Zika Virus específico diagnóstico del epítopo descubrimiento

El objetivo general de este experimento es identificar péptidos específicos del virus del Zika para su uso en un ensayo de diagnóstico para detectar anticuerpos contra el virus del Zika. Esto es fundamental, ya que el virus desaparece de la sangre en aproximadamente 10 días, mientras que los anticuerpos persisten durante años. Este método nos permite identificar antígenos y epítopos utilizando un microarray de todo el proteoma del Zika para identificar péptidos que capturan anticuerpos IgM o IgG en una muestra de suero de un individuo infectado.

La principal ventaja en la detección de anticuerpos tempranos, IgM, y anticuerpos tardíos, IgG, es proporcionar al médico una línea de tiempo de la infección. Y esto es particularmente importante en las mujeres embarazadas. Si bien este protocolo proporciona información sobre la causa de la infección por el virus del Zika, se puede aplicar a otros patógenos, utilizando un microconjunto específico para ese patógeno si se conoce su secuencia de proteínas.

Manipule el portaobjetos de vidrio por los bordes con guantes sin polvo. Las dimensiones del portaobjetos de vidrio son 75,4 milímetros por 25,0 milímetros y 1 milímetro de grosor. Coloque el portaobjetos en la bandeja de incubación con la superficie del microarray hacia arriba.

Llene los portaobjetos vacíos con portaobjetos en blanco para evitar que el portaobjetos del microarray se rompa. Coloque el lado brillante del sello hacia abajo sobre la superficie impresa del microarray. Para asegurar una buena posición, superponga los orificios de los tornillos del sello y la placa base.

Coloque la parte superior de la bandeja sobre el sello para crear una cámara de microarray. Asegure la corredera en la bandeja apretando por igual los tornillos de mariposa uno tras otro con la mano en un patrón alterno. Comience desde la parte superior izquierda y continúe hasta la parte inferior derecha.

Coloque la tapa en la bandeja de incubación. El manejo cuidadoso del microarray es esencial para evitar rayar la superficie del microarray. Las soluciones se añaden y luego se retiran de la esquina de la cámara del microarray.

El secado del microarray también es importante para proporcionar una buena imagen de escaneo. Incubar el microarray con 2.000 microlitros de tampón estándar por microarray durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm. Retire el tampón estándar aspirando con una pipeta desde la esquina de la cámara del microarray, luego bloquee el microarray con un tampón de bloqueo durante 60 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm.

Retire el tampón de bloqueo aspirando desde la esquina de la cámara del microarray con una pipeta. Añada al microarray anticuerpo secundario conjugado IgM fluorocromo humano diluido 1:5.000 en el tampón de tinción. A continuación, incubar el microarray durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador orbital a 140 rpm.

Utilice una pipeta para extraer el anticuerpo secundario aspirando desde la esquina de la cámara del microarray. Lave el microarray durante un minuto con 2000 microlitros con tampón estándar por microarray a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm. Retire el tampón estándar utilizando la técnica demostrada y repita el lavado dos veces.

A continuación, sumerja el portaobjetos dos veces en 200 mililitros de un tampón para mojar recién preparado. Seque el microarray cuidadosamente durante aproximadamente un minuto aspirando el exceso de líquido con mucho cuidado desde la parte superior hasta la parte inferior del portaobjetos sin tocar la superficie del portaobjetos. Analice el portaobjetos en un lector de escáner de microarrays, como se muestra más adelante en este vídeo.

Inactivar la muestra de suero a 56 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, centrifugar la muestra a 16.000 RCF durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Mantenga la muestra a cuatro grados centígrados hasta su uso.

A continuación, incubar el microarray con el tampón de tinción durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm. Retire el tampón de tinción aspirando desde la esquina de la cámara del microarray con una pipeta. Diluya la muestra de suero y el tampón de tinción comenzando con una dilución de 1:1.000.

Incubar la muestra diluida con el microarray durante la noche a cuatro grados centígrados en un agitador orbital a 140 rpm. Extraer la muestra de suero diluida utilizando la técnica demostrada. A continuación, lave el microarray tres veces como antes.

