Name: Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprende a producir células NK murinas de alta pureza mediante un sistema libre de alimentadores usando médium condicionado OP9. Este método facilita estudios de inmunología innata y terapia contra el cáncer.

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Este estudio fue apoyado por la investigación subvenciones Consejo de Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/FRC/12R) y la innovación y tecnología fondo de Hong Kong (15/227/ITS, ITS InP/164/16, su-InP/242/16), la subvención directa para investigación-CUHK (2016.035) y erudito de Hong Kong Programa.
H. Y.L. diseñados y supervisados todos los experimentos y contribuyó a la preparación del manuscrito. P.M.-K.T. realizó experimentos, analizar datos y contribuyó a la preparación del manuscrito. P.C.-T. T., J.Y.-F.C., J.S.-C., H., p.-M.W., y G. Y.L. recolectó muestras animales y participó en los experimentos con animales. J.S., X.-RH, y K. F.T. contribuyó a la preparación del manuscrito.

El protocolo para la obtención y diferenciación NK médula ósea células (BM-NK) se basa en métodos previamente publicados20,21,22. Todos los procedimientos con los ratones han sido aprobados por el Animal ética Experimental Comité (AEEC) en la Universidad China de Hong Kong.
1. preparación del medio condicional OP9
<ol><li>Cultura de la línea de celular del estroma murino OP9 en alfa-MEM que contiene 20% FBS, 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 μg/mL, a 37 ° C en una atmósfera humidificada de aire/CO2 (95%: 5%).<ol>
<li>Contar las células con un hemocitómetro, luego semilla 2 x 106 células OP9 a cada frasco de cultivo de 75 cm2 con 15 mL de medio. Cultivo de 48 h.</li>
		<li>Cuando la cultura llega a 80% de confluencia, lavar el matraz con 10 mL de PBS y añadir 20 mL de llano medio alfa-MEM (sin antibióticos y FBS) por frasco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger medio OP9 condición del frasco de cultivo a las 24 h, limpieza de restos celulares con 0.25 μm filtro de polyethersulfone (PES) y conservar a 4 ° C (dentro de 2 semanas de uso).</li>
</ol>2. aislamiento de células de médula ósea de ratón
<ol><li>Eutanasia el ratón C57BL/6J 12 semanas de edad con una sobredosis de compuesto (100 mg/kg, inyección intraperitoneal). Confirman muerte por la falta de respiración, luego recoger los huesos de fémur con un corte de cuchillo quirúrgico en las uniones entre los huesos y retirar los músculos restantes con la hoja rascado suave.</li>
	<li>Colocar los huesos en un tubo de centrífuga de 50 mL que contiene alfa-MEM estéril enfriado y luego realice los siguientes pasos en un gabinete de bioseguridad.</li>
	<li>Deseche el medio alfa-MEM y enjuague los huesos con etanol al 70% durante 30 s.</li>
	<li>Lavar los huesos con PBS estéril helado dos veces para limpiar el etanol restante.</li>
	<li>Transferencia de los huesos en un mortero que contenga 5 mL de PBS helado y suavemente fragmentan los huesos con un mortero (no les pulverizar).</li>
	<li>Agite los huesos suavemente agitando la mano del mortero para liberar las células de médula ósea en el PBS. Recoger las células de la médula ósea que contiene PBS en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Repita el paso 2.6 para cuatro veces hasta que los fragmentos de hueso sólido blanco en color.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 465 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado con 18 mL de agua destilada estéril y dejar reposar durante 30 s para eliminar las células de sangre rojas.</li>
	<li>Añadir 2 mL de helado 10 X PBS para detener la reacción, luego filtrar la mezcla por un colador de celular de 70 μm para eliminar los eritrocitos sometidos a lisis.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 465 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado con 20 mL de PBS helado.</li>
	<li>Lavar las células repetir paso 2.11 una segunda vez.</li>
	<li>Transferir el precipitado de células en un 100 mm estériles caja Petri con 10 mL de medio condicional OP9 de paso 1.2 suplementado con 20% FBS y una mezcla de 0,5 ng/mL murino IL-7, 30 ng/mL ratón SCF y 100 U/mL flt3L murino.</li>
	<li>Incubar la placa a 37 ° C con 5% CO2 para 2 h. transferencia las células sueltas en un nuevo contenedor de cultivo a una densidad de 5 x 105 células viables/mL (conteo de células por hemocitómetro con exclusión azul de tripano) con la misma fórmula medio como en el paso 2.13 e incubar a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>El día 4, cambio la condición de la cultura al medio condicional OP9 había suplementado con 20% FBS y 2.000 U/mL de IL-2 murino.</li>
	<li>Refrescar el medio de cultivo cada 3 días; células NK maduras pueden ser obtenidas por día 7 y calificadas como en sección 4.</li>
</ol>3. mediada por siRNA Gene Silencing de diferenciación de las células de NK
<ol><li>Mezcla preparada de antemano del siRNA o absurdo control (NC) con un agente de transfección según el manual del producto.</li>
	<li>Realizar paso 3.1 en cualquier momento desde el día 0.</li>
	<li>Agregar los 50 nM de siRNA o mezcla de NC a las células de paso 2.14.</li>
	<li>Repita el paso 3.1 en cada refresco mediano (p. ej., día 0, 4 y 7) hasta el punto final experimental.</li>
</ol>4. Análisis de la diferenciación de las células NK mediante citometría de flujo
<ol><li>En un momento apropiado recoger la suspensión de diferenciar las células y lavar con PBS helado.</li>
	<li>Fijar las células con buffer de fijación celular según el manual del producto.</li>
	<li>Lavar las células fijas con PBS helado y luego resuspender 1 x 106 células en 100 μl de tampón de tinción de citometría flujo con Cy3-conjugado anti-ratón NKp46 PE-conjugado anti-ratón CD244 anticuerpos y en una relación de dilución de 1: 100.</li>
	<li>Mancha de la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 h.</li>
	<li>Resuspender las muestras teñidas con 300 μL de PBS, luego adquirir datos FACS y analizar con Cytobank plataforma20 (http://cytobank.org/).</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li>
<li>Rusakiewicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+infiltrates+are+prognostic+factors+in+localized+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).</li>
<li>Mamessier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+enhance+self+tolerance+by+promoting+evasion+from+NK+cell+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).</li>
<li>Stern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-emptive+immunotherapy+with+purified+natural+killer+cells+after+haploidentical+SCT%3A+a+prospective+phase+II+study+in+two+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers.</a> Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+adoptive+transfer+and+in+vivo+expansion+of+human+haploidentical+NK+cells+in+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer.</a> Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).</li>
<li>Rubnitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKAML%3A+a+pilot+study+to+determine+the+safety+and+feasibility+of+haploidentical+natural+killer+cell+transplantation+in+childhood+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia.</a> J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).</li>
<li>Curti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfer+of+alloreactive+haploidentical+KIR+ligand-mismatched+natural+killer+cells+after+infusion+in+elderly+high+risk+acute+myeloid+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients.</a> Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li>
<li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li>
<li>Rouce, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSMAD+pathway+is+an+important+mechanism+for+NK+cell+immune+evasion+in+childhood+B-acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).</li>
<li>Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+tumor+suppression+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression.</a> Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18662538">TGFbeta in cancer.</a> Cell. 134 (2), 215-230 (2008).</li>
<li>Ikushima, H., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signalling%3A+a+complex+web+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).</li>
<li>Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+TGF%CE%B2+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The roles of TGFβ in the tumour microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).</li>
<li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells%3A+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li>
<li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li>
<li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-%CE%B3+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li>
<li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1436033">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li>
<li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytobank%3A+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li>
<li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+NK1.1%2B%2C+Ly49%2B+NK+cells+from+flt3%2B+multipotent+marrow+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li>
<li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En el presente trabajo, hemos descrito un nuevo método para la producción de células NK murinas derivadas de médula ósea in vitro. El alimentador de la célula en el sistema original21,22 es substituido con éxito por el medio condicionado de OP9 células, que aumenta en gran medida la estabilidad del sistema de diferenciación. Además, el sistema puede producir alta cantidad y pureza de NK madura las células para en vitro como en vivo ensa...

