Name: Protocolo experimental para detectar la función mitocondrial en hepatocitos expuestos a plaguicidas organoclorados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a evaluar la función mitocondrial en hepatocitos HepG2 expuestos a plaguicidas organoclorados mediante sondas fluorescentes y citometría de flujo. Este método permite analizar niveles de ATP y consumo de oxígeno.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant Nos. 81573174, 81570574); el Fondo Para la Juventud Sobresaliente de la Provincia de Jiangsu (SBK2014010296); el Proyecto de Investigación del Ministerio de Educación de China (213015A); el Desarrollo prioritario del Programa Académico de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD), el desarrollo principal emblemático de las instituciones de educación superior de Jiangsu; y el Programa de Proyectos Abiertos del Laboratorio Estatal clave de Química Ambiental y Ecotoxicología (KF2015-01).

Todos los experimentos y los protocolos del experimento se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes y fueron aprobados por el Comité ético local de la Universidad Médica de Nanjing.
1. Ultraestructura mitocondrial por TEM
<ol><li>Recolección de células HepG2<ol>
<li>Células HepG2 de semilla en platos de 100 mm. Conservar a 37oC y 5% de CO2.</li>
		<li>Disetique las células con 0,25% EDTA en tubo de 1,5 mLEP.</li>
		<li>Centrífuga a 1000 x g durante 3 min a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Recoger 4-6 x 105 células HepG2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 1 ml de glutaraldehído al 5% (Solvente: agua doble destilada) con pipetas e incubar a 4oC durante 2 h.</li>
	<li>Añadir y lavar en 4 cambios de 1 ml de tampón de fosfato (que contiene Na2HPO4, KH2PO4, NaCl y KCl, pH 7.4), 15 min cada uno. Succionar el tampón de fosfato con pipetas.</li>
	<li>Añadir 200 m de 1% de osmio (solvente: agua destilada doble) e incubar a 4oC durante 2 h a muestra negra. Precaución: El osmio es una sustancia altamente tóxica y volátil. Debe ser operado en el gabinete de drogas con cuidado.</li>
	<li>Añadir y lavar en 2 cambios de 1 ml de tampón de fosfato, 5 min cada uno. Succionar el tampón de fosfato.</li>
	<li>Mancha en 2% solución de acetato de uranilo (Solvent: agua destilada doble y ácido acético) en tubo EP de 1,5 ml durante 2 h.</li>
	<li>Deshidratar y sumergir a través de 50% de acetona, 70% acetona, 90% acetona (Solvente: doble agua destilada), 2 cambios de acetona absoluta, 15 min cada uno.</li>
	<li>Penetra en 2 gotas de acetona (100%)/agente de incrustación (1:1) durante 1,5 h en RT. Epon812 agente de incrustación, la receta es la siguiente: A: Epon812, 62 mL y DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL y MNA 89 mL. A:B-2:8 (v:v, en invierno), A:B-1:9 (v:v, en verano). Incrustar en moldes de incrustación (placa de plástico suave con rejilla a cuadros).</li>
	<li>Incubar secuencialmente a 37oC durante 12 h, 45oC durante 12 h y luego 60oC durante 48 h.</li>
	<li>Preparar y observar secciones ultrafinas (el área más grande no puede superar los 0,5 mm a 0,3 mm) mediante secciones ultrafinas de máquina y TEM (2 m y 500 nm).</li>
</ol>2. Detección de intensidad de fluorescencia mitocondrial
<ol><li>Semilla 2x 104 células HepG2 en placas de 6 pozos. Añadir -HCH durante 24 h.</li>
	<li>Añadir DMSO anhidro para formular una concentración final de sonda fluorescente verde mitocondrial de 1 mM.</li>
	<li>Añadir 1 ml de solución de sonda fluorescente verde mitocondrial (concentración final: 200 nM) a cada pozo de placas de 6 pozos, incubar a 37 oC durante 45 min.</li>
	<li>Retire la solución de sonda fluorescente verde mitocondrial y agregue un medio de cultivo celular recién preparado (DMEM) a 37 oC antes de la toma de imágenes.</li>
	<li>Observe la fluorescencia verde mitocondrial por un microscopio de fluorescencia (10x). La longitud de onda máxima de excitación en la detección es de 490 nm y la longitud de onda de emisión máxima es de 516 nm.</li>
</ol>3. Ensayo de los niveles celulares de ATP
<ol><li>Células HepG2 de semilla en placas de 6 pozos. Añadir -HCH durante 24 h.</li>
	<li>Añadir 200 l de tampones de lysis del kit de ensayo de ATP luciferasa-luciferin a cada pocillo de placas de 6 pocillos. Centrifugar a 12.000 g durante 5 min a 4 oC, recoger el sobrenadante con pipetas en tubos nuevos.</li>
	<li>Diluir el reactivo de detección de ATP con la dilución de ATP en una proporción de 1: 5, como búfer de detección de ATP.</li>
	<li>Preparar la determinación de la curva estándar: diluir los 0,5 mM de la solución estándar DE ATP a 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 m por búferes de lylisis ATP.</li>
	<li>Añadir 100 l de tampón de detección de ATP en una placa de 96 pocillos durante 5 minutos en RT, y añadir 100 l de sobrenadante de celda, detectar por un luminómetro (detector de quimiuminescencia). Calcular la concentración de ATP (nmol/L) a través de la curva estándar.</li>
	<li>Detecte la concentración de proteínas mediante un kit de ensayo de proteína bCA con lector multimodo.<ol>
