Name: Zika Virus específico diagnóstico del epítopo descubrimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Descubre un método para identificar péptidos específicos del virus Zika mediante microarrays de alta densidad. Esta técnica permite detectar anticuerpos IgM e IgG en suero, proporcionando una línea temporal de infección útil para el diagnóstico clínico.

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Es actual apoyado por una subvención de suplemento administrativo SBIR (Small Business Innovation Research) de NIDCRR44 DE024456. Subvención NIDCR VIH que evolucionó de subvención NIDCR U01 DE017855 para el desarrollo de un diagnóstico confirmatorio de punto de atención para el VIH. Agradecemos a Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) su asistencia técnica y apoyo. También agradecemos a NYU Langone Medical Center por el LI-COR odisea sistema de imágenes.

Estos datos son parte de un estudio de investigación llevado a cabo en la Universidad de Odontología de la Universidad de Nueva York y fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de la New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Las muestras clínicas utilizadas en este estudio fueron muestras anónima utilizadas previamente para el diagnóstico y con el permiso de la Wadsworth Center de Nueva York Departamento del estado de salud, Albany, NY.
1. instalación de la corredera de Microarray ZIKV alta densidad péptido en una bandeja de incubación específica
<ol><li>Manejar lo portaobjetos de vidrio por los bordes con guantes sin polvo. Las dimensiones de la diapositiva de cristal son 75,4 mm 25,0 mm y 1 mm de espesor. Colocar el portaobjetos en la bandeja de incubación con la superficie de microarray hacia arriba.</li>
	<li>Coloque la parte brillante del sello hacia abajo sobre la superficie impresa de microarrays. Para asegurar una buena posición, se superponen los orificios para tornillos del sello y la placa base.</li>
	<li>Coloque la parte superior de la bandeja en el sello para crear una cámara de microarrays.</li>
	<li>Asegure el portaobjetos en la bandeja apretando igualmente los tornillos uno después de otro con la mano en un patrón alterno a partir de la parte superior izquierda, seguida por la parte inferior derecha. Coloque la tapa de la bandeja de incubación.</li>
</ol>2. detección de interacción antecedentes: La coloración el Microarray con anticuerpos secundarios
Nota: Utilice una pipeta para depositar las soluciones (buffers estándar y de bloqueo, anticuerpos secundarios diluidos) en la esquina de la cámara de microarrays.
<ol><li>Incubar el microarray con un tampón estándar (1 x 0,05% Tween 20 en tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4, filtrada con un filtro de 0.45 μm) (total de volumen de 2.000 μl/microarray) durante 15 min a temperatura ambiente (RT) en un agitador orbital a 140 rpm.</li>
	<li>Quitar el tampón estándar por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays. Llenan los titulares diapositiva vacía de diapositivas en blanco para evitar la ruptura de la diapositiva microarray.</li>
	<li>Bloquear el microarray con el tampón de bloqueo (volumen total de 2.000 μl/microarray) durante 60 min a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm.</li>
	<li>Retire el amortiguador de bloqueo por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.</li>
	<li>Incubar el microarray con el anticuerpo secundario, fluorocromo de IgM anti-humano conjugada, diluido 1: 5.000 (volumen total de 2.000 μl/microarrays) en la tinción del almacenador intermediario (10% de bloqueo de la memoria del buffer estándar) por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador orbital a 140 rpm.</li>
	<li>Quitar el anticuerpo secundario por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.</li>
	<li>Lavar el microarray 3 x, 1 min por lavado con tampón estándar (volumen total de 2.000 μl/microarray a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm. Después de cada lavado, quite el buffer estándar de aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.</li>
	<li>Sumerja el portaobjetos 2 x en un búfer que sumerge recién preparado (1 mM Tris, pH 7.4), (volumen total de 200 mL).</li>
	<li>Secar el microarray, aproximadamente 1 minuto, aspirando el líquido en exceso muy cuidadosamente desde la parte superior a la parte inferior de la diapositiva sin tocar la superficie del portaobjetos. Analizar la diapositiva en un lector de escáner de microarreglos.</li>