La progresión del cáncer depende en gran medida de la tumor microambiente1,2, incluyendo immunocytes derivados de host, por ejemplo, las células NK. Varios estudios demostraron que las células NK intratumoral están negativamente correlacionadas con la progresión de tumor3,4. Además, los estudios clínicos demostraron que la terapia adoptiva con células NK es una posible estrategia para cáncer5,6,7,8,9. Inmunoterapia de cáncer basado en la célula NK fue sugerida recientemente como una opción terapéutica para tumores sólidos, pero existen desafíos debido a la secreción de citocinas inmunosupresoras y downregulation de la activación de ligandos en el microambiente de tumores sólidos 10,11. Transformación de factor de crecimiento β (TGF-β) se ha sugerido para desempeñar un papel represivo en la carcinogénesis, pero paradójicamente las células cancerosas también producen TGF-β1 para apoyar el desarrollo de tumor12,13,14 , 15. señalización de TGF-β puede suprimir la actividad citolítica de las células NK a través de la abajo-regulación de la respuesta de interferón y CD16 mediada por interferón-gamma (IFN-γ) producción en vitro16,17, 18.
Aunque interrupción de señalización de TGF-β en el microambiente del tumor puede ser una forma para eliminar el cáncer, bloqueando totalmente la señalización de TGF-β causará enfermedades autoinmunes debido a su función antiinflamatoria, según lo evidenciado por el desarrollo de efectos secundarios adversos incluyendo la inflamación sistémica, defectos cardiovasculares y autoinmunidad en ratones modelos19. Por lo tanto, comprender el mecanismo de trabajo de inmunosupresión mediada por el TGF-β conducirá a la identificación de una diana terapéutica accesible para tratar el cáncer.
Para dilucidar los eventos moleculares necesarios para el desarrollo de las células NK, Williams et al. estableció un sistema in vitro para diferenciar células madre hematopoyéticas de médula ósea murina en NK células20. Este sistema facilita en gran medida el estudio mecanicista del desarrollo de las células NK, incluyendo la identificación de nuevos progenitores de las células NK21. Sin embargo, los progenitores de médula ósea se deben cultivar en el sistema con el apoyo de las células stromal OP9 como un alimentador capa20,21, y esta población celular heterogénea limita en gran medida el uso adicional de alterar gen herramientas (p. ej., silenciamiento génico mediado por siRNA) específicamente aplicada a las células NK diferenciadoras.
Aquí, describimos un sistema libre de alimentación que ha sido desarrollado por más modificar el sistema en vitro de Williams et al20. En nuestro sistema, las células stromal alimentador de OP9 no están obligatorio, y en su lugar OP9 medio condicional se utiliza sin afectar a la diferenciación de las células NK en vitroy recientemente nos llevan a descubrir que el TGF-β es capaz de promover la progresión del cáncer a través de suprimir el desarrollo de las células NK E4bp4 dependientes del microambiente tumoral del22. Este novedoso sistema con éxito proporciona un método libre de antecedentes para dilucidar el mecanismo molecular del desarrollo de las células NK en condiciones específicas (p. ej., alta TGF-β1, mediada por siRNA silenciamiento, etcetera.) en vitro.

