Name: Evaluación de terapias con células madre en un modelo de lesión del tendón patelar Bilateral en ratas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprende a evaluar terapias con células madre en un modelo bilateral de lesión del tendón patelar en ratas. Este método controla la variación interindividual y reduce el número de animales necesarios para detectar diferencias entre tratamientos.

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Los autores desean reconocer Su Dr., PhD, para su análisis estadístico de los datos. Los autores también agradecen al Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, para su asesoramiento en la anestesia y protocolos de administración de dolor utilizan en el estudio. Este proyecto fue apoyado por becas del Western University of Health Sciences oficina del Vice Presidente de investigación (12678v) y fondos de USDA sección 1433 (2090).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Western University of Health Sciences.
1. aislamiento y expansión de MSCs de matriz equina del cordón Umbilical
<ol><li>Obtener la placenta de una yegua adulta (embarazada) después de observado parir y aislarlo asépticamente el cordón umbilical de la placenta. Mantener el cordón umbilical en tampón fosfato salino (PBS) con 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) a 4 ° C durante el traslado hasta el procesamiento.</li>
	<li>Lavar el cordón umbilical dos veces con temperatura PBS con 1% P/S en un tubo de 50 mL. Sección del cordón umbilical en fragmentos de 2 pulgadas de largo de placa de 150 mm y lavado a temperatura PBS con 1% P/S en un tubo de 50 mL dos o tres veces, hasta que la mayor parte de la sangre es aclarado hacia fuera.</li>
	<li>Cortar el cordón umbilical longitudinalmente para exponer los vasos. Retire los recipientes, incluyendo un tallo alantoideo del cordón con pinzas y tijeras, 2 arterias y una vena. Recoger la matriz del cordón umbilical (gelatina de Wharton), que es los vasos circundantes de matriz gelatinosa, sobre una placa de 150 mm por raspado con un escalpelo, y pique la gelatina en trozos finos.</li>
	<li>Jalea de Wharton lugar de 2-3 fragmentos de cordón umbilical (aproximadamente 12-15 g) en un tubo de 50 mL con 15 mL de solución al 0.1% (p/v) colagenasa tipo IA en PBS. Incubar a 37 ° C con agitación suave durante 3-4 h hasta que se disuelva.</li>
	<li>Centrifugue el tejido digerido a 300 x g durante 15 min y aspirar el sobrenadante. Suspender el tejido digerido en 15 mL de temperatura ambiente PBS con 1% P/S, mezclar mediante pipeteo, centrifugar a 150 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante (lavado). Repetir el lavado dos veces más.</li>
	<li>Resuspender células en 15 mL de temperatura ambiente PBS con 1% de lavado P/S, mezclar mediante pipeteo, colar por 100 μm filtro de célula, centrifugar a 150 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Preparar medio de cultivo (CM) mediante la mezcla de glucosa baja Dulbecco modificado Eagle Medium (LG-DMEM) con suero bovino fetal (FBS) y 1% P/S. esterilizar el medio de filtración.</li>
	<li>Resuspender células filtradas en 10 mL de CM calentado previamente a 37 ° C, mezclar mediante pipeteo, transvasar a un matraz de cultivo tisular de 25 cm2 e incube en el 5% CO2 en el 90% de humedad y 37,0 º C. Cambio CM cada 3 días hasta que la cultura llegue a confluencia del 70 – 80%, cuando la cultura se pasados.</li>
	<li>Para el paso de la cultura, aspirar CM del frasco, lavar dos veces con 5 mL de PBS de temperatura y separar con 3 mL de 0.25% tripsina/etilendiaminotetracético ácido (EDTA) a 37 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Neutralizar la tripsina/EDTA con 6 mL de CM pre-calentado a 37,0 ° C, mezclar mediante pipeteo, transferir a un tubo de 15 mL, centrifugar a 150 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender células separadas en 1 mL de CM, mezclar mediante pipeteo. Contar las células viables con azul de tripán y hemocitómetro. Volver a la semilla en un frasco de cultivo de tejidos de 25 cm2 en 5.000 células/cm2e incubar en 5% CO2 en el 90% de humedad y 37,0 º C.</li>
</ol>2. preparación de esferoides con UCM-MSCs cultivadas en las películas de quitosano
<ol><li>Para preparar 100 mL de solución al 1% (p/v) quitosano, añadir 1 g de quitosano en 99 mL de agua destilada (dH2O) y mezclar bien con un agitador magnético.</li>