</ol>3. exposición de los microarrays para suero
PRECAUCIÓN: Realice este paso en condiciones de seguridad de laboratorio, bioseguridad nivel 2 (BSL-2) debido a la potencial naturaleza contagiosa de las muestras de suero. Trabajo dentro de una clase II gabinete de seguridad biológica (BSC).
<ol><li>Inactivar la muestra del suero a 56 ° C por 30 min y centrifugar a 16.000 rcf durante 5 minutos a 4 ° C13. Nota: Utilice una pipeta para depositar las soluciones (coloración, buffer estándar y suero diluido) en la esquina de la cámara de microarrays.</li>
	<li>Diluir la muestra de suero en tampón de tinción a partir de una dilución (volumen total de 2.000 μL/microarrays) de 1:1,000. Mantener a 4 ° C hasta su uso.</li>
	<li>Incubar el microarray con el tampón de tinción (volumen total de 2.000 μL/microarray) durante 15 min a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm.</li>
	<li>Eliminar el tampón de tinción por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.</li>
	<li>Incubar el microarray con la muestra de suero diluido durante la noche a 4 ° C en un agitador orbital a 140 rpm.</li>
	<li>Retire la muestra de suero diluido por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.</li>
	<li>Lavar el microarray 3 x, 1 min por lavado con tampón estándar (volumen total de 2.000 μL/microarray a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm. Después de cada lavado, quite el buffer estándar de aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.</li>
</ol>4. la coloración con los anticuerpos secundarios y Control etiquetado
Nota: Utilice una pipeta para depositar las soluciones (tampones estándar, secundaria diluido y etiqueta anticuerpos) en la esquina de la cámara de microarrays.
<ol><li>Diluir el anticuerpo secundario en el tampón de tinción. Nota: Fluorocromo de uso anti-human IgM conjugado anticuerpo o anticuerpo anti-humana IgG fluorocromo conjugado a la dilución de 1:5,000 (volumen total de 2.000 μl/microarrays) en tampón de tinción.</li>
	<li>Mezcla control etiqueta anticuerpo (monoclonal anti-HA fluorocromo conjugado) a una dilución de 1:1,000 (volumen total de 2 000 μl/microarrays) en tampón de tinción con anticuerpo secundario previamente diluido en tampón de tinción.</li>
	<li>Incubar con el microarray por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador orbital a 140 rpm.</li>
	<li>Retire la mezcla del secundario diluido y etiqueta anticuerpos por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.</li>
	<li>Lavar 3 veces con tampón estándar (volumen total de 2.000 μl/microarrays). Cada colada es de 1 min en un agitador orbital a 140 rpm. Después de cada lavado, quite el buffer estándar de aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.</li>
</ol>5. Análisis de Microarray
<ol><li>Sumerja el portaobjetos 2 x en búfer recién preparado de inmersión (1 mM Tris, pH 7.4) (volumen total de 200 mL).</li>
	<li>Seque el microarray cuidadosamente, alrededor de 1 minuto, aspirando muy cuidadosamente desde la parte superior a la parte inferior de la diapositiva sin tocar la superficie del portaobjetos.</li>
	<li>Análisis microarray siguiendo las instrucciones del escáner. Colocar el portaobjetos sobre el escáner con la superficie impresa hacia arriba.</li>
	<li>Cree un nuevo proyecto y seleccione el área de exploración. Definir los parámetros del escáner como: resolución: 21 μm, intensidad para canales de 700 y 800 nm: 7.0, de análisis de calidad: media y desvío: 0.8.</li>
	<li>Adquirir y guardar la imagen raw de exploración como un formato de archivo TIFF de 16 bits en escala de grises.</li>
</ol>6. Análisis de microarrays utilizando un Software específico
<ol><li>Abra la imagen raw (imagen TIFF). Abra el archivo de la red matriz.</li>
	<li>Alinee la red matriz para el análisis de imagen con teclas de flecha de ratón o el teclado del ordenador.</li>
	<li>Seleccionad "cuantificar" en el software específico, que crea un archivo de lectura que contiene la intensidad de la señal de cada punto, el valor de fondo y la correspondiente secuencia de péptido. Nota: Este archivo de salida también se puede importar en un programa de hoja de cálculo para análisis adicional y graficar.</li>
</ol>7. microarrays de almacenamiento
<ol><li>Almacenar los microarrays en la oscuridad a 4 ° C en gas libre de nitrógeno o argón oxígeno.</li>
</ol>

