Óptima preparación de formol fijada muestras para péptidos basados en matriz asistida por láser de desorción/ionización espectrometría de masas de flujos de trabajo
16 de enero de 2018
Este protocolo describe un método reproducible y confiable para la preparación a base de la sublimación de formalina fijada destinado para el spectrometry total de la proyección de imagen del tejido.
El objetivo general de este procedimiento es preparar de forma reproducible una muestra de tejido para la obtención de imágenes de espectrometría de masas de péptidos. Este método permite a los usuarios novatos de espectrometría de masas desarrollar sus propios flujos de trabajo de espectrometría de masas de imágenes sin tener que pasar por largas determinaciones empíricas. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente reproducible, fácil de implementar y utiliza metodologías rentables.
Para preparar los portaobjetos recubiertos de nitrocelulosa, pipetee 40 microlitros de nitrocelulosa líquida en un borde del portaobjetos conductor de óxido de indio y estaño. Usando un portaobjetos de microscopio de vidrio normal, arrastre la nitrocelulosa bajo tensión superficial a través del portaobjetos para crear una capa de película delgada uniforme. Deje que la nitrocelulosa se seque a temperatura ambiente durante 20 segundos y luego guárdela hasta que la necesite a temperatura ambiente.
A continuación, crea cámaras de vapor personalizadas cortando un trozo de papel secante grueso lo suficientemente grande como para caber en la mitad inferior de una placa de Petri de plástico estándar. Corta el papel para dejar una tira rectangular en el centro del mismo tamaño que un portaobjetos de microscopio. Deja suficiente exceso para que el papel mantenga su posición en la placa de Petri.
Para el tejido FFPE, monte las secciones en los portaobjetos ITO prerrecubiertos de nitrocelulosa como se describe en el protocolo de texto. Sumerja los portaobjetos en xileno fresco para eliminar la parafina residual durante dos minutos. Lave las muestras desparafradas sumergiendo los portaobjetos en una serie de disolventes graduados que consta de una solución de agua de etanol al 70 % de volumen, seguida de etanol al 100 %, durante 30 segundos.
Luego, sumerge los portaobjetos en el líquido de Carnoy durante dos minutos. Finalmente, sumerja los portaobjetos en una serie de 100% etanol, agua ultrapura y 100% etanol nuevamente, durante 30 segundos. Cargue los portaobjetos de muestra en una caja de portaobjetos de plástico que se llena hasta la parte superior con 20 milimolares tris HCO.
Selle la caja y colóquela en un baño de agua que contenga 500 mililitros de agua, permitiendo que la caja toque el fondo del baño. Luego caliente la caja durante 15 minutos a 120 grados centígrados en una olla a presión, que puede alcanzar una presión de funcionamiento de 70 kilopascales. Retire los portaobjetos, deje que se enfríen y déjelos secar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Una vez hidrolizadas, cubra las muestras con 10 microlitros de solución de tripsina en agua ultrapura pipeteando primero 10 microlitros de la solución en el borde de la sección de tejido. A continuación, con la misma punta de pipeta, arrastre la gota por toda la superficie del tejido bajo tensión superficial. Después de dejar que las muestras se sequen a temperatura ambiente, móntelas dentro de la parte superior de la cámara de vapor previamente construida con cinta de autoclave en cada borde del portaobjetos.
Pipetee cuidadosamente 600 microlitros de una solución que contenga un volumen uno a uno para una mezcla de volumen de 100% acetonitrilo y 50 milimolares de bicarbonato de amonio en el dedo de papel secante en la parte inferior de la placa de Petri, hasta que el dedo parezca estar uniformemente húmedo. El pipeteo es de vital importancia porque un pipeteo incorrecto dará lugar a la deslocalización de la matriz y los analoides de superficie, lo que destruirá la información espacial contenida en la muestra. Coloque la mitad superior de la cámara de vapor en la mitad inferior, asegurándose de que el dedo de papel y el portaobjetos de la muestra se alineen perfectamente, y selle la cámara alrededor de su ecuador con una película de parafina.
Deje la muestra durante la noche en una incubadora a 37 grados centígrados para permitir una digestión completa. Una vez digerido, deje el portaobjetos de muestra en una balanza microanalítica de cinco dígitos. Monte el portaobjetos en el dedo de enfriamiento del aparato de sublimación y asegúrelo con cinta de cobre de la misma manera que se describe para la cámara de vapor.