	<li>Agregar 670 μl de ácido acético glacial y continúe batiendo hasta que la Quitosana se disuelve y se vuelve viscosa. Esto generalmente toma 3-4 h.</li>
	<li>Añadir 500 μl de solución de quitosano en cada pocillo de la placa de la pozo 12 cultivo de tejidos, y la placa para distribuir uniformemente la solución de quitosano y cubren la totalidad de la superficie inferior del remolino.</li>
	<li>Seque la placa de solución revestido de quitosano bajo flujo laminar gabinete sin una cubierta durante la noche para 24 h. Una vez seco, película delgada será formada y adherida a la placa.</li>
	<li>Neutralizar la película de quitosano mediante la adición de 1 mL de solución de sodio hidróxido 0.5 N en cada pozo e incubar por 2 h a temperatura ambiente. NaOH de cada pozo de aspirar y lavar cada pozo con 1 mL de dH2O tres veces. Lavar cada pozo con 1 mL de etanol al 70% (EtOH) una vez.</li>
	<li>Para esterilizar la película de quitosano, añadir 1 mL de 70% EtOH en cada pozo e incubar durante la noche en el gabinete de flujo laminar. Aspire el EtOH restantes de cada pozo en el día siguiente. Lavar cada pozo con 1 mL de PBS estéril tres veces. Esterilizar la película de quitosano con luz ultravioleta en gabinete durante la noche sin una cubierta de cabina de flujo laminar.</li>
	<li>Esferoides forma de MSCs de la UCM, semilla ampliado y pasados a las células en cada pozo de 5.000 células/cm2e incubar en 5% CO2 en el 90% de humedad y 37,0 º C. Nota: Las células pueden ser incubadas bajo hipoxia o normoxia, dependiendo del interés del investigador.</li>
</ol>3. expresión de marcadores de superficie analizada por citometría de flujo
<ol><li>
Preparación de una suspensión unicelular
	<ol>
<li>Placa estándar<ol>
<li>Retire el medio de cada bien y lavar dos veces con PBS de temperatura.</li>
			<li>Separar las células con 500 μl de un reactivo de disociación celular en cada pocillo de una placa de 12 pozos de 5 – 10 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Después de la incubación, añadir 1 ml de tampón (PBS con 0,5% BSA) la coloración en cada pozo y mezclar mediante pipeteo para separar las células.</li>
			<li>Transferencia de suspensión celular en tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 150 x g durante 5 minutos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Placa de quitosano<ol>
<li>Recoger los esferoides por medio de aspiración con una pipeta con una punta de 1.000 μl. Transferencia media recogida en un tubo cónico de 15 mL. Después de recoger medio, lave bien añadiendo 1 mL de PBS y transferencia de lavado PBS en el mismo tubo cónico de 15 mL.</li>
			<li>Centrifugar esferoides a 150 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.</li>
			<li>Añadir 500 μl del reactivo de disociación celular (p. ej., accutase) e incubar durante 5 – 10 min a temperatura ambiente. Mezclar por pipeteo usando una punta de 1 mL hasta esferoides se disocian y no sean visibles.</li>
			<li>Añadir 1 mL de tampón de tinción en la única célula suspensión y centrifugar a 150 x g durante 5 minutos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Células de lavado
	<ol>
<li>Quite el sobrenadante del tubo cónico y Resuspenda las células en 3 mL de tampón de tinción fría. Mantener las células en hielo a lo largo del experimento de este paso.</li>
		<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos (lavado).</li>
		<li>Lavar dos veces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tinción de las células
	<ol>
<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Contar las células viables usando un azul de tripán y hemocitómetro. Células de 1 x 106 resuspender en 50 μl de bloqueo tampón (suero de caballo 10% que contiene PBS) e incuban durante 30 min en hielo.</li>
		<li>Añadir 10 μl fluoresceína isotiocianato (FITC) conjugado anticuerpos (CD44, CD90, CD105, CD34, (histocompatibilidad complejo MHC) de clase II o control de isotipo para cada anticuerpo) y 40 μl de tampón de tinción, luego incubar protegido de la luz durante 1 hora en hielo.</li>
		<li>Añadir 3 mL de tampón de tinción fría y mezclar, centrifugar a 300 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante (lavado).</li>
		<li>Repetir el lavado dos veces.</li>