<li>Preparación de la determinación de la curva estándar: diluir los 5 mg/ml de la solución estándar proteica a 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 y 0,5 mg/ml por agua destilada doble.</li>
		<li>Añadir 1 l de sobrenadante de célula en una placa de 96 pocillos y añadir 19 l de agua destilada doble.</li>
		<li>Agregue 200 l de soluciones de detección de BCA para cada pocól. Incubar a 37oC durante 30 min. Detecte el valor OD (densidad óptica) mediante un lector multimodo con 562 nm. Calcular la concentración de proteína (mg/ml) a través de la curva estándar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corrija el contenido de ATP por concentración de proteína mg (unidad: concentración de ATP/concentración de proteínas, nmol/mg).</li>
</ol>4. Evaluación del potencial de membrana mitocondrial (MMP) por JC-1
<ol><li>Recoger células HepG2 sembradas en placas de 6 pozos. Disetique las células con 0,25% EDTA en tubo EP de 1,5 ml, centrífuga a 1000 x g durante 3 min, deseche el sobrenadante y recoja las células.</li>
	<li>Añadir 50 l de JC-1 (200X) a 8 ml de agua destilada al vórtice y mezclar. Agregue 2 ml de tampón de tinción JC-1 (5X) como solución de detección JC-1.</li>
	<li>Incubar células con una mezcla de 0,5 ml de medio de cultivo celular y 0,5 ml de solución de detección JC-1 durante 20 min a 37oC.</li>
	<li>Centrifugar a 600 x g durante 3 min a 4oC. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Enjuagar en 2 cambios de 1 ml de tampón de teñido JC-1 (1X), centrífuga a 600 x g durante 3 min a 4oC. Y desecha el sobrenadante.</li>
	<li>Suspenda las células en 0,5 ml del tampón de teñido JC-1 (1X), analice a través de la citometría de flujo para detectar la fluorescencia verde y roja. Cuando se detecte el polímero JC-1, ajuste la luz de excitación a 490 nm y la luz de emisión a 530 nm. Cuando se detecte el polímero JC-1, ajuste la luz de excitación a 525 nm y la luz de emisión a 590 nm.</li>
</ol>5. Mediciones de las tasas de consumo de oxígeno (OCR)
<ol><li>Células HepG2 de semilla en microplacas de cultivo celular de 96 pocillos a una densidad de 4500 células/100 l por pozo. Asegurar las células cubiertas con cada pozo después de 24 h.</li>
	<li>Añadir el volumen adecuado de los reactivos preparados en el puerto de inyección adecuado, según la documentación anterior13. Puerto A: 25 l 1 m de oligomicina (acoplador ATP); Puerto B: 25 l 0,75 m de FCCP (Control Electrónico del Acelerador, Acelerador ETC); Puerto C: 25 l 0,5 de antimicina A/rotenona (inhibidor mitocondrial A e inhibidor mitocondrial B).</li>
	<li>Conservar el cartucho en una incubadora de 37oC sinCO2 hasta que esté listo para usar.</li>
	<li>Realice un cambio medio de la placa celular quitando el medio de funcionamiento de cada pozo y añadiendo al nuevo DMEM. El volumen final para cada pozo es de 180 l.</li>
	<li>Conservar la placa celular en una incubadora de 37oC sinCO2 durante 1 h antes del ensayo.</li>
	<li>Registre OCR automáticamente por software.<ol>
<li>Abra el software OCR.</li>
		<li>Elija Cell Mito Stress Test Kit en el menú desplegable Apps.</li>
		<li>Haga clic en el botón Iniciar aplicación.</li>
		<li>Haga clic en el botón Ejecutar prueba de esfuerzo. Aparece la pantalla Configuración de la prueba de tensión celular.</li>
		<li>Siga estos pasos:<ol>
<li>Ingrese el número de celdas sembradas por pozo en el cuadro Siembra de celdas.</li>
			<li>Introduzca el OCR promedio en el cuadro OCR basal promedio.</li>
			<li>Introduzca la concentración de trabajo final para cada reactivo e inyecte los reactivos. NOTA: El valor medio de OCR basal para la célula debería haberse detectado antes de ejecutar el ensayo de optimización al optimizar la concentración de siembra celular.</li>
			<li>Haga clic en el botón Siguiente. Aparece la pantalla de información del grupo.</li>
			<li>Asigne un grupo a los pozos sin asignar eligiendo un color y dando un nombre, y luego haciendo clic en los pozos apropiados. NOTA: Los diferentes grupos se definen como diferentes tratamientos antes de la ejecución de la Prueba de Estrés De Cell Mito. Todos los pozos de microplacas recibirán las mismas inyecciones de reactivos cuando se ejecute la prueba de esfuerzo.</li>
			<li>Haga clic en el botón Siguiente. Aparece la pantalla Diseño de inyección de prueba de tensión.</li>
			<li>Haga clic en Inicio. La prueba de esfuerzo ahora se ejecuta en el analizador. Cuando termine la ejecución, siga el punto s del software, retire y deseche el cartucho y la placa de celda.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Crítico para el éxito del protocolo de detección es el uso de una variedad de métodos experimentales que se han cubierto el estudio desde el fenotipo hasta el mecanismo. En este estudio, las células HepG2 se cultivaron en DMEM con penicilina y estreptomicina y 10% de suero bovino fetal. Cuando las células alcanzaron el 40-50% de confluencia, se añadieron e incubaron los HCH (0, 10, 100 ng/ml) durante 24 h. En primer lugar, utilizamos TEM que mostró los cambios ultraestructurales en el hepatocito causados por los OCP repr...

