Protocolo experimental para detectar la función mitocondrial en hepatocitos expuestos a plaguicidas organoclorados

Es un desorden que llama responder a una pregunta clave que usted tiene en también una función de campo como el nivel ATP y las tasas de consumo de oxígeno. La nueva o la de una página antigua, esta técnica es que es fácil de realizar y es mucho para una evaluación especial de la función mitocondrial celular. Para comenzar este experimento, sembra 20.000 células HepG2 en un plato de Petri de fondo de vidrio.

Añadir beta-hexaclochlorciclohexano o B-HCH en incubadora a 37 grados Celsius y cinco por ciento de CO2 durante 24 horas. Prepare una solución de sonda de fluorescencia verde mitocondrial milimétrica agregando DMSO anhidro al medio de cultivo celular DMEM. Luego agregue un mililitro por plato de esta solución a las células en los platos petri de fondo de vidrio.

E incubar a 37 grados centígrados durante 45 minutos. Después de la incubación, retire la solución de sonda fluorescente verde mitocondrial de las células. Añadir un mililitro por plato de recién preparado a 37 grados Celsius DMEM medio de cultivo celular.

Para detectar la fluorescencia verde en las mitocondrias, observe las células bajo un microscopio confocal. Para evaluar los niveles de ATP celular, sembra a 20.000 células HepG2 en seis placas de pozo. Añadir beta-HCH e incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas.

Añadir 200 microlitros de tampón de lelisis a las células de cada pozo. Centrifugar a 12.000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y proceder con la recolección de sobrenadantes como se describe en el protocolo de texto. Agregue 100 microlitros de búfer de detección de ATP a la placa.

Añadir 100 microlitros de sobrenadante celular recogido a una placa de 96 pozos a temperatura ambiente y procedió a detectar ATP celular por un luminómetro como se describe en el protocolo de texto. Para la evaluación del potencial de membrana mitocondrial, crecer células HepG2 en seis placas de pozo con la adición de beta-HCH, como se describió anteriormente. Recoger las células digieriéndolas con 0.5 mililitros 0.25%EDTA durante un minuto a 37 grados Celsius.

Agregue un mililitro DMEM para detener la digestión y transferir las células digeridas a tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 1000 veces G durante tres minutos, y luego desechar el sobrenadante. Diluir el pellet celular con 0,5 mililitros de medio de cultivo celular y 0,5 mililitros JC1 tinte potencial de membrana mitocondrial.

E incubar durante 20 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, centrifugar los tubos a 600 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados, y luego lavar el pellet celular de acuerdo con el protocolo de texto. Después de centrifugar el pellet lavado, retire el sobrenadante.

Y vuelva a suspender el pellet en 0,5 mililitros de tampón de teñido JC1. Analice las células manchadas JC1 a través de la citometría de flujo para detectar la fluorescencia verde y roja. Cuando se detecte el monómero JC1, ajuste la luz de excitación a 490 nanómetros y la luz de emisión a 530 nanómetros.

Cuando se detecte el polímero JC1, ajuste la luz de excitación a 525 nanómetros y la luz de emisión a 590 nanómetros. Para analizar la tasa de consumo de oxígeno, siembra células HepG2 en una placa de cultivo celular de 96 pozos en una densidad de 4.500 células por cada 100 microlitros por pozo. Después de 24 horas de incubación a 37 grados Celsius, asegúrese de que las células de cada pozo estén cubiertas con un medio.

Antes de ejecutar el software OCR, cargue la microplaca con el cartucho y la placa de cultivo celular en un analizador de flujo extracelular como se describe en el protocolo de texto. Abra el software OCR y en el menú desplegable de aplicaciones, elija el kit de prueba de esfuerzo de mito de celda y haga clic en el botón de inicio de la aplicación. A continuación, haga clic en el botón Ejecutar prueba de esfuerzo.

Cuando aparezca la pantalla de prueba de tensión celular, ingrese el número de células que se siembran por pozo en el cuadro de número de siembra de celda y el OCR promedio en el promedio en el cuadro de OCR de celda basal. Introduzca la concentración de trabajo final para cada reactivo y, a continuación, inyecte los reactivos. Haga clic en el botón siguiente.

Cuando aparezca la pantalla de información del grupo, asigne un grupo a pozos sin asignar seleccionando un color y dando un nombre. A continuación, haga clic en los pozos apropiados. Haga clic en el botón siguiente y, en la pantalla de diseño de inyección de prueba de esfuerzo que aparece, haga clic en iniciar para ejecutar la prueba de esfuerzo en el analizador.

Después de la ejecución completada, siga las indicaciones del software y, a continuación, extraiga y deseche el cartucho y la placa de celda. La intensidad media de la tinción fluorescente verde mitocondrial disminuyó en las células HepG2 expuestas a beta-HCH. Esto muestra que hay una disminución en el número de mitocondrial y aumento en las mitocondrias dañadas consistentes con el aumento en la concentración de pesticidas.

Además, los niveles de ATP en las células de HepG2 disminuyeron con el aumento de las concentraciones de exposición beta-HCH, mostrando la función disminuida de las mitocondrias en estas células. Después de la tinción JC1 para el potencial de membrana mitocondrial, o MMP, el citómetro de flujo mostró alta fluorescencia verde roja JC1 en células HepG2 intactas. Esto se debió a la presencia de agregados JC1 fluorescentes rojos, que son un signo de MMP alto.

En las células tratadas con beta-HCH, la fluorescencia verde rojo JC1 disminuyó debido a la presencia de monómeros JC1 fluorescentes verdes, un signo de MMP bajo. Por último, la tasa de consumo de oxígeno también disminuyó con el aumento de las concentraciones de exposición beta-HCH, lo que demuestra además que este pesticida afecta la función mitocondrial adecuada. Oh, bueno, intenta este procedimiento, es importante, sin embargo, recordar ver que las células según sea apropiado para probarlo.

Después de su desarrollo, esto definitivamente allana un camino para las investigaciones en el campo de la función fundamental para explorar los organismos relevantes en el papel médico asociado con él. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo detectar una cantidad o calidad, capacidad, ahora miembro o potencial bajo la función de hoja de spoutage.