		<li>Resuspenda el precipitado de células en 0,5 mL de tampón de tinción</li>
		<li>Añadir 5 μl de 7-AAD (tinte de viabilidad) e incubar por 30 min en hielo</li>
		<li>Analizar muestras de células teñidas por el citómetro de flujo. Excluir residuos menor FSC y SSC e identificar células viables con absorción menor de 7-AAD. Parcela FL1 y FL2 en los ejes y y x, respectivamente. Utilizar control de isotipo para crear una puerta encima de la línea diagonal. Medir el porcentaje de células teñidas positivamente en el área. Contar por lo menos 20.000 eventos/muestra (suplementario Figura 1).</li>
		<li>Medir el porcentaje de células teñidas con anticuerpos por células viables y auto-fluorescencia que bloquean y restar el porcentaje de células teñidas con control de isotipo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. modelo de defecto bilateral del tendón patelar en la rata
<ol><li>Seleccione ratas Sprague-Dawley (adulto hombres, 4 – 5 meses, 350 – 375 g de peso corporal). Tenga en cuenta el tamaño relativamente grande de las ratas utilizado para este modelo.</li>
	<li>Anestesiar y aplicar lubricante del ojo artificial entregada la rata con 8% de sevoflurano en oxígeno al de 100% 2 L/min mediante mascarilla, hasta la desaparición del reflejo del pellizco-dedo del pie en la cámara de inducción.</li>
	<li>Administrar una inyección intramuscular de Meloxicam (1 mg/kg) como analgesia preventiva.</li>
	<li>La rata entre dos botellas de agua de 0,5 L con agua caliente y cubierta con un paño para mantener la temperatura corporal y la posición, evitando lesiones en la piel. Cada extremidad a la mesa con cinta adhesiva. Para reducir el riesgo de hipotermia, cubrir el cuerpo con plástico de burbuja (figura 1).</li>
	<li>Mantener la anestesia con flujo continuo de 5% de sevoflurano en mezcla de oxígeno de 100% 1 L mediante cono de nariz, con el animal en recumbency dorsal sobre el cojín de calefacción del agua.</li>
	<li>Para evitar el trauma de la piel, no clip de los sitios quirúrgicos. En su lugar, aplique crema removedor del pelo sobre ambas babillas. Utilizar un depresor de lengüeta para quitar la crema y el pelo.</li>
	<li>Frote el sitio quirúrgico con scrub de Digluconato de clorhexidina y enjuagar con etanol al 70% 3 veces.</li>
	<li>Haga una incisión en la piel con una cuchilla estéril de bisturí #15 en dirección proximal a distal, en el aspecto craniomedial de la rodilla. Iniciar la incisión de aproximadamente 1 cm proximal al nivel de la rótula y se extiende aproximadamente 5 mm distal al tubérculo tibial.</li>
	<li>Reflejar la piel para exponer el tendón rotuliano al liberar el tejido subcutáneo subyacente con una hoja de bisturí #15.</li>
	<li>
Utilizar la hoja de bisturí #15, suprimir el tercio central de cada tendón patelar (1 mm) del aspecto distal de la rótula a la tuberosidad tibial.
	<ol>
<li>Alinee un alambre de Kirschner de 0.99 mm de diámetro contra el tendón como plantilla para estandarizar el tamaño del defecto en cada miembro (figura 2).</li>
		<li>Hacen 2 incisiones de grosor total a cada lado de la aguja de Kirschner con una hoja de bisturí #15 para aislar la porción central del tendón (figura 3). Resecar la parte central proximal y distal con finas tijeras de Iris (figura 4).</li>
		<li>Antes de cerrar la fascia de la rodilla, inserte el coágulo (suspensión de mezclado de la célula y ACP) para los grupos de tratamiento adecuado como se describe en 5.5. Cerrar la fascia con un patrón cruciforme y la piel con un patrón intradérmica usando 5-0 polyglactin 910 suturas (figura 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita el procedimiento en la rodilla contralateral. Nota: Un defecto es asignado al azar a un tratamiento (células madre están condicionados al chitosan o cultivadas en placas estándar). El defecto contralateral quedo vacío, para servir como control interno.</li>
	<li>Después de la cirugía, administrar 4 tabletas de enrofloxacina (2 mg/tableta, por vía oral, una vez al día) y una tableta de meloxicam (2 mg/tableta, por vía oral, una vez al día) durante 7 días. Estas dosis fueron recomendadas por un veterinario de animales de laboratorio y aprobadas en el protocolo IACUC.</li>
</ol>5. entrega de MSCs en el defecto del tendón rotuliano