Diluya el anticuerpo secundario en el tampón de tinción. Utilice un anticuerpo conjugado anti-IgM fluorocromo humano o un anticuerpo conjugado anti-IgG fluorocromo humano en una dilución de 1:5.000 en tampón de tinción. A continuación, mezcle el anticuerpo marcado con el control a una dilución de 1:1000 en tampón de tinción con el anticuerpo secundario diluido.

Incubar con el microarray durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y en un agitador orbital a 140 rpm. Retire la mezcla de anticuerpos secundarios diluidos y marcados aspirando desde la esquina de la cámara del microarray con una pipeta. A continuación, lave el microarray tres veces con tampón estándar.

Cada lavado es de un minuto en un agitador orbital a 140 rpm. Por último, retire el tampón de lavado de la cámara del microarray como antes. Para realizar el escaneo de microarrays, sumerja el portaobjetos dos veces en 200 mililitros de tampón de inmersión recién preparado.

Seque el microarray durante aproximadamente un minuto aspirando con mucho cuidado desde la parte superior hasta la parte inferior del portaobjetos sin tocar la superficie del portaobjetos. Escanee el microarray siguiendo las instrucciones del escáner. Coloque la diapositiva en el escáner con la superficie impresa hacia arriba.

Cree un nuevo proyecto y seleccione el área de escaneo. Establezca los parámetros del escáner con una resolución de 21 micras, una intensidad de 7,0 para los canales de 700 y 800 nanómetros, una calidad de escaneo media y un desplazamiento de 0,8. Adquiera y guarde la imagen del dibujo escaneado como un formato de archivo TIF en escala de grises de 16 bits.

Para analizar los datos, abra la imagen sin procesar. A continuación, abra el archivo de cuadrícula de la matriz. Alinee la cuadrícula de la matriz con la imagen escaneada con las teclas de flecha del mouse o del teclado de la computadora.

Seleccione cuantificar selección en el software específico, que crea un archivo de lectura que contiene la intensidad de la señal para cada punto, el valor de fondo y la secuencia peptídica correspondiente. Por último, almacene el microarray sellado en la oscuridad a cuatro grados centígrados bajo nitrógeno libre de oxígeno o gas argón. Aquí se muestra la imagen de fluorescencia sin procesar de la tinción del microarray con IgG antihumana después de la incubación con una muestra de suero específica del virus del Zika diluida 1:250.

Los péptidos de control de HA enmarcan el microarray. Los péptidos que reaccionan fuertemente a la IgG se muestran en el panel de zoom. De manera similar, aquí se muestra una imagen de fluorescencia sin procesar de la tinción del microarray con IgM antihumana después de la incubación con una muestra de suero específica del virus del Zika diluida 1:250.

Una vez más, los péptidos de control de HA enmarcan el microarray. Los péptidos que reaccionan fuertemente a la IgM se muestran en el panel de zoom. Aquí se muestra una secuencia representativa de consenso del epítopo del virus del Zika que reacciona con IgM en los péptidos de la muestra de suero del huésped.

Los péptidos de la secuencia de consenso del epítopo se resaltan en rojo y el péptido con la intensidad de fluorescencia más alta se marca en negrita. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo procesar un microarray de péptidos de alta densidad. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 24 horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular con cuidado el microarray para evitar rayar la superficie del microarray. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como ELISA o un ensayo de unión por resonancia de plasmón de superficie para determinar si los péptidos identificados se unen específicamente a los anticuerpos contra el virus del Zika y no a otros anticuerpos contra el Flavivirus. Tras su desarrollo, esta técnica allanará el camino a los investigadores en el campo del diagnóstico para el descubrimiento de péptidos de diagnóstico utilizando muestras de suero y saliva.

No olvide que trabajar con agentes infecciosos como el virus del Zika puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la inactivación del calor de la muestra de suero y el trabajo en instalaciones de nivel de bioseguridad 2 mientras se realiza este procedimiento.