<ol><li>Kelser, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+dengue%27s+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Zika.+Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Meet dengue's cousin.</a> Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).</li>
<li>Musso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Zika+virus+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Detection of Zika virus in saliva.</a> J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).</li>
<li>Siqueira, W. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.oralhealthgroup.com/features/oral-clinical-manifestations-patients-infected-zika-virus/">Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus.</a> Oral Health. , (2016).</li>
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<li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+diagnostic+peptides+for+lyme+disease+through+epitope+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).</li>
<li>Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Peptide+library+screening+to+detect+a+previously+unknown+linear+diagnostic+epitope%3A+proof+of+principle+by+use+of+lyme+disease+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).</li>
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<li>Townend, J. E., Tavassoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Production+of+Cyclic+Peptide+Libraries+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli.</a> ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).</li>
<li>Turchetto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+expression+of+animal+venom+toxins+in+Escherichia+coli+to+generate+a+large+library+of+oxidized+disulphide-reticulated+peptides+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).</li>
<li>Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Peptide+Discovery%3A+Prioritization+of+Pathogen+Diagnostic+Markers+Using+Multiple+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features.</a> Plos One. 7 (12), e50748(2012).</li>
<li>Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+immunodominant+motifs+with+atypical+isotype+profile+scattered+over+the+Onchocerca+volvulus+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).</li>
<li>Basile, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+ELISA+kit+%28YF+MAC-HD%29+to+detect+IgM+to+yellow+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus.</a> J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).</li>
<li>Madden, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK153387/">The BLAST Sequence Analysis Tool.</a> The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).</li>
<li>Services, U. S. D. oH. aH. <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).</li>
<li>Pellois, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individually+addressable+parallel+peptide+synthesis+on+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips.</a> Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos diseñado un protocolo de utilización de un microarray de alta densidad péptido que contiene la secuencia de proteína de virus Zika entera (cepa Polinesia francesa). El microarray fue fabricado por péptidos lineales superpuestas diferentes 3.423 impresión. Cada péptido fue 15 aminoácidos y variados por un único residuo de su vecino más cercano en la secuencia (es decir, superposición de residuos 14). Aunque se superpone más corto puede ser impreso, Mapeo epitopo es más preciso con traslapos más. Cada péptid...

Zika virus (ZIKV) diagnosis basada en los síntomas clínicos es desafiadora porque comparte vectores, distribución geográfica y los síntomas con Dengue y Chikungunya virus infección1. Dado el riesgo de resultados adversos del embarazo en las mujeres infectadas con ZIKV durante el embarazo, es importante distinguir entre los 3 virus. Aunque las pruebas de diagnóstico moleculares actuales son específicas, son sólo útiles en sangre o saliva durante el relativamente corto período de infección aguda2,3. Análisis serológicos son esenciales para el diagnóstico fuera de este período inicial de la infección4.
El desarrollo de un ensayo serológico específico ZIKV es difícil por dos razones: en primer lugar, los Zika antígenos que el sistema inmunológico humano responde a actualmente no se conocen; y secuencias de aminoácidos de flaviviruses segundo, conservado inducen reactividad cruzada del anticuerpo. Nuestro objetivo era descubrir el únicos péptidos específicos ZIKV a utilizarse en el diagnóstico. Se han desarrollado diferentes enfoques a las bibliotecas de péptidos pantalla cubriendo todas proteínas incluyendo fagos bacterianos, y mostrar la superficie de la levadura5,6,7,8,9, 10. Nuestra estrategia era utilizar un microarray de péptidos de alta densidad que permite la rápida y de bajo costo alto rendimiento exámenes serológicos11,12 y posteriormente los péptidos identificados se pueden utilizar para mejorar la corriente serológica ensayos para la detección de infección por ZIKV.
Este protocolo permite el descubrimiento de Zika virus diagnóstico péptidos específicos con un microarray de péptidos de alta densidad (figura 1). Los microarrays de alta densidad péptido fue producido usando la tecnología de impresión de láser de péptido. La secuencia de proteína entera ZIKV consisten en residuos de aminoácidos 3.423 basado en la cepa Polinesia francesa (GenBank: KJ776791.2), fue impreso en un portaobjetos de vidrio estándar en bloques de 15 residuos lineales con una superposición de 14 residuos de aminoácidos por duplicado para un total de 6.846 puntos del péptido. Además de los péptidos de secuencia de la proteína de Zika todos el microarray utiliza hemaglutinina de Influenza (HA) péptidos para controles internos.
Una Zika validado positivo muestra de suero obtenida del centro de Wadsworth (Albany, NY), se utilizó para identificar péptidos reactivas la inmunoglobulina G (IgG) y específicos de la inmunoglobulina M (IgM). Después de la incubación con la muestra durante la noche, el microarray fue teñido con un anticuerpo conjugado del fluorocromo secundario (anti-human IgM o anti-IgG humanas) y analizado en un escáner de microarreglos. Cuantificación de intensidades spot y péptido anotación fue realizada con un software específico suministrado por la misma compañía que fabricó el microarray.