Los efectos de los plaguicidas organoclorados (OCP) en la salud, por ejemplo, interferencia reproductiva, toxicidad inmunológica, cambios metabólicos se han estudiado previamente1,2,3. Los métodos para detectar el metabolismo celular y descubrir la disfunción mitocondrial han permitido a los científicos comprender el papel de la función mitocondrial(es decir., niveles de STAT3 mitocondrial, lactato, piruvato, relación lactato-piruvato, coenzima Q10, fuga de protones mitocondriales, bioenergética, biogénesis y dinámica) en áreas como el envejecimiento, la obesidad, la diabetes, la función cardiovascular, el cáncer y la toxicidad para la seguridad4,,5,6,7. En este artículo, describimos los métodos para evaluar la disfunción mitocondrial causada por los OCP.
Hemos expuesto las células de HepG2 a un O-hexaclorociclohexano , un OCP representativo, durante 24 h a una dosis equivalente a la exposición interna de humanos. En primer lugar, se aplicó TEM para observar la ultraestructura de los hepatocitos, como núcleos, mitocondrias y retículo endoplasmático8. En comparación con los microscopios ordinarios, TEM permite explorar la ultraemetría 2D y 3D de células y componentes celulares (líneas celulares o tejidos), la morfología, composición química, así como la función de materiales naturales o artificiales que juegan un papel fundamental en la ciencia y la tecnología modernas. La función mitocondrial se evaluó aún más por la intensidad de fluorescencia mitocondrial, los niveles de adenosina 5'-trifosfato (ATP), la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en células hepox2 incubadas con HCH. El verde mito-tracker es una sonda fluorescente verde de las mitocondrias que se puede utilizar para la tinción fluorescente específica de la célula viva. Las mitocondrias en los hepatocitos fueron manchadas por solución verde mito-tracker y se observó intensidad de fluorescencia mitocondrial, número y patrón con una microscopía confocal9. La sonda fluorescente verde mitocondrial se puede utilizar para manchar las células vivas. En comparación con la rhodamine 123 o JC-1, la sonda fluorescente verde mitocondrial no depende del potencial de membrana mitocondrial para la tinción mitocondrial. Los niveles de ATP fueron determinados por un kit de luciferasa-luciferina y normalizados por la concentración de proteínas. Kit de ensayo de ATP se puede utilizar para detectar los niveles de ATP en soluciones comunes, células o tejidos. Este kit se basa en la luciasa de lucilyzed por fluoresceína para generar fluorescencia, cuando se requiere ATP para proporcionar energía. Cuando la luciasa de la luciosa y la fluoresceína son excesivas, en un cierto rango de concentración, la generación de fluorescencia es proporcional a la concentración de ATP. Además, este kit ha sido especialmente diseñado para optimizar la quimiuminoscencia de ATP. ATP, como las moléculas de energía más importantes, juega un papel importante en los diversos procesos fisiológicos o patológicos de las células. Los cambios en los niveles de ATP pueden reflejar defectos en la función celular, especialmente la producción de energía mitocondrial. Generalmente bajo apoptosis, necrosis o en algún estado tóxico, los niveles celulares de ATP redujeron 10. El kit de ensayo de MMP con JC-1 es un kit que utiliza JC-1 como sonda fluorescente para detectar células, tejidos o MMP purificados de forma rápida y sensible. Se puede utilizar para la detección temprana de apoptosis. El tinte catiónico JC-1 es una sonda fluorescente utilizada para detectar el MMP que se puede analizar bajo citometría de flujo indicada por cambios de relación de fluorescencia verde y roja. Cuando el MMP es alto, JC-1 se agrega en la matriz de las mitocondrias para formar un polímero (J-agregados), que produce fluorescencia roja. Cuando el MMP es bajo, JC-1 no se puede acumular, y forma monómero que produce fluorescencia verde11. Así que la proporción de fluorescencia roja y verde puede reflejar el nivel de MMP. El OCR de las células es un indicador crucial de la función celular normal12. Se considera como un parámetro para investigar la función mitocondrial. El kit de prueba de esfuerzo de mito celular proporciona un método estable para analizar los parámetros clave de la función mitocondrial. El kit proporciona control de calidad y reactivos predictivos, así como un método estándar para realizar pruebas de esfuerzo mitocondrial celular. Se puede utilizar para detectar todos los tipos de células, incluidas las células primarias, las líneas celulares, las células suspendidas, y también para los islotes, los nematodos, las levaduras y las mitocondrias aisladas.
La medición de OCR puede proporcionar información valiosa sobre el estado fisiológico o alteraciones de las células. Se determinó con un analizador de flujo extracelular para detectar la línea de base respiratoria, fuga de protones, respiratoria máxima, rotación de ATP y capacidad de reserva. En resumen, después de las mediciones basales de OCR, OCR se detectó después de agregar secuencialmente a la oligomicina (ACOPLAdor ATP), FCCP (desacoplador de fosforilación oxidativa mitocondrial) y antimicina A/ rotenona (un inhibidor del consumo de oxígeno) por pozo.
En un esfuerzo por facilitar el desarrollo de un protocolo más específico para la detección de la función mitocondrial en hepatocitos in vitro, presentamos aquí experimentos por TEM, microscopía confocal, luminómetro, citometría de flujo y analizador de flujo extracelular con aplicación futura en el estudio de los resultados adversos relacionados con el daño de las mitocondrias.

