Name: Óptima preparación de formol fijada muestras para péptidos basados en matriz asistida por láser de desorción/ionización espectrometría de masas de flujos de trabajo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprende a preparar tejidos fijados en formol para espectrometría de masas por imagen de péptidos con este protocolo reproducible y rentable. Ideal para usuarios noveles que desean desarrollar flujos de trabajo propios sin ensayos empíricos prolongados.

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Los autores desean reconocer la Fundación de escuela médica de Sydney y azul y Fundación para la financiación de parte de este trabajo a través de su programa de becas de doctorado para la investigación de la enfermedad de Alzheimer y una subvención del descubrimiento del arco (DP160102063) otorgado a PKW.

PRECAUCIÓN: Todas las precauciones de seguridad se deben seguir al realizar este procedimiento, incluyendo el uso de equipos de protección personal (EPP) (por ejemplo, batas de laboratorio, guantes de nitrilo, gafas de seguridad, etc.)
1. preparación de reactivos y equipos
<ol><li>
Preparación de soluciones
	<ol>
<li>Para preparar 500 mL de líquido de Carnoy, mezcle 100% etanol (EtOH), cloroformo y ácido acético glacial en un 6:3:1 cociente de v/v/v en un frasco limpio de Schott.</li>
		<li>Para hacer líquido nitrocelulosa (NC), disolver la membrana NC (comúnmente utilizada en el borrar occidental) en acetona limpia, por agitación suave, a una concentración final de 40 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de portaobjetos recubierto NC
	<ol>
<li>Uso una técnica similar a la utilizada para la preparación de sangre frotis para que examen histológico20 preparar NC revestido diapositivas.</li>
		<li>Pipeta de 40 μl de líquido NC en un borde de un portaobjetos de microscopio conductor indio óxido de estaño (ITO). Con un portaobjetos de vidrio ordinario, arrastre NC bajo tensión superficial a través de la diapositiva para crear una capa de película delgada incluso.</li>
		<li>Permita que la NC se seque a temperatura ambiente durante 20 s y entonces almacenar hasta que sea necesario a temperatura ambiente. Almacenamiento de muestras en estas condiciones puede ser indefinida siempre y cuando los tejidos se mantienen y libre de polvo. Nota: Este método de preparación es mejor conocido como "película delgada" y va a producir una capa uniforme que depende de la viscosidad de la NC, así como su falta de tensión de superficie se nivele automáticamente en la diapositiva. El único cuidado que debe tomarse al preparar las diapositivas no está moviendo demasiado rápido, que va a crear vetas de NC en lugar de una cobertura completa. PRECAUCIÓN: Como líquido NC se seca muy rápidamente, es esencial trabajar rápidamente para evitar que se sequen la solución antes de que se ha extendido correctamente. También se debe tener cuidado al manipular NC en su estado líquido, ya que es un compuesto altamente energético y no debe tocar una fuente de ignición para evitar explosión incendiaria. NC también sufre transiciones endotérmicas al secarse y puede causar quemaduras frío si entra en contacto prolongado con la piel o las manos enguantadas. Para minimizar los riesgos asociados, sólo pequeñas cantidades deben estar preparadas en cada momento (< 1 mL se recomienda). Una vez seco es estable a temperatura ambiente. Sin embargo, la NC puede permanecer explosivo cuando está presente en grandes cantidades.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Creación de cámaras de vapor personalizado
	<ol>
<li>Cortar un trozo de papel secante grueso con un par de tijeras lo suficientemente grandes como para caber en la parte inferior de la mitad de un plato de petri de plástico estándar (94 mm de diámetro y 3 mm de espesor).</li>
		<li>Cortar el papel, dejando una tira rectangular en el centro, el mismo tamaño que un portaobjetos de microscopio, dejando suficiente exceso de modo que el papel mantendrá su posición en el plato de Petri (figura 1 complementaria).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de las secciones de tejido