<table><tbody><tr><td>Línea celular OP9</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CRL-2749&comercio; </td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, sin nucleósidos</td><td>Gibco</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco 10500064</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Murina recombinante IL-7</td><td>PEPROTECH</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Murina recombinante SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>Murina recombinante Flt3-Ligando</td><td>PEPROTECH</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Murino IL-2</td><td>PEPROTECH</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX Reactivo de Transfección</td><td>Invitrogen</td><td>1377815</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fijación IC&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-8222-49</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de tinción por citometría de flujo&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón conjugado con PE CD244</td><td>eBioscience</td><td>12-2441-83</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón conjugado con Cy3 NKp46</td><td>Bioss</td><td>bs-2417R-cy3</td><td></td></tr><tr><td>Control sin sentido (NC)</td><td>Ribobio</td><td>siN05815122147</td><td></td></tr><tr><td>siRNA contra ratón E4BP4 mRNA</td><td>Ribobio</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& primo;</td></tr></tbody></table>

un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos in vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) las células pertenecen al sistema inmune innato y son una defensa inmune de primera línea contra el cáncer; sin embargo, se suprimen en el microambiente del tumor y el mecanismo subyacente es todavía desconocido. La falta de una fuente constante y confiable de las células NK limita el progreso de la investigación de la inmunidad de la célula NK. Aquí, Divulgamos un sistema en vitro que puede proporcionar alta calidad y la cantidad de médula ósea murina las células NK en una condición libre de alimentador. Más importante aún, demostramos que con éxito mediada por siRNA silenciamiento inhibe la maduración de la célula NK E4bp4 dependientes mediante el uso de este sistema. Así, esta novela en vitro NK célula diferenciando el sistema es una solución de biomaterial para la investigación de la inmunidad.

Resultados representativos se obtienen siguiendo el protocolo descrito. Las células de suspensión total de la médula se cultivaron bajo el sistema de diferenciación alimentador-libre durante 11 días; se observó aumento significativo en la tasa de proliferación por día 7 en comparación con el número de células totales en el día 0 (figura 1A). Las células NK maduras con alto cociente nuclear a citoplasmática y citoplasma rico en gránulos morfol...

Aquí, presentamos un protocolo para producir en masa las células murinas de silenciamiento génico NK usando un sistema de diferenciación libre de alimentador para estudios mecanísticos in vitro e in vivo.

Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

El objetivo general de este novedoso sistema sin alimentadores es proporcionar un método para producir en masa células asesinas naturales de alta pureza para ensayos in vitro e in vivo. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave de la inmunología innata, incluido el desarrollo de células asesinas naturales y la inmunidad contra el cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que este novedoso sistema sin alimentador puede aumentar en gran medida la pureza de las células asesinas naturales producidas.Esto facilita significativamente los siguientes ensayos in vitro e in vivo. La indicación de esta técnica se extiende a la inmunidad asesina natural porque la producción masiva de células asesinas naturales murinas se puede producir a partir de la médula ósea de pacientes con cáncer para su análisis y modificación para la inmunoterapia personal. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el medio consumido debe recogerse de la célula OP9 que está experimentando un crecimiento en la fase de carga.La demostración facial de este método es fundamental, ya que los pasos de instrucción de la médula ósea son difíciles de aprender, ya que los hue

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente y purificar una gran cantidad de células NK humanos y evaluar su función.

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

Este video muestra una técnica para la expansión de células asesinas naturales (NK) directamente desde células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando una línea celular alimentadora. Las PBMC se cocultivan con células alimentadoras linfoblastoides modificadas genéticamente que expresan interleucina-21 unida a la membrana (mIL-21), y el cultivo se complementa con las citocinas interleucina-2 (IL-2) e interleucina-15 (IL-15). En conjunto, este cóctel de ligandos conduce a la...

Expansión ex vivo de células asesinas naturales a partir de células mononucleares de sangre periférica

Este protocolo describe el desarrollo, la expansión, y en la formación de imágenes in vivo de células NK derivadas de hESCs y iPSCs.

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

En este estudio presentamos un sistema de cultivo in vitro que puede generar eficientemente pDCs mediante el co-cultivo de progenitores linfoides comunes con células alimentadoras AC-6 en presencia de ligando Flt3.

En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6

Aquí presentamos un protocolo adaptado que se puede utilizar para generar un gran número de células T asesinas naturales invariantes murinas a partir del bazo de ratón. El protocolo describe un enfoque mediante el cual las células iNKT esplénicas pueden enriquecerse, aislarse y expandirse in vitro utilizando un número limitado de animales y reactivos.

Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo

Describimos un protocolo rápido y robusto para enriquecer células T asesinas naturales invariantes (iNKT) del bazo de ratón y expandirlas in vitro a números adecuados para estudios in vitro e in vivo.

Purificación y expansión de células T asesinas naturales invariantes de ratón para estudios in vitro e in vivo

Aquí, presentamos un método para expandir el asesino natural de sangre periférica (PBNK), las células NK de los tejidos hepáticos y las células NK del receptor de antígeno quimérico (CAR) derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o sangre del cordón umbilical (CB). Este protocolo demuestra la expansión de las células NK y CAR-NK utilizando células alimentadoras 221-mIL-21, además de la pureza optimizada de las células NK expandidas.

Método de expansión celular Natural Killer (NK) y CAR-NK utilizando línea de células B modificada con IL-21 unida a la membrana

El presente protocolo muestra cómo diferenciar las células CD3−/CD45+CD56+ con citotoxicidad leve de las células madre humanas de potencial expandido (hEPSC) en condiciones de cultivo 3D y 2D. Esto permite la validación fenotípica rutinaria sin la destrucción del microambiente complejo.

Generación de células asesinas naturales a partir de células madre humanas de potencial expandido

Las vesículas extracelulares derivadas de células asesinas naturales (NK-EV) tienen un potencial prometedor como bioterapéuticos contra el cáncer. Este estudio basado en la metodología presenta un flujo de trabajo de biofabricación escalable de circuito cerrado diseñado para producir y aislar continuamente grandes cantidades de NK-EV de alta pureza. Las pruebas de control durante el proceso se realizan en todo el flujo de trabajo de biofabricación, lo que garantiza que los vehículos eléctricos...

Flujo de trabajo de biofabricación escalable para producir y aislar bioterapéuticos contra el cáncer basados en vesículas extracelulares derivados de células asesinas naturales

Este protocolo describe un método escalable para la expansión de productos de Terapias Celulares Adoptivas (ACT), concretamente células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR)-T y células Killer inducidas por citocinas (CIK), utilizando dispositivos de expansión rápida permeable a gas (G-Rex), demostrando un crecimiento eficiente y robusto en un entorno clínicamente relevante.

Generación eficiente y rápida de células asesinas inducidas por CAR-T e citocinas en dispositivos escalables por GMP

Aprende a producir células NK murinas de alta pureza mediante un sistema libre de alimentadores usando médium condicionado OP9. Este método facilita estudios de inmunología innata y terapia contra el cáncer.

Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

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