<table><tbody><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión&nbsp;</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td><td>Imágenes de alto contraste y alta resolución, Observación e imágenes de baja dosis, Observación a baja temperatura, Rendimiento analítico excepcional, Automatización para mayor comodidad y rendimiento</td></tr><tr><td>Mito-Tracker Green</td><td>Beyotime</td><td>C1048</td><td>Mito-Tracker Green es una sonda fluorescente verde mitocondrial que se puede utilizar para la tinción fluorescente específica de mitocondrias de células vivas.</td></tr><tr><td>Microscopio confocal de escaneo láser</td><td>Zeiss</td><td>700B</td><td>El diseño es compacto, estable, la trayectoria de luz es la más corta, la alta precisión de luz, la tecnología creativa y la tecnología de escaneo sofisticada junto para producir una imagen de muestra tridimensional perfecta.</td></tr><tr><td></td><td>Beyotime</td><td>S0027</td><td>El kit de ensayo de ATP mejorado se puede utilizar para detectar los niveles de ATP (adenosina 5'-trifosfato) en soluciones, células o tejidos comunes. Las células y las muestras de tejido se pueden dividir para completar la preparación de la muestra, sensibilidad de detección de hasta 0,1 nmol / L, la quimioluminiscencia se puede mantener durante 30 minutos.</td></tr><tr><td>Luminómetro</td><td>Berthold</td><td>Centro LB 960</td><td>El luminómetro es un detector de quimioluminiscencia, la muestra de prueba en sí puede ser ligera, no es necesario estimular. El luminómetro es el instrumento que detecta la quimioluminiscencia.</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>El kit de ensayo de proteínas BCA es uno de los métodos más utilizados para detectar concentraciones de proteínas.</td></tr><tr><td>Lector multimodo</td><td>TECAN</td><td>InfiniteM200</td><td>El lector multimodo se utiliza para detectar la consentimiento de proteínas.</td></tr></tbody></table>