<ol><li>
De tejido FFPE21.
	<ol>
<li>Seleccione la sección a 12 μm de grosor en un banco estándar montado para Microtomo y flotador montaje en el NC previamente recubierto ITO diapositivas y bloque de tejido deseado.</li>
		<li>Sumerja el portaobjetos en xileno fresca para quitar la parafina residual por 2 min y repetir la operación una segunda vez. Nota: Si el bloque de parafina es especialmente dominante o el tejido es relativamente pequeño comparada con el bloque de parafina, las muestras se pueden calentar a 60 ° C para derretir lejos la mayoría antes de lavar, lavadora en xileno.</li>
		<li>Lavar las muestras deparaffinized sumergiendo los portaobjetos en una serie gradual de solventes: 70% v/v agua/EtOH, 100% EtOH, de Carnoy líquido, 100% EtOH, agua ultra pura y 100% EtOH. La duración de cada inmersión debe ser de 30 s, excepto en líquido de Carnoy, que debe durar 2 minutos. PRECAUCIÓN: Líquido de Carnoy y xileno deben almacenados y utilizados en una campana de humos, ya que son altamente tóxicos si se inhala.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tejido formalina-fijo congelados (FFF) Nota: Las muestras deben ya congelarse, adecuadamente según el tipo de muestra.<ol>
<li>Equilibrar el bloque de tejido a la temperatura de funcionamiento del micrótomo para 20 minutos22. Nota: Temperatura de equilibrio depende del tipo de tejido.</li>
		<li>Deslice la sección el tejido usando un micrótomo a 12 μm y deshielo de montaje las secciones en un NC preparado recubiertos de ITO.</li>
		<li>Almacenar las diapositivas en un desecador de vacío sobre la mesa en la oscuridad. Nota: Las muestras pueden almacenarse durante varias semanas en estas condiciones.</li>
		<li>Lavar las muestras en una serie gradual de solventes como para tejido FFPE (2.1.3). Nota: No hay un paso de deparaffinisation de xileno como la muestra no está incorporada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. metileno reticulación hidrólisis
<ol><li>Cargue los portaobjetos de la muestra (FFF o FFPE) en una caja de plástico deslizante que se llena en la parte superior con 20 mmol tris-HCl (pH 8.8). Sellar la caja y colocarlo en un baño de agua, que contiene 500 mL de agua, permitiendo que la caja tocar la parte inferior. Luego calentar durante 15 min a 120 ° C en una olla a presión que puede alcanzar una presión de 70 kPa.</li>
	<li>Eliminar las diapositivas, déjelos enfriar y deje secar a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
</ol>4. tejido digestión
<ol><li>Una vez hidrolizado, untar las muestras con 10 μl de solución de tripsina (1 mg/mL) en agua ultra pura, por Pipetear 10 μl de la solución sobre el borde de la sección del tejido y luego, utilizando la misma punta de pipeta, arrastrar la gota en toda la superficie del tejido bajo la superficie tensión. Nota: Evite rayar la superficie del tejido con la punta de la pipeta y sobre la que se separa la enzima más allá de las fronteras de los bordes de tejido.</li>
	<li>Permita que las muestras se sequen a temperatura ambiente.</li>
	<li>Una vez seco, montar las muestras dentro de la parte superior de la cámara de vapor previamente construidas (tejido hacia abajo) con cinta de autoclave en cualquier borde de la diapositiva (suplementario Figura 2).</li>
	<li>Pipetear 600 μl de una solución que contiene una mezcla de 1:1 v/v 100% acetonitrilo y 50 mM de bicarbonato de amonio con cuidado sobre el dedo de papel secante en la parte inferior de la caja Petri hasta que el dedo parece uniformemente húmedo.</li>
	<li>Coloque la mitad superior de la cámara de vapor en el fondo la mitad, asegurando el dedo y muestra la diapositiva de la papel alinear perfectamente y sellar la cámara alrededor de su Ecuador con la película de parafina.</li>
	<li>Dejar la muestra durante la noche en una incubadora de 37 ° C para permitir la digestión completa.</li>
</ol>5. matriz capa a través de la sublimación