<ol><li>Anestesiar una rata sana que no se utiliza para la creación de defecto del tendón patelar con 8% de sevoflurano en oxígeno al de 100% 2 L/min suministra a través de la máscara, hasta la desaparición del reflejo del pellizco-dedo del pie en la cámara de inducción.</li>
	<li>Recoger 5 mL de sangre por punción cardíaca de la rata Sprague-Dawley anestesia (adulto hombres, 4 – 5 meses, 350 – 375 g de peso corporal), en una jeringa de 5 mL con una aguja de 20 G que contiene 1 mL de ácido-citrato-dextrosa (5:1 v/v).</li>
	<li>Eutanasia la rata después de la punción cardiaca y recolección de sangre, por intracardial inyección de pentobarbital (100 mg/kg), mientras que bajo la misma anestesia.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 350 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Transferir el sobrenadante y almacenar alícuotas (120 μL) a-20 ° C hasta su uso.</li>
	<li>Inmediatamente antes de la implantación en vivo , descongelar la alícuota anterior y mezcle 20 μl con 0,5 x 106 MSCs (de 1.9 o 3.1.2.1) separadas de las placas estándar utilizando tripsina/EDTA o recoger de las placas de quitosano por lavado (con PBS/medio).</li>
	<li>Añadir 6 μl de 10% de cloruro de calcio (CaCl2) a los restantes 100 μl de plasma descongelado en un pozo de placa de 96 pocillos para activar el plasma e inducir la formación de un coágulo (activado acondicionado plasma: ACP).</li>
	<li>Mezclar la suspensión de la célula (20 μl) y ACP (100 μL) para formar un coágulo (figura 6). Colocar el coágulo en el defecto del tendón patelar creado antes de cerrar la fascia de la rodilla (ver paso 4.10.3).</li>
</ol>6. funcional resultado
<ol><li>Controlar las ratas dos veces al día para las muestras de dolor, basado en la rata mueca escala (RGS)37,38 e hinchazón sobre los sitios de implantación. Nota: Un sistema de puntuación (0-6) fue desarrollado para evaluar la función ambulatoria basada en 3 actividades, incluyendo extremidades temporizado de pie con patas delanteras apoyados (0-3), tiempo de pie extremidades (0 – 2) y la capacidad de subir a una jaula de plástico 17 cm pared (0-1) ( Tabla 1).</li>
	<li>Evaluar las ratas para las actividades de pie dos extremidades en la mañana y por la tarde de cada punto de tiempo para calcular una puntuación media.</li>
	<li>Evaluar las ratas para la capacidad de subir con éxito una pared de la jaula de plástico de 17 cm con ambas extremidades posteriores llegar a la cima.</li>
</ol>7. bruto aspecto e histopatología del tendón rotuliano
<ol><li>Eutanasia ratas a los 7 días (para evaluar inflamación) o 28 días (para evaluar la cicatrización de tejido) post tratamiento por intracardial inyección de pentobarbital (100 mg/kg) bajo anestesia con sevoflurano 8% y 2 L 100% de oxígeno entregado mediante mascarilla.</li>
	<li>Unidades de rótula-tendón-tibia tuberosidad por el bisturí y las tijeras la cosecha después de la eutanasia. Eliminar los tejidos blandos y ligamentos alrededor de la rodilla, excepto el tendón rotuliano.</li>
	<li>Examinar a cada muestra de aspecto grueso y engrosamiento del tendón (figura 7).</li>
	<li>Orientar a la muestra colocando un nudo cirujano de Polydioxanone 5.0 en el aspecto proximal y lateral del tendón. Fijar a cada muestra en solución de formalina tamponada neutra 10% y obtener secciones transversales (5 μm) de la porción media de cada tendón.</li>
	<li>Las secciones con hematoxilina y eosina y TRICROMICA de Masson coloración siguiendo protocolos estándar de la mancha.</li>
	<li>Examine la sección para detectar la presencia de hematoma dentro del defecto, así como cambios patológicos como la inflamación.</li>
	<li>Evaluar la puntuación histológica de secciones usando el sistema de puntuación previamente publicado, basado en grado de colágeno, angiogénesis y cartílago formación (tabla 2)39.</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de interés que revelar.

Células equinas fueron seleccionadas para este proyecto porque finalmente vamos a prueba enfoques de candidato en el tratamiento de tendinopatías natural en caballos. De hecho, lesiones de los tendones en los caballos son atractivos como modelos naturales de tendinopathy en el hombre debido a la similitud biológica entre el equino flexor digital superficial y el tendón de Aquiles en los seres humanos41. Los célula marcadores de superficie CD44, CD90, CD105, CD34 y MHC II se seleccionaron para immu...