<table><tbody><tr><td>Microarray de péptidos personalizado</td><td>PEPperCHIP</td><td>PPC.001.001</td><td>Micarray de péptidos personalizado: nuestro microarray contiene toda la secuencia de proteínas del virus del Zika</td></tr><tr><td>Bandeja de incubación PEPperCHIP 3/1</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.004.001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción PEPperCHIP (680 nm) (anti-HA, etiquetado DyLight)</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.037.002</td><td></td></tr><tr><td>Analizador PepSLide</td><td>PEPperPRINT</td><td>PSA.004.001</td><td>Licencia gratuita de 14 días para Windows</td></tr><tr><td>Búfer de bloqueo Rockland</td><td></td><td>MB-070</td><td></td></tr><tr><td>IgM antihumana (cadena mu) DyLight 800</td><td>Rockland</td><td>609-145-007</td><td></td></tr><tr><td>IgG antihumana Fc DyLight 680</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10138</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Sistema de imagen</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo agitador orbital</td><td>Agitador de microtitulación</td><td></td>digital <td>IKA</td> MTS 2/4</tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltagraph</td><td>Redrocks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zika virus específico diagnóstico del epítopo descubrimiento

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Microarrays de alta densidad péptido permite detección de péptidos de más de 6 mil sobre un portaobjetos de microscopio estándar. Este método puede ser aplicado para el descubrimiento de medicamentos, identificación de objetivos terapéuticos y el desarrollo del diagnóstico. Aquí, presentamos un protocolo para descubrir Zika virus (ZIKV) diagnóstico péptidos específicos utilizando microarrays de un péptido de alta densidad. Una muestra de suero humano validada para infección por ZIKV fue incubada con una microarrays de alta densidad péptido que contiene la proteína ZIKV toda traducida en 3.423 única 15 lineal de aminoácidos (aa) los residuos con una superposición de residuos 14-aa impreso por duplicado. Coloración con los anticuerpos secundarios diferentes dentro de la misma matriz, detectamos péptidos que se unen a la inmunoglobulina M (IgM) y anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG) en suero. Estos péptidos fueron seleccionados para experimentos de validación adicionales. En este protocolo, se describe la estrategia para diseñar, procesar y analizar un microarray de péptidos de alta densidad.

Se muestran los resultados obtenidos con el protocolo descrito en la figura 2 y la figura 3. No hay interacciones de fondo fueron observadas cuando la tinción el microarray con secundario anti-humano IgM (datos no mostrados). Tinción con un anti-human IgM conjugado dio lugar a varias áreas sobre intensidades de fluorescencia verde de fondo, lo que indica la Unión de estos péptidos con IgM en la muestra de suero ...

En este protocolo, se describe una técnica para descubrir Zika virus diagnóstico péptidos específicos utilizando microarrays de un péptido de alta densidad. Este protocolo readly puede ser adaptado para otras enfermedades infecciosas emergentes.