Coloque 300 miligramos de matriz de CHCA en una placa de Petri de vidrio en el fondo de la cámara y extiéndala uniformemente para crear una capa delgada de cristales de matriz. Monta el sublimador. Y asegure las dos mitades con la abrazadera de herradura.
Suspenda la unidad ensamblada de 15 a 20 centímetros sobre un baño de arena, precalentada a 220 grados centígrados, colocándola en un anillo de metal conectado a un soporte de retorta. Conecte la cámara a la fuente de vacío, active el vacío y permita que se estabilice hasta aproximadamente 25 militorr durante cinco minutos. Llene el dedo refrigerante hasta la parte superior con hielo y agregue 50 mililitros de agua.
Deje que el aparato se asiente durante cinco minutos más antes de continuar. Baje la cámara sobre la superficie del soporte, asegurándose de que la arena entre en contacto completo con el fondo de la cámara. Déjalo actuar durante 45 minutos para crear una capa ideal de 0,22 miligramos por centímetro cuadrado.
Después de 45 minutos, retire la cámara del baño de arena levantando el anillo de metal y ventile la cámara. Una vez sublimado, monte el portaobjetos de muestra dentro de la parte superior de la cámara de vapor previamente construida, como antes. Pipetee cuidadosamente 600 microlitros de una solución que contenga una mezcla de volumen de acetonitrilo y ácido trifluoroacético en agua sobre el papel secante en la parte inferior de la placa de Petri para asegurar un recubrimiento uniforme.
A continuación, ensamble la cámara, asegurándose de que la lengüeta de papel y el portaobjetos del microscopio se alineen perfectamente. Deje la cámara en una incubadora a 37 grados centígrados durante una hora. Escanee la diapositiva en un escáner plano para crear una imagen digital.
Cargue la muestra en el espectrómetro de masas y, a continuación, analícela utilizando la plataforma de software adecuada. Por último, analice las muestras tal y como se describe en el protocolo de texto. Aquí se muestra una muestra de tejido correctamente procesada que ha sido fotografiada a 50 micras y muestra una buena macroestructura y una clara diferencia entre la materia blanca y la materia gris.
Las muestras comparadas con éxito mostrarán una clara diferenciación en diferentes ubicaciones de tejidos. Aquí, hay una región clara de regulación positiva del péptido representada por una relación masa-carga de 1,085 en la región de la materia blanca, representada por las regiones blancas. Por el contrario, esta muestra preparada incorrectamente muestra un nivel de deslocalización a gran escala.
Los patrones de las moléculas presentes en los tres paneles demuestran claramente que no hay una definición clara entre las regiones biológicas o diferencias en la abundancia de las moléculas mostradas. Después de ver este video, debería tener una muy buena idea de cómo preparar sus propias muestras para el análisis de imágenes de péptidos. Con el procedimiento adecuado, este método se puede realizar dentro de las ocho horas durante dos días, lo que permite un paso de digestión durante la noche.
Al preparar esta metodología, es importante tener cuidado en cada paso. Cualquier daño físico que ocurra en el tejido destruirá la información espacial contenida en su muestra. Tuvimos la idea de esta metodología cuando comenzamos nuestras propias investigaciones espaciales IMS y nos dimos cuenta de que no había otras metodologías definitivas que se publicaran.
Con pequeñas modificaciones, nuestra metodología se puede aplicar al análisis de proteínas, péptidos, lípidos y otras moléculas pequeñas. Después de este procedimiento, se pueden aplicar otras técnicas histológicas como la inmunofluorescencia y la tinción con hematoxilina y eosina a su muestra para obtener un punto de referencia para sus datos de espectrometría de masas de imágenes. Cuando se trabaja con productos químicos potencialmente explosivos, como la nitrocelulosa líquida, es importante mantener los procedimientos de seguridad correctos.
Minimizar los volúmenes de trabajo y eliminar los residuos de forma inmediata es de vital importancia.
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Descripción general
Este protocolo describe un método reproducible y confiable para la preparación de tejido fijado con formalina mediante sublimación, destinado a la espectrometría de masas de imágenes. La técnica está diseñada para ayudar a los usuarios novatos a desarrollar sus propios flujos de trabajo de manera eficiente.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Espectrometría de Masas
- Preparación de Tejidos
- Técnicas de Imagen
Antecedentes
- La espectrometría de masas de imágenes es una herramienta poderosa para analizar muestras de tejidos.
- La fijación con formalina es un método común para preservar tejidos biológicos.