Lesión del tendón es una de las causas más comunes de atrofia muscular y dolor significativa de especies1. En medicina veterinaria, lesiones de tendones y ligamentos son de especial interés en los caballos, ya que 82% de las lesiones en caballos de carrera implican el sistema músculo-esquelético, 46% de los que afectan a los tendones y los ligamentos2,3. Formación de tejido cicatricial afecta las propiedades biomecánicas de los tendones curadas y explica el pronóstico guardado para volver a uso deportivo después de lesiones del tendón flexor; nueva lesión ocurre dentro de 2 años en hasta un 67% de los caballos tratados conservador4. Medicina regenerativa ofrece nuevas alternativas a una condición que desafía a los tratamientos tradicionales. Terapia de células madre autólogo ha producido algunos resultados alentadores5,6 pero está limitada por la morbilidad asociada con la colección de tejidos, administración retardada debido a procesamiento/reprogramación de las células y la influencia de la Estado de salud del paciente (como la edad) en las propiedades del tallo las células7,8. Estas limitaciones proporcionan un fundamento para la investigación de células madre alogénicas como alternativa inmediata. Células fetales derivados del adnexa son candidatos atractivos ya que eluden las preocupaciones éticas y el riesgo de formación de teratoma con células madre embrionarias. Entre los anejos fetales, matriz del cordón umbilical (UCM), también llamado gelatina de Wharton, es abundante y fácil de recoger.
Independientemente de la fuente de la célula, mejorando la troncalidad es esencial para establecer un banco de células para la medicina regenerativa alógeno. Desde un punto de vista funcional, la troncalidad puede definirse como la posibilidad de auto renovación y multilineal diferenciación9. Evidencia de la troncalidad basa en la proliferación y diferenciación ensayos, junto con la expresión de marcadores gen Oct4, Sox2 y Nanog9. Una estrategia para mejorar la troncalidad se basa en la utilización de Biomateriales para servir como vacíos rellenos y portadores, mejorar la proliferación y la diferenciación de MSCs de la UCM. Este enfoque elimina preocupaciones con respecto a la manipulación de factores transcripcionales para reprogramar las células maduras en células pluripotentes inducidas. Entre los biomateriales consideradas como posibles portadores de células madre, chitosan es atractiva por su biocompatibilidad y biodegradabilidad10. Este aminopolysaccharide natural está formado por desacetilación alcalina de la quitina, el polisacárido natural más abundante en segundo lugar, que principalmente se obtiene como un subproducto de mariscos10. Previamente hemos investigado las interacciones entre MSCs y andamios de quitosano y observó la formación de esferoides11,12,13,14,15, 16. también informó sobre la superioridad de la condrogénesis en quitosano matrices12,13,14,15,16,17, 18. Más recientemente, dos estudios independientes describen formación de esferoides por tejido adiposo y tejido de placenta derivados MSCs cultivadas en una película de quitosano19,20. Esta formación de esferoides no sólo había mejorado troncalidad, pero también mejora la retención de las células madre después de en vivo implantación20.
La prevalencia y morbilidad de la Tendinopatía entre especies han impulsado el desarrollo de modelos experimentales para estudiar la fisiopatología de las tendinopatías y probar nuevas terapias como las inyecciones de células madre. En los caballos, tendonitis colagenasa-inducido es un modelo común para demostrar la eficacia utilizando MSCs en reparación de tendón21. La relevancia de este enfoque es limitada, como las inyecciones provocan cambios inflamatorios agudos, mientras que clínica tendinopatías generalmente son el resultado de crónica agotamiento extremo22,23. Además, la inducción química de la enfermedad del tendón induce una respuesta curativa y no reproduce el proceso de curación deteriorado en casos clínicos22,23. Supresión de un segmento de tendón del flexor digital superficial ha sido descrita como un modelo quirúrgico de la tendinitis en caballos24. Más recientemente, se utilizó un acercamiento como mínimo invasor para restringir el daño traumático a la base central del tendón del flexor digital superficial25. Los modelos quirúrgicos no simulan el mecanismo de fatiga que puede conducir a la enfermedad natural del tendón y tienden a la falta de reproducibilidad en el grado de daño creado25. Sin importar el modelo, la morbilidad y costes asociados con modelos equinos del tendón enfermedades son limitaciones adicionales, que justifican un interés en modelos de roedores como un primer paso para la evaluación en vivo de nuevas terapias.