<ol><li>Una vez digerido, pesa el portaobjetos de la muestra en un equilibrio microanalíticos de 5 dígitos.</li>
	<li>Monte la corredera en el dedo del enfriamiento del aparato de la sublimación y fijarlo con cinta de cobre, de la misma manera como se describe para la cámara de vapor (figura 3 complementaria). Nota: Para asegurarse de que el carro se pone en contacto uniformemente por el dedo de enfriamiento, una capa de cinta de cobre se coloca en la parte inferior del dedo a nivel de la superficie de enfriamiento. Esto asegura que la diapositiva se enfría uniformemente que conduce a incluso la deposición de la matriz.</li>
	<li>Colocar 300 mg de la matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) en un plato de petri de vidrio en la parte inferior de la cámara y extensión uniformemente para crear una fina capa de cristales de la matriz.</li>
	<li>Montar el sublimator y asegure las dos mitades con la pinza de la herradura. Suspender la unidad montada de 15-20 cm por encima de un baño de arena, precalentado a 220 ° C, colocando en un anillo de metal conectado a un soporte de retorta.</li>
	<li>Conecte la cámara al vacío, para activar el vacío y permite que se estabilice hasta ~ 25 mTorr durante 5 minutos.</li>
	<li>Pack el dedo enfriamiento en la parte superior con hielo y añadir 50 mL de agua. Permita que el aparato que conformarse con un 5 minutos más antes de proceder.</li>
	<li>Baje la cámara sobre la superficie de la arena, asegurando que la arena completamente en contacto con la parte inferior de la cámara y lo dejas por 45 minutos crear un recubrimiento ideal de 0,22 mg/cm2 PRECAUCIÓN: Debe tenerse cuidado al manejar material de vidrio al alto vacío, como daños en el aparato, mientras que los evacuados, puede resultar en una falla catastrófica de la cámara de vidrio.</li>
	<li>Después de 45 minutos, saque la cámara del baño arena levantando el anillo metálico y la cámara de ventilación. Nota: Una vez que la cámara se ha eliminado, la diapositiva debe eliminarse muy rápidamente como agua en el aire empezará a condensarse en el dedo y muestra diapositiva de congelación.</li>
	<li>Quitar la corredera y pésalo para asegurar el recubrimiento deseado se ha logrado. Nota: Si capa insuficiente se ha logrado, simplemente Repita el proceso de la sublimación de la diapositiva hasta conseguir el espesor de capa deseado.</li>
</ol>6. recristalización
<ol><li>Una vez sublimado, Monte la corredera de la muestra dentro de la tapa de la cámara de vapor previamente construida, como se describe anteriormente (tejido hacia abajo).</li>
	<li>Pipetear 600 μl de una solución que contiene una mezcla de 1:1 (v/v) de 100% acetonitrilo y 0.1% v/v de ácido trifluoroacético en agua con cuidado sobre el papel secante en la parte inferior de la caja Petri para asegurar un recubrimiento uniforme.</li>
	<li>Montar la cámara, asegurando la diapositiva de la ficha y microscopio de papel alinear perfectamente y dejar en una incubadora de 37 ° C durante 1 hora. PRECAUCIÓN: No selle el compartimiento. Nota: Una vez recristalizado, el color normalmente amarillo de la matriz debe cambia a blanco, mirar menos brillante y aparecen muy uniforme. Esto indica que la recristalización se ha realizado correctamente.</li>
	<li>La muestra está ahora lista para su análisis.</li>
</ol>7. instrumentación
<ol><li>Analizar la diapositiva en un escáner de superficie plana para crear una imagen digital.</li>
	<li>Cargar la muestra en el espectrómetro de masas y luego analizar utilizando la plataforma de software apropiado.</li>
	<li>Analizar las muestras en el modo reflectron de ion positivo con una gama total de 3.500 750 Da, con una resolución de punto que es aplicable al resultado deseado. En la mayoría de los casos, 20-50 μm trama ancho es suficiente, sin embargo tan poco como 10 μm pueden ser usados15. PRECAUCIÓN: Láseres UV MALDI son una fuente de radiaciones ionizantes y no deben ser vistos directamente. Asegúrese de que el láser está dentro de instrumento de protección antes de la operación.</li>
</ol>