protocolo experimental para detectar la función mitocondrial en hepatocitos expuestos a plaguicidas organoclorados

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

Este artículo presenta métodos detallados para detectar la función mitocondrial hepática para comprender mejor la causa de los trastornos metabólicos causados por los pesticidas organoclorados ambientales (OCP) en los hepatocitos. Las células hepG2 se expusieron al hexaclorociclohexano durante 24 h a una dosis equivalente de exposición interna en la población general. La ultraestructura en los hepatocitos se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) para mostrar el daño de las mitocondrias. La función mitocondrial se evaluó aún más por la intensidad de fluorescencia mitocondrial, los niveles de adenosina 5'-trifosfato (ATP), la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en células hepox2 incubadas con HCH. La intensidad de fluorescencia de las mitocondrias después de mancharse por la sonda fluorescente verde mitocondrial se observó con una microscopía de fluorescencia. La reacción luciferina-luciferasa se utilizó para determinar los niveles de ATP. El MMP fue detectado por el tinte catiónico JC-1 y analizado bajo citometría de flujo. El OCR se midió con un analizador de flujo extracelular. En resumen, estos protocolos se utilizaron en la detección de la función mitocondrial en hepatocitos con para investigar los daños de las mitocondrias.

Las mitocondrias cristae de las células de HepG2 expuestas a la HCH fueron marcadamente dañadas. Las mitocondrias dispersas fueron levemente expandidas, de forma irregular, y la cresta mitocondrial desapareció con una arquitectura mitocondrial relativamente anormal (Figura 1).
Intensidad media de fluorescencia verde mitocondrial, que representa las mitocondrias, disminución en las células de HepG2 e...

Comprender la influencia de los pesticidas organoclorados ambientales (OCP) en la función mitocondrial en los hepatocitos es importante para explorar el mecanismo de los OCP que causan trastornos metabólicos. Este artículo presenta métodos detallados para detectar la función mitocondrial hepática.

Protocolo experimental para detectar la función mitocondrial en hepatocitos expuestos a plaguicidas organoclorados