Una de las principales ventajas de los modelos experimentales en roedores consiste en el costo y la capacidad de controlar la variabilidad interindividual. Roedores pueden ser normalizados con respecto a varios factores fisiológicos debido a sus rápidas tasas de crecimiento y relativamente corta longevidad, limitando las fuentes de variación y por lo tanto reduciendo el número de animales necesarios para detectar diferencias. Estrategias para inducir enfermedades del tendón en roedores se han basado en inducción de la química, sino también en creación quirúrgica de defectos parciales del tendón21. Modelos quirúrgicos pueden simular tendinopatías natural mejor que los modelos químicos, pero pueden conducir a mayor morbilidad y fallas catastróficas del tendón dañado. En ese sentido, las ratas parecen mejores candidatos que los ratones para estos modelos, ya que su tamaño permite creación de defectos más grandes, facilitando la evaluación de la curación del tejido. Se han utilizado ratas Sprague-Dawley en estudios experimentales de tendinopatías en cuatro grupos principales del tendón: rotura del manguito rotador, flexor, Aquiles y tendones patelar26. Entre ellos, modelos que involucran el tendón rotuliano están especialmente atractivos debido al tamaño de este tendón y la facilidad de acceso a27. El tendón rotuliano fija el músculo cuádriceps a la tuberosidad tibial. Dentro de este mecanismo extensor, la rótula es un hueso sesamoideo que se dirige la acción de los cuádriceps y delinea la parte proximal del tendón rotuliano. La presencia de anclajes óseos en las extensiones proximales y distales del tendón rotuliano facilita pruebas biomecánicas. Modelos que involucran el tendón rotuliano típicamente dependen de defectos quirúrgicos unilaterales, con un tendón intacto contralateral que sirve como un control28,29. El modelo más común de defecto de tendón rotuliano consiste en suprimir la parte central (a 1 mm de ancho) del tendón rotuliano de la cúspide distal de la rótula a la inserción de la tuberosidad tibial, mientras que el tendón rotuliano contralateral quedo intacto. Medidas de resultados incluyen histología, no biomecánicos destructivos o ensayos biomecánicos al fracaso, proyección de imagen de ultrasonido, ex vivo imágenes de fluorescencia, bruto observación y pruebas funcionales28,30 ,31. Modelos unilaterales no permiten comparación de un tratamiento propuesto con la gerencia conservadora de una lesión similar en el mismo animal. Del mismo modo, comparación entre varios tratamientos requiere animales separados. Un modelo bilateral eliminaría las variaciones interindividuales y reducir el número de animales requeridos para un estudio de32. Sin embargo, lesiones bilaterales pueden aumentar la morbilidad, y cojera bilateral podría impedir la evaluación del tratamiento. Algunos estudios reportan brevemente el uso de defectos bilaterales del tendón patelar en ratas pero se centran sobre los efectos de los tratamientos en lugar de administración perioperatoria y la morbilidad del modelo33,34.
Objetivo a largo plazo de este estudio es desarrollar una estrategia para mejorar la supervivencia de la troncalidad celular e in vivo de la UCM-MSCs destinada a trasplante alógeno. Para lograr este objetivo, hemos informado recientemente mejorado troncalidad de MSCs UCM por formación de esferoides en la película de quitosano e incubación en ambiente hipóxico35. Estas propiedades en vitro se asociaron con mejores propiedades biomecánicas del tendón rotuliano defectos tratados con acondicionado UCM-MSCs. basado en estos resultados, el modelo de rata del tendón patelar bilateral defecto parece conveniente probar candidato tratamientos para lesiones de tendón36. El objetivo del estudio aquí reportado es proporcionar protocolos detallados para aislamiento y caracterización de la UCM-MSCs, preparación de un sistema biológico para las células de vástago, creación y tratamiento de defectos de tendón rotuliana bilateral y en el post-operatorio recuperación y evaluación de la curación dentro de los defectos del tejido.

<table><tbody><tr><td>PBS 10x</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo IA</td><td>Worthington</td><td>LS004197</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>DMEM bajo</td> glucosa <td>Hyclone</td><td>SH30021. FS</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Fetal Suero Bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 100x</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Tripsina 0.25%</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Tripán azul Hyclone</td><td></td><td>SV30084.01</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Chitosán</td><td>Sigma</td><td>C3646</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Hipomona</td><td>SH30574.01</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Tubo de poliestireno de fondo redondo</td><td>Corning</td><td>149591A</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Ratón anti-caballo CD44 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1082F</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Ratón anti-rata