<ol><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%3A+practical+aspects+of+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation.</a> J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Imaging+of+Biological+Samples%3A+Localization+of+Peptides+and+Proteins+Using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS.</a> Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).</li>
<li>Jackson, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-Ion+Mobility+Mass+Spectrometry+of+Lipids+in+Negative+Ion+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+methods+%3A+advancing+methods+and+applications%22%5BJournal%5D)">MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode.</a> Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-instrument-based+method+for+the+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+spinal+cord+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+cost-effective+method+for+the+analysis+of+fresh+frozen+tissue+sections+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).</li>
<li>Chughtai, K., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+imaging+for+biomedical+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis.</a> Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometry-assisted+molecular+imaging+of+metabolites+during+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula-Sinorhizobium+meliloti+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis.</a> Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).</li>
<li>Powers, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry+profiling+of+N-glycans+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+clinical+tissue+blocks+and+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays.</a> PLoS One. 9 (9), 10655(2014).</li>
<li>Rompp, A., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+with+high+resolution+in+mass+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space.</a> Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).</li>
<li>Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+an+emerging+technology+in+neuropsychopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology.</a> Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).</li>
<li>Alexandrov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry%3A+statistical+data+analysis+and+current+computational+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 11(2012).</li>
<li>Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry%3A+From+tissue+sections+to+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).</li>
<li>Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+in+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry in microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).</li>
<li>O'Rourke, M., Padula, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/protocolexchange/protocols/5695">The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis.</a> Protocol Exchange. , (2017).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+standard+of+visual+data+representation+for+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry.</a> Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue+via+proteomic+techniques+and+misconceptions+of+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval.</a> Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).</li>
<li>Casadonte, R., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).</li>
<li>Ong, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+Imaging+and+Identification+of+Peptides+Associated+with+Cephalic+Ganglia+Regeneration+in+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea.</a> J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+proteins+in+tissues+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-smear+showing+Experimental+Infection+with+Herpetomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Med%22%5BJournal%5D)">Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas.</a> Proc R Soc Med. 18, Sect Trop Dis Parasitol 55(1925).</li>
<li>Gorrie, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+human+OEC-derived+cell+transplants+in+rodent+spinal+cord+contusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury.</a> Brain Res. 1337, 8-20 (2010).</li>
<li>Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Tissue+Derivatization+via+Electrospray+Deposition+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry+Imaging+of+Endogenous+Fatty+Acids+in+Rat+Brain+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues.</a> Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).</li>
<li>Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+NIMS+and+MALDI+platforms+for+neuropeptide+and+lipid+mass+spectrometric+imaging+in+C.+borealis+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue.</a> Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).</li>
<li>Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+pressure+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+tissues+and+cells+at+1.4-mum+lateral+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution.</a> Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).</li>
<li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+sublimation%2Frecrystallization+for+imaging+proteins+by+mass+spectrometry+at+high+spatial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution.</a> Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).</li>
<li>Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometric+imaging+of+biological+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections.</a> Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).</li>
<li>Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+gallotannins+and+monoterpene+glucosides+in+the+root+of+Paeonia+lactiflora%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora.</a> Sci Rep. 6, 36074(2016).</li>
<li>Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+of+biomolecular+information%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging of biomolecular information.</a> Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).</li>
<li>Widlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+signatures+of+oral+squamous+cell+carcinoma+and+normal+epithelium+-+application+of+a+novel+methodology+for+unsupervised+segmentation+of+imaging+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium - application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data.</a> Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflicto de intereses o interés comercial para revelar