- La reproducibilidad es crucial para obtener resultados científicos confiables.
- Las metodologías rentables son importantes para su adopción generalizada.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método sencillo y reproducible para la preparación de muestras de tejidos.
- Permitir que los usuarios novatos creen sus propios flujos de trabajo de imágenes.
- Optimizar el proceso de preparación de muestras para la imagen de espectrometría de masas de péptidos.
Métodos Utilizados
- Preparación de portaobjetos recubiertos con nitrocelulosa.
- Aplicación de nitrocelulosa líquida sobre portaobjetos conductivos.
- Formación de un recubrimiento uniforme y delgado mediante la tensión superficial.
- Secado y almacenamiento de los portaobjetos a temperatura ambiente.
Resultados principales
- El método es altamente reproducible y sencillo de implementar.
- Se utilizaron con éxito metodologías rentables.
- Los usuarios novatos pueden preparar muestras de manera eficiente sin necesidad de ensayos empíricos extensos.
Conclusiones
- Este protocolo facilita la preparación de muestras de tejido para la espectrometría de masas de imágenes.
- Ofrece un enfoque confiable para investigadores en el campo.
- El método mejora la accesibilidad para usuarios novatos de la espectrometría de masas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los flujos de trabajo de IMS MALDI basados en péptidos enfrentan desafíos significativos en la detección de analitos procedentes de tejidos fijados con formalina debido a los riesgos de reticulación y deslocalización espacial. Este protocolo proporciona un método reproducible y rentable para preservar la información espacial mientras se maximiza la ionización de péptidos, apoyando directamente la validación de objetivos y el desarrollo de ensayos en las líneas de descubrimiento. Al permitir la detección fiable de péptidos a partir de muestras archivadas en FFPE, mejora la reducción de riesgos mecanicistas y la confianza predictiva en las pruebas de hipótesis terapéuticas en fases iniciales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la detección de péptidos con resolución espacial a partir de archivos de FFPE.
- Valor operativo: Reduce la ambigüedad mecanicista mediante una preparación reproducible de muestras que mantiene la integridad del tejido.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al generar mapas cuantitativos de péptidos para la evaluación del compromiso del blanco.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos posteriores con el contexto espacial preservado.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante pasos sencillos de recubrimiento manual.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en campañas de cribado de péptidos, lípidos y moléculas pequeñas.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica mediante un manejo consistente de muestras FFPE.
- Alineación de Biomarcadores: Permite la correlación de las señales peptídicas de MSI con referencias histopatológicas como la tinción H&E.
- Avance Ajustado al Riesgo: Apoya las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos confiables de localización molecular a partir de cohortes archivadas.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, permitiendo específicamente el análisis de péptidos a partir de muestras fijadas con formalina que de otro modo serían inaccesibles para la MSI MALDI.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la detección de péptidos endógenos con resolución espacial.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante un recubrimiento de matriz reproducible y la localización de analitos sin deslocalización.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas de intensidad iónica que permiten comparar la abundancia de péptidos entre distintas regiones del tejido.
- Investigación Traducional: Se integra con flujos de trabajo preclínicos al posibilitar la co-registración con tinciones H&E e inmunofluorescencia para la validación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad estandarizada y de bajo costo para la MSI de péptidos aplicable en múltiples áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la detección espacialmente resuelta de péptidos a partir de tejido FFPE.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante pasos sencillos y manuales que no requieren instrumentación automatizada.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción al reducir los falsos negativos en la detección de péptidos a partir de muestras archivadas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo al desbloquear colecciones históricas de tejidos para estudios de validación de objetivos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología y preparación de muestras para espectrometría de masas.
- Depende de equipos de laboratorio estándar, incluyendo aparatos de sublimación al vacío e incubadoras.
- Necesita estandarización entre equipos en el manejo de muestras de FFPE y la preparación de reactivos entre los equipos de patología y análisis.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos de tejidos y duraciones de fijación.
- Las limitaciones prácticas incluyen el manejo cuidadoso del nitrato de celulosa líquido explosivo y el control preciso de volúmenes para prevenir la delocalización de analitos.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:05
Title
0:29
Preparation of Reagents and Equipment
1:21
Preparation of Tissue Sections and Methylene Crosslink Hydrolysis
2:40
Tissue Digestion
3:57
Matrix Coating via Sublimation
5:26
Recrystallization and Instrumentation
6:20
Results: Correctly and Incorrectly Prepared Human Brain Tissue
7:07
Conclusion
