambios citológicos y moleculares observables en células tumorales humanas.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de digestión, filtración y siembra con densidades celulares definidas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar señales tempranas de eficacia a partir de modelos derivados de humanos antes de los estudios in vivo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de terapéuticos para sarcomas basada en la sensibilidad demostrada en cultivos coincidentes con el paciente.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de tejidos primarios, digestión enzimática y técnicas estériles de cultivo celular.
- Depende del acceso a especímenes quirúrgicos frescos y a infraestructura para disociación basada en colagenasa.
- Necesita métodos estandarizados de cuantificación (por ejemplo, hemocitómetro o contador automatizado) para una siembra consistente.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes subtipos de sarcoma y la fragilidad del tejido durante el procesamiento mecánico.
- Está limitado por la vida útil finita de los cultivos primarios y la variabilidad entre donantes en la cinética de crecimiento.