Este protocolo fue diseñado para maximizar la generación de especies moleculares ionizables eliminando deslocalización de analitos. Los factores clave incluyen usando el mismo principio primordial al aplicar la matriz, digerir la muestra o recristalización después de la sublimación24; es decir, que una incluso deposición de vapor, de matriz o de lo contrario, debe ser creado y mantenido. Pipeteo lavados solvente para recristalización y la digestión, uniformemente por debajo de la muestra, impide c...

Espectrometría de masas del desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI MSI) la proyección de imagen ha sido empleada como una técnica de imagen basado en dos décadas1,2, análisis de una gama de biomoléculas, incluyendo: lípidos3, péptidos2 ,4, proteínas2,5, metabolitos6,7, N-glycans8y moléculas sintéticas como drogas terapéuticas9,10. El número de publicaciones que demuestran la utilidad de esta técnica ha crecido significativamente durante la última década6,11,12,13. Ciertas moléculas tales como lípidos, son relativamente fáciles de analizar mediante MALDI MSI, que se ionizan fácilmente debido a su naturaleza química y por lo tanto requieren poca preparación previa3. Sin embargo, para alcanzar las metas más difíciles tales como péptidos, los pasos necesarios para ionizar con eficacia estas moléculas son amplia y generalmente complicados14. Actualmente existen muy pocas publicaciones que apuntan a la dirección o demuestran reproducibilidad en las metodologías que se emplean para preparar el tejido para esta técnica visual única15. Por esta razón, hemos compilado las observaciones e implementadas optimizaciones en una única, fácil de implementar, metodología que no debería requerir poca o ninguna modificación, para el análisis de péptidos de un formaldehído reticulado tejido fuente14.
En este manuscrito, hemos descrito una metodología reproducible validada y bajo costo para la detección y asignación espacial de péptidos, generados a partir de formalina-fijos congelado (FFF) y secciones de tejido de formalina-fijo de parafina-encajadas (FFPE). Esta metodología no requiere ni confiar en cualquier instrumentación especializada3. En concreto, abordar los aspectos de la preparación de la muestra especializada necesario analizar péptidos; pasos como antígeno recuperación16 y recubrimiento de la matriz. Nuestro protocolo también utiliza equipo barato y reactivos, lo cual esta metodología accesible a una comunidad más amplia que de lo contrario sería incapaz de permitirse la alternativa aparato robótico17.
El razonamiento detrás de desarrollar un método de preparación manual de las muestras fue doble: en primer lugar, el uso de un sublimator crea una capa homogénea y consistente de cristales matriz ~ 1 μm de longitud18, algo inalcanzable con la pulverización más comunes técnicas. En segundo lugar, el conjunto relativamente pequeño los costos: el costo total del aparato de medida fue < AUD $1500. Observamos, en términos de rentabilidad, que el precio por muestra es mucho más barato cuando no hay ninguna maquinaria robotizada. El uso de la sublimación se ha divulgado previamente, sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, metodologías paso a paso que describen este proceso y preparación de muestras no han sido registrados ni descrito en la literatura.
Este protocolo está diseñado para ayudar a los investigadores que tienen acceso a un espectrómetro de masas MALDI y que están determinados en la generación de información espacial en relación con una bio-molécula de interés19. En esencia, MALDI MSI es una forma de histológico de detección no depende de los anticuerpos o las manchas de2.