CD90 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA47FT</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Ratón anti-caballo MHC-II (FITC)AbD</td> <td>serotec</td><td>MCA1085F</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Ratón IgG1 (FITC) - Control de Isotipos</td><td>AbD serotec</td><td>MCA928F</td><td></td></tr><tr><td>Consumible Ratón monoclonal [SN6] a CD105 (FITC)</td><td>abcam</td><td>ab11415</td><td>Ratón Consumible</td></tr><tr><td>IgG1 (FITC) - Control de Isotipo</td><td>abcam</td><td>ab91356</td><td>Ratón</td></tr><tr><td>Consumible anti-humano CD34 (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB560942</td><td>Ratón Consumible</td></tr><tr><td>IdG1 kappa (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB555748</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD</td><td>BDB559925</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>BD Citómetro de flujo Accuri C6</td><td>BD</td><td></td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Vacutainer 5 mL</td><td>Med Vet International</td><td>RED5.0</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Ácido-citrato-dextrosa</td><td>Sigma</td><td>C3821</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>JD Medical</td><td>60307-320-25</td><td></td></tr><tr><td>Consumible Ratas</td> Charles <td>River</td><td>Código de cepa: 400</td><td>Animal de experimentación</td></tr><tr><td>Kit quirúrgico para ratas</td><td>Aparato Harvard</td><td></td><td>728942 Equipo</td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica #15</td><td>MEDLINE</td><td>MDS15115</td><td>Consumible Rata</td></tr><tr><td>MD's Baytril (2 mg/Tableta), Rimadyl (2 mg/Tableta)</td><td>Bio Serv</td><td>F06801</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Polyglactin 910, 5-0</td><td>Ethicon</td><td>J436G</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Eosin alchol shandon</td><td>Thermo Consumible</td><td>de 6766007</td><td></td></tr><tr><td>científico Harris Hematoxilina</td><td>Termo científico</td><td>143907</td><td>Consumible</td></tr></tbody></table>

evaluación de terapias con células madre en un modelo de lesión del tendón patelar bilateral en ratas

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Medicina regenerativa ofrece nuevas alternativas a las condiciones que desafían a los tratamientos tradicionales. La prevalencia y morbilidad de tendinopathy en especies, combinada con las limitadas propiedades curativas de este tejido, han promovido la búsqueda de terapias celulares y propulsó el desarrollo de modelos experimentales para el estudio de su eficacia. Cordón umbilical derivados de matriz células madre mesenquimales (MSC-UCM) son candidatos atractivos porque son abundantes, fáciles de recoger, eludir las preocupaciones éticas y el riesgo de formación de teratoma, sin embargo, se asemejan a las células madre embrionarias primitivas más estrechamente que interés de MSCs. significativas derivadas de tejido adulto se ha centrado en quitosano como una estrategia para mejorar las propiedades de MSCs mediante formación esferoide. Estas técnicas de información de papel para aislar UCM-MSCs, preparar esferoides en la película de quitosano y analizar el efecto de formación esferoide en expresión superficial del marcador. En consecuencia, creación de un modelo de lesión del tendón patelar bilateral en ratas se describe para la implantación de en vivo de esferoides UCM-MSC formado en la película de quitosano. Ninguna complicación se observó en el estudio con respecto a la morbilidad, estrés aumento de efectos, o infección del tejido. La puntuación total funcional de las ratas operadas a los 7 días fue más baja que la de las ratas normales, pero volvió a la normalidad dentro de 28 días después de la cirugía. Resultados histológicos de curación de tejido confirman la presencia de un coágulo en defectos tratados evaluados a los 7 días, ausencia de reacción del cuerpo extranjero y progresiva curación a los 28 días. Este modelo de defecto del tendón rotuliana bilateral controla variación interindividual mediante la creación de un control interno en cada rata fue asociado con morbilidad aceptable y permitieron la detección de diferencias entre los tendones no tratados y tratamientos.

En el estudio actual, los resultados se presentan como media ± SD (desviación estándar). Las células fueron aisladas de los cordones umbilicales de 6 yeguas, y porcentaje de líneas celulares aisladas de expresar cada marcador superficial de la célula bajo acondicionado estándar o quitosano se compararon con una prueba de Friedman, como un análisis no paramétrico de varianza con repetidos medidas. Para la creación de modelo de defecto del tendón, se utilizaron 8 ratas para la evaluación de...

Este papel describe la preparación y la evaluación del cordón umbilical células madre mesenquimales derivadas de matriz esferoides con un modelo de defecto del tendón patelar bilateral en una rata. Este modelo se asocia con una morbilidad aceptable y encontraron para detectar diferencias entre los tendones no tratados y tratados y entre los dos tratamientos probado.