Zika Virus específico diagnóstico del epítopo descubrimiento

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

El objetivo general de este experimento es identificar péptidos específicos del virus del Zika para su uso en un ensayo de diagnóstico para detectar anticuerpos contra el virus del Zika. Esto es fundamental, ya que el virus desaparece de la sangre en aproximadamente 10 días, mientras que los anticuerpos persisten durante años. Este método nos permite identificar antígenos y epítopos utilizando un microarray de todo el proteoma del Zika para identificar péptidos que capturan anticuerpos IgM o IgG en una muestra de suero de un individuo infectado.La principal ventaja en la detección de anticuerpos tempranos, IgM, y anticuerpos tardíos, IgG, es proporcionar al médico una línea de tiempo de la infección. Y esto es particularmente importante en las mujeres embarazadas. Si bien este protocolo proporciona información sobre la causa de la infección por el virus del Zika, se puede aplicar a otros patógenos, utilizando un microconjunto específico para ese patógeno si se conoce su secuencia de proteínas.Manipule el portaobjetos de vidrio por los bordes con guantes sin polvo. Las dimensiones del portaobjetos de vidrio son 75,4 milímetros por 25,0 milímetros y 1 milímetro de grosor. Coloque el portaobjetos en la bandeja de incubación con la superficie del microarray hacia arriba.Llene los portaobjetos vacíos con portaobjetos en blanco para evitar que el portaobjetos del microarray se rompa. Coloque el lado brillante del sello hacia abajo sobre la superficie impresa del microarray. Para asegurar una buena posición, superponga los orificios de los tornillos del sello y la placa base.Coloque la parte superior de la bandeja sobre el sello para crear una cámara de microarray. Asegure la corredera en la bandeja apretando por igual los tornillos de mariposa uno tras otro con la mano en un patrón alterno. Comience desde la parte superior izquierda y continúe hasta la parte inferior derecha.Coloque la tapa en la bandeja de incubación. El manejo cuidadoso del microarray es esencial para evitar rayar la superficie del microarray. Las soluciones se añaden y luego se retiran de la esquina de la cámara del microarray.El secado del microarray también es importante para proporcionar una buena imagen de escaneo. Incubar el microarray con 2.000 microlitros de tampón estándar por microarray durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm. Retire el tampón estándar aspirando con una pipeta desde la esquina de la cámara del microarray, luego bloquee el microarray con un tampón de bloqueo durante 60 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm.Retire el tampón de bloqueo aspirando desde la esquina de la cámara del microarray con una pipeta. Añada al microarray anticuerpo secundario conjugado IgM fluorocromo humano diluido 1:5.000 en el tampón de tinción. A continuación, incubar el microarray durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador orbital a 140 rpm.Utilice una pipeta para extraer el anticuerpo secundario aspirando desde la esquina de la cámara del microarray. Lave el microarray durante un minuto con 2000 microlitros con tampón estándar por microarray a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm. Retire el tampón estándar utilizando la técnica demostrada y repita el lavado dos veces.A continuación, sumerja el portaobjetos dos veces en 200 mililitros de un tampón para mojar recién preparado. Seque el microarray cuidadosamente durante aproximadamente un minuto aspirando el exceso de líquido con mucho cuidado desde la parte superior hasta la parte inferior del portaobjetos sin tocar la superficie del portaobjetos. Analice el portaobjetos en un lector de escáner de microarrays, como se muestra más adelante en este vídeo.Inactivar la muestra de suero a 56 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, centrifugar la muestra a 16.000 RCF durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Mantenga la muestra a cuatro grados centígrados hasta su uso.A continuación, incubar el microarray con el tampón de tinción durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm. Retire el tampón de tinción aspirando desde la esquina de la cámara del microarray con una pipeta. Diluya la muestra de suero y el tampón de tinción comenzando con una dilución de 1:1.000.Incubar la muestra diluida con el microarray durante la noche a cuatro grados centígrados en un agitador orbital a 140 rpm. Extraer la muestra de suero diluida utilizando la técnica demostrada. A continuación, lave el microarray tres veces como antes.Diluya el anticuerpo secundario en el tampón de tinción. Utilice un anticuerpo conjugado anti-IgM fluorocromo humano o un anticuerpo conjugado anti-IgG fluorocromo humano en una dilución de 1:5.000 en tampón de tinción. A continuación, mezcle el anticuerpo marcado con el control a una dilución de 1:1000 en tampón de tinción con el anticuerpo secundario diluido.Incubar con el microarray durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y en un agitador orbital a 140 rpm. Retire la mezcla de anticuerpos secundarios diluidos y marcados aspirando desde la esquina de la cámara del microarray con una pipeta. A continuación, lave el microarray tres veces con tampón estándar.Cada lavado es de un minuto en un agitador orbital a 140 rpm. Por último, retire el tampón de lavado de la cámara del microarray como antes. Para realizar el escaneo de microarrays, sumerja el portaobjetos dos veces en 200 mililitros de tampón de inmersión recién preparado.Seque el microarray durante aproximadamente un minuto aspirando con mucho cuidado desde la parte superior hasta la parte inferior del portaobjetos sin tocar la superficie del portaobjetos. Escanee el microarray siguiendo las instrucciones del escáner. Coloque la diapositiva en el escáner con la superficie impresa hacia arriba.Cree un nuevo proyecto y seleccione el área de escaneo. Establezca los parámetros del escáner con una resolución de 21 micras, una intensidad de 7,0 para los canales de 700 y 800 nanómetros, una calidad de escaneo media y un desplazamiento de 0,8. Adquiera y guarde la imagen del dibujo escaneado como un formato de archivo TIF en escala de grises de 16 bits.Para analizar los datos, abra la imagen sin procesar. A continuación, abra el archivo de cuadrícula de la matriz. Alinee la cuadrícula de la matriz con la imagen escaneada con las teclas de flecha del mouse o del teclado de la computadora.Seleccione cuantificar selección en el software específico, que crea un archivo de lectura que contiene la intensidad de la señal para cada punto, el valor de fondo y la secuencia peptídica correspondiente. Por último, almacene el microarray sellado en la oscuridad a cuatro grados centígrados bajo nitrógeno libre de oxígeno o gas argón. Aquí se muestra la imagen de fluorescencia sin procesar de la tinción del microarray con IgG antihumana después de la incubación con una muestra de suero específica del virus del Zika diluida 1:250.Los péptidos de control de HA enmarcan el microarray. Los péptidos que reaccionan fuertemente a la IgG se muestran en el panel de zoom. De manera similar, aquí se muestra una imagen de fluorescencia sin procesar de la tinción del microarray con IgM antihumana después de la incubación con una muestra de suero específica del virus del Zika diluida 1:250.Una vez más, los péptidos de control de HA enmarcan el microarray. Los péptidos que reaccionan fuertemente a la IgM se muestran en el panel de zoom. Aquí se muestra una secuencia representativa de consenso del epítopo del virus del Zika que reacciona con IgM en los péptidos de la muestra de suero del huésped.Los péptidos de la secuencia de consenso del epítopo se resaltan en rojo y el péptido con la intensidad de fluorescencia más alta se marca en negrita. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo procesar un microarray de péptidos de alta densidad. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 24 horas si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular con cuidado el microarray para evitar rayar la superficie del microarray. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como ELISA o un ensayo de unión por resonancia de plasmón de superficie para determinar si los péptidos identificados se unen específicamente a los anticuerpos contra el virus del Zika y no a otros anticuerpos contra el Flavivirus. Tras su desarrollo, esta técnica allanará el camino a los investigadores en el campo del diagnóstico para el descubrimiento de péptidos de diagnóstico utilizando muestras de suero y saliva.No olvide que trabajar con agentes infecciosos como el virus del Zika puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la inactivación del calor de la muestra de suero y el trabajo en instalaciones de nivel de bioseguridad 2 mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El virus del Zika (ZIKV), un patógeno emergente, está relacionado con anomalías del desarrollo fetal y microcefalia. El establecimiento de un sistema eficaz de cultivo de células infecciosas es crucial para los estudios de replicación del ZIKV, así como para el desarrollo de vacunas y fármacos. En este estudio, se ilustran y discuten varios ensayos virológicos relacionados con el ZIKV.

Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em&gt; In Vitro</em&gt; Profiláctica Efecto de los interferones

Aquí, los autores presentan un protocolo simple y eficiente para definir un epítopo antigénico lineal utilizando un anticuerpo monoclonal purificado y escaneo de péptidos a través de hibridación dot-blot. El epítopo identificado puede utilizarse en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas.

La identificación de un epítopo lineal de células B reconocido por anticuerpos monoclonales péptido Escaneo-asistida

Este protocolo describe la recuperación del virus Zika infeccioso a partir de un clon de ADNc infeccioso de dos plásmidos.

Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone

Corriente de multiplexado de diagnóstico para detectar los Zika, chikungunya y dengue virus requieren preparación compleja y costosa instrumentación y son difíciles de usar en entornos de bajos recursos. Se muestra un diagnóstico que utiliza amplificación isotérmica con sondas desplazable filamento blanco específico para detectar y diferenciar estos virus con alta sensibilidad y especificidad.

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Se describe un protocolo para evaluar las respuestas de células T antígeno específicas en los órganos de immunoprivileged del Ifnar1- / - modelo murino para la infección del virus (ZIKV) Zika. Este método es fundamental para la investigación de los mecanismos celulares de la protección y la inmunopatogénesis de las vacunas ZIKV y también es valiosa para la evaluación de su eficacia.

Evaluación de respuestas de células T Zika Virus-específica en Immunoprivileged órganos de ratones- / - Ifnar1 infectados

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En este trabajo, describimos los protocolos utilizados en los ensayos basados en replicon y en enzimas virales para detectar inhibidores de la replicación del virus del Zika en un formato de detección de alto rendimiento.

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Los inmunoensayos de fluorescencia multiplex se están convirtiendo en una referencia para las pruebas serológicas. Sin embargo, su aplicación está limitada por la complejidad y los procesos de acoplamiento de perlas-analitos que requieren mucho tiempo. Este informe presenta un protocolo de acoplamiento de microesferas multiplex semiautomatizado y reproducible que es comparable al método estándar y reduce considerablemente el tiempo de obtención de resultados.

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Zika Virus específico diagnóstico del epítopo descubrimiento

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