<table><tbody><tr><td>Criomicrótomo</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td>Para la preparación y sección de tejido.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de óxido de indio y estaño</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>Para la preparación y sección de tejido.</td></tr><tr><td>Tarros Coplin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5516</td><td>Para la preparación y sección de tejidos.</td></tr><tr><td>Olla a presión</td><td>Kambrook</td><td>KPR620BSS</td><td>Para la preparación y sección de tejidos.</td></tr><tr><td>Sublimador</td><td>Chem Glass</td><td>NA</td><td>Para el procedimiento de sublimación. Similar en diseño a la CG-3038, sin embargo, fue hecha a medida&nbsp;</td></tr><tr><td>Baño de arena</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Para el procedimiento de sublimación. Arena de río de grado fino contenida en papel de aluminio plegado procedente del exterior, no de ninguna empresa específica</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio</td><td>Sigma Aldrich CLS70165100</td><td></td><td>Para el procedimiento de sublimación.</td></tr><tr><td>Bomba de vacío</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Para el procedimiento de sublimación. Obtenido como pieza de repuesto de un viejo espectrómetro de masas&nbsp;</td></tr><tr><td>Trampa fría</td><td>Chem Glass</td><td>CG-4510-02</td><td>para procedimiento de sublimación.</td></tr><tr><td>Placa caliente</td><td>John Morris</td><td>EW-15956-32.&nbsp;</td><td>Para el procedimiento de sublimación.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de plástico</td><td>Sigma Aldrich Z717223</td><td></td><td>Para el procedimiento de sublimación.</td></tr><tr><td>37 y s&deg; Incubadora C,</td><td>NA</td>, <td>NA</td>: <td>Para el procedimiento de sublimación. No aplicable, la incubadora no es estéril y tiene más de 30 años&nbsp;</td></tr><tr><td>Papel secante</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7796</td><td>Para el procedimiento de sublimación.</td></tr><tr><td>Nitrocelulosa&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8395</td><td>Para el lavado de correderas.</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td>Para el lavado de portaobjetos.</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma Aldrich 214736</td><td></td><td>Para el lavado de portaobjetos.</td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.02428</td><td>Para el lavado de correderas.</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Para el lavado de correderas. Hecho en laboratorio con un 95% de etanol de stock &nbsp;</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432</td><td>Para el lavado de portaobjetos.</td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Para el lavado de portaobjetos.</td></tr><tr><td>Tris HCL pH 8.8</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>Para la escisión proteolítica. Polvo hecho a 1M seguido de equilibrio con 32% de HCl a PH 8.8</td></tr><tr><td>Milli Q Agua ultrapura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Para la escisión proteolítica. Purificación realizada internamente por el sistema de purificación de agua sartorio</td></tr><tr><td>Bircarbonato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Para la escisión proteolítica.</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0303</td><td>Para la escisión proteolítica.</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2020</td><td>Para recristalización.</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.00029</td><td>Para la recristalización.</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td>Para la recristalización.</td></tr></tbody></table>

Óptima preparación de formol fijada muestras para péptidos basados en matriz asistida por láser de desorción/ionización espectrometría de masas de flujos de trabajo

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

El uso de desorción/ionización láser asistida por matriz, espectrometría de masas (MALDI MSI) la proyección de imagen se expandió rápidamente, ya que esta técnica analiza una serie de biomoléculas de las drogas y los lípidos a N-glycans. Aunque existen diversas técnicas de preparación de muestras, detección de péptidos del formaldehído conservada los tejidos sigue siendo uno de los retos más difíciles para este tipo de análisis de espectrometría de masa. Por esta razón, hemos creado y optimizado una robusta metodología que conserva la información espacial contenida en la muestra, mientras que el mayor número de péptidos ionizables. También hemos destinado para lograrlo de una manera simple y rentable, eliminando así posibles error de sesgo o preparación, que puede ocurrir cuando utiliza instrumentación. El resultado final es un protocolo reproducible y de bajo costo.

Si se siguen correctamente, este protocolo produce imágenes que representan claramente la morfología gruesa del tejido sin cualquier arañazos u otras deformaciones (figura 1). La validación ideal para una preparación de la ejecución correcta de la muestra, es la capacidad de distinguir diferentes estructuras físicas cambiando la molécula ser visto (figura 2).
Es una bue...