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

Es un desorden que llama responder a una pregunta clave que usted tiene en también una función de campo como el nivel ATP y las tasas de consumo de oxígeno. La nueva o la de una página antigua, esta técnica es que es fácil de realizar y es mucho para una evaluación especial de la función mitocondrial celular. Para comenzar este experimento, sembra 20.000 células HepG2 en un plato de Petri de fondo de vidrio.Añadir beta-hexaclochlorciclohexano o B-HCH en incubadora a 37 grados Celsius y cinco por ciento de CO2 durante 24 horas. Prepare una solución de sonda de fluorescencia verde mitocondrial milimétrica agregando DMSO anhidro al medio de cultivo celular DMEM. Luego agregue un mililitro por plato de esta solución a las células en los platos petri de fondo de vidrio.E incubar a 37 grados centígrados durante 45 minutos. Después de la incubación, retire la solución de sonda fluorescente verde mitocondrial de las células. Añadir un mililitro por plato de recién preparado a 37 grados Celsius DMEM medio de cultivo celular.Para detectar la fluorescencia verde en las mitocondrias, observe las células bajo un microscopio confocal. Para evaluar los niveles de ATP celular, sembra a 20.000 células HepG2 en seis placas de pozo. Añadir beta-HCH e incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas.Añadir 200 microlitros de tampón de lelisis a las células de cada pozo. Centrifugar a 12.000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y proceder con la recolección de sobrenadantes como se describe en el protocolo de texto. Agregue 100 microlitros de búfer de detección de ATP a la placa.Añadir 100 microlitros de sobrenadante celular recogido a una placa de 96 pozos a temperatura ambiente y procedió a detectar ATP celular por un luminómetro como se describe en el protocolo de texto. Para la evaluación del potencial de membrana mitocondrial, crecer células HepG2 en seis placas de pozo con la adición de beta-HCH, como se describió anteriormente. Recoger las células digieriéndolas con 0.5 mililitros 0.25%EDTA durante un minuto a 37 grados Celsius.Agregue un mililitro DMEM para detener la digestión y transferir las células digeridas a tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 1000 veces G durante tres minutos, y luego desechar el sobrenadante. Diluir el pellet celular con 0,5 mililitros de medio de cultivo celular y 0,5 mililitros JC1 tinte potencial de membrana mitocondrial.E incubar durante 20 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, centrifugar los tubos a 600 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados, y luego lavar el pellet celular de acuerdo con el protocolo de texto. Después de centrifugar el pellet lavado, retire el sobrenadante.Y vuelva a suspender el pellet en 0,5 mililitros de tampón de teñido JC1. Analice las células manchadas JC1 a través de la citometría de flujo para detectar la fluorescencia verde y roja. Cuando se detecte el monómero JC1, ajuste la luz de excitación a 490 nanómetros y la luz de emisión a 530 nanómetros.Cuando se detecte el polímero JC1, ajuste la luz de excitación a 525 nanómetros y la luz de emisión a 590 nanómetros. Para analizar la tasa de consumo de oxígeno, siembra células HepG2 en una placa de cultivo celular de 96 pozos en una densidad de 4.500 células por cada 100 microlitros por pozo. Después de 24 horas de incubación a 37 grados Celsius, asegúrese de que las células de cada pozo estén cubiertas con un medio.Antes de ejecutar el software OCR, cargue la microplaca con el cartucho y la placa de cultivo celular en un analizador de flujo extracelular como se describe en el protocolo de texto. Abra el software OCR y en el menú desplegable de aplicaciones, elija el kit de prueba de esfuerzo de mito de celda y haga clic en el botón de inicio de la aplicación. A continuación, haga clic en el botón Ejecutar prueba de esfuerzo.Cuando aparezca la pantalla de prueba de tensión celular, ingrese el número de células que se siembran por pozo en el cuadro de número de siembra de celda y el OCR promedio en el promedio en el cuadro de OCR de celda basal. Introduzca la concentración de trabajo final para cada reactivo y, a continuación, inyecte los reactivos. Haga clic en el botón siguiente.Cuando aparezca la pantalla de información del grupo, asigne un grupo a pozos sin asignar seleccionando un color y dando un nombre. A continuación, haga clic en los pozos apropiados. Haga clic en el botón siguiente y, en la pantalla de diseño de inyección de prueba de esfuerzo que aparece, haga clic en iniciar para ejecutar la prueba de esfuerzo en el analizador.Después de la ejecución completada, siga las indicaciones del software y, a continuación, extraiga y deseche el cartucho y la placa de celda. La intensidad media de la tinción fluorescente verde mitocondrial disminuyó en las células HepG2 expuestas a beta-HCH. Esto muestra que hay una disminución en el número de mitocondrial y aumento en las mitocondrias dañadas consistentes con el aumento en la concentración de pesticidas.Además, los niveles de ATP en las células de HepG2 disminuyeron con el aumento de las concentraciones de exposición beta-HCH, mostrando la función disminuida de las mitocondrias en estas células. Después de la tinción JC1 para el potencial de membrana mitocondrial, o MMP, el citómetro de flujo mostró alta fluorescencia verde roja JC1 en células HepG2 intactas. Esto se debió a la presencia de agregados JC1 fluorescentes rojos, que son un signo de MMP alto.En las células tratadas con beta-HCH, la fluorescencia verde rojo JC1 disminuyó debido a la presencia de monómeros JC1 fluorescentes verdes, un signo de MMP bajo. Por último, la tasa de consumo de oxígeno también disminuyó con el aumento de las concentraciones de exposición beta-HCH, lo que demuestra además que este pesticida afecta la función mitocondrial adecuada. Oh, bueno, intenta este procedimiento, es importante, sin embargo, recordar ver que las células según sea apropiado para probarlo.Después de su desarrollo, esto definitivamente allana un camino para las investigaciones en el campo de la función fundamental para explorar los organismos relevantes en el papel médico asociado con él. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo detectar una cantidad o calidad, capacidad, ahora miembro o potencial bajo la función de hoja de spoutage.

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