Este protocolo describe un método reproducible y confiable para la preparación a base de la sublimación de formalina fijada destinado para el spectrometry total de la proyección de imagen del tejido.

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar de forma reproducible una muestra de tejido para la obtención de imágenes de espectrometría de masas de péptidos. Este método permite a los usuarios novatos de espectrometría de masas desarrollar sus propios flujos de trabajo de espectrometría de masas de imágenes sin tener que pasar por largas determinaciones empíricas. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente reproducible, fácil de implementar y utiliza metodologías rentables.Para preparar los portaobjetos recubiertos de nitrocelulosa, pipetee 40 microlitros de nitrocelulosa líquida en un borde del portaobjetos conductor de óxido de indio y estaño. Usando un portaobjetos de microscopio de vidrio normal, arrastre la nitrocelulosa bajo tensión superficial a través del portaobjetos para crear una capa de película delgada uniforme. Deje que la nitrocelulosa se seque a temperatura ambiente durante 20 segundos y luego guárdela hasta que la necesite a temperatura ambiente.A continuación, crea cámaras de vapor personalizadas cortando un trozo de papel secante grueso lo suficientemente grande como para caber en la mitad inferior de una placa de Petri de plástico estánda

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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El ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) ha sido reportado anteriormente como una matriz de MALDI para obtener imágenes de tejido de pequeñas moléculas; protocolos para el uso de DT para la formación de imágenes de MALDI de los lípidos endógenos en la superficie de secciones de tejido por-ion positivo MALDI-MS en un instrumento cuadrupolar-FTICR ultra alta resolución se proporcionan aquí.

El ditranol como una matriz para láser asistida por matriz de desorción / ionización de imágenes en una transformada de Fourier de iones de resonancia de ciclotrón Espectrómetro de Masas

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Preparación de la muestra Estrategias para Espectrometría de Masas de imágenes de modelos de cultivo celular en 3D

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Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

Se demuestra un protocolo para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas MALDI por reformar estructuras cristalinas durante los procesos de preparación de muestra.

Un método de preparación de muestra eficiente para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz

Caracterización del proteoma de camas microvasculares oculares es fundamental para la profunda comprensión de muchas patologías oculares en los seres humanos. Este estudio demuestra un método efectivo, rápido y robusto para la extracción de proteína y preparación de la muestra de pequeños vasos sanguíneos con las arterias ciliares posteriores cortas porcinas como recipientes de modelo de análisis basado en la espectrometría de masas proteómica.

Preparación de muestras para análisis de proteómica basado en la espectrometría de masa de microvasos Ocular

El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.

Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación de la muestra al planificar experimentos con MALDI MSI para maximizar la detección metabólica y molecular en muestras biológicas.

Preparación de muestras para perfiles metabólicos utilizando imágenes de espectrometría de masas MALDI

Este artículo describe un método de preparación de muestras basado en la inactivación por calor para preservar los péptidos endógenos evitando la degradación post mortem, seguido de una cuantificación relativa utilizando el etiquetado isotópico más LC-MS.

Preparación de muestras y cuantificación relativa mediante metilación reductiva de aminas para estudios de peptidómica

Este protocolo tuvo como objetivo describir una guía detallada sobre la preparación de secciones de muestras de semillas duras con bajo contenido de agua para el análisis MALDI-IMS, manteniendo la distribución y abundancia originales de los analitos y proporcionando una señal de alta calidad y resolución espacial.

Preparación de semillas de palma dura para el análisis de espectrometría de masas por imágenes de desorción/ionización por láser asistida por matriz

Aprende a preparar tejidos fijados en formol para espectrometría de masas por imagen de péptidos con este protocolo reproducible y rentable. Ideal para usuarios noveles que desean desarrollar flujos de trabajo propios sin ensayos empíricos prolongados.

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Óptima preparación de formol fijada muestras para péptidos basados en matriz asistida por láser de desorción/ionización espectrometría de masas de flujos de trabajo

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