Evaluación de terapias con células madre en un modelo de lesión del tendón patelar Bilateral en ratas

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Los objetivos generales de este modelo bilateral de ratas son optimizar el uso de animales y evaluar los candidatos a tratamiento para los defectos tendinosos. Este método puede ayudar a responder cualquier pregunta clave en el campo ortopédico. Tales como la evaluación de la terapia celular sobre la tendinopatía.La principal ventaja de este modelo es que controla la variación interindividual, reduciendo así el número de animales necesarios para detectar diferencias entre tratamientos. La demostración visual del modelo es crítica porque la creación de defectos bilaterales estandarizados del tendón rotuliano en ratas es difícil de aprender. El modelo requiere un buen conocimiento de la anatomía local, sólidas habilidades quirúrgicas básicas y precisión mientras se trabaja en estructuras pequeñas.Para comenzar, lave un cordón umbilical equino cosechado dos veces en un tubo de 50 mililitros con PBS a temperatura ambiente que contenga antibióticos. A continuación, transfiera el tejido a una placa de 150 milímetros y córtelo en fragmentos de dos pulgadas de largo. Luego transfiera los fragmentos a un tubo de 50 mililitros y lávelos con PBS que contiene antibióticos para eliminar la sangre.Haga esto dos o tres veces a temperatura ambiente. A continuación, corta las partes fragmentadas del cordón umbilical longitudinalmente para exponer los vasos que recorren su longitud. Con fórceps y tijeras, extirpe estos vasos, que incluyen dos arterias y una vena.Ahora, a partir de dos o tres fragmentos, recoja la matriz gelatinosa que rodea los vasos. Ráspalo con un bisturí. A continuación, pica la matriz gelatinosa, también conocida como Jelley de Wharton, en trozos finos.A continuación, transfiera la gelatina a un tubo de 50 mililitros con 15 mililitros de colagenasa tipo 1A al 0,1% en PBS e incube el tejido a 37 grados centígrados agitando suavemente durante tres o cuatro horas hasta que se disuelva por completo. A continuación, centrifugar el tejido digerido y aspirar el sobrenadante. Ahora, suspendemos el tejido digerido en 15 mililitros de PBS y mezclamos mediante pipeteo.Luego, repita este lavado con PBS tres veces usando una centrifugación más lenta. Después del último lavado, vuelva a suspender las células en 15 mililitros de PBS y luego use un colador de células de 100 micras para filtrar las células y centrifugar durante cinco minutos a 150 veces g para recolectar las células. Vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio de cultivo recién hecho a 37 grados centígrados.Transfiera la suspensión a un matraz de cultivo de 25 centímetros cuadrados e incube las células, cambiando el medio cada tres días. Cuando las células alcancen el 70 al 80% de confluencia, páselas, aspire el medio y lave las células dos veces con PBS a temperatura ambiente sin antibióticos. A continuación, utilice tres mililitros de tripsina EDTA al 0,25% para separar las células.Termine la reacción con una adición de seis mililitros de medio tibio. Recoge las células suspendidas y pélalas. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio.Para completar el paso, vuelva a sembrar un matraz de cultivo de tejidos con 5.000 células por centímetro cuadrado y continúe cultivando el cultivo. Para comenzar, prepare una solución fresca de quitosano. Luego cargue cada pocillo de una placa de 12 pocillos con 500 microlitros de solución.Gire la placa para distribuir la solución por todas las superficies. A continuación, seque la placa en una cabina de flujo laminar. Después de 16 a 24 horas, se formará una película delgada de quitosano en los pocillos de la placa.Neutralice esta película agregando un mililitro de hidróxido de sodio normal 0.5 a cada pocillo. Luego, incuba la placa durante dos horas a temperatura ambiente. Posteriormente, aspire el hidróxido de sodio de cada pocillo y luego lave cada pocillo con un mililitro de agua destilada.Realice tres lavados con agua, luego lave cada pozo con un mililitro de etanol al 70% una vez. Después de retirar el lavado con etanol, reemplácelo con otro mililitro de etanol al 70% e incube la placa durante la noche en un gabinete de flujo laminar para esterilizar la película de quitosano. Luego, al día siguiente, aspire el etanol restante de cada pocillo y lave cada pocillo con PBS tres veces.Retire el PBS y luego esterilice aún más la película de quitosano utilizando una exposición directa durante la noche a la luz ultravioleta sin la tapa. Ahora, para formar esferoides de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical, siembra los pocillos con 20.000 células e incuba la placa en condiciones normales o hipóxicas. Coloque una rata anestesiada entre dos botellas de 0,5 litros llenas de agua tibia y cubra las botellas con un paño para mantener a la rata caliente sin sufrir lesiones en la piel.Para reducir el riesgo de hipotermia, cubra el cuerpo con plástico de burbujas. A continuación, para evitar traumatismos cutáneos, aplique la crema depilatoria sobre ambas rodillas y utilice un depresor de lengua para eliminar la crema y el vello. Luego, pega cada extremidad a la mesa.Ahora, frote el sitio quirúrgico con digluconato de clorhexidina y enjuáguelo con etanol al 70%. Haga esto tres veces y proceda con la cirugía. Con un bisturí estéril número 15, incidir la piel en dirección proximal a distal en la cara medial craneal de la pulgada.Comience la incisión aproximadamente un centímetro proximal al nivel de la rótula y extiéndala aproximadamente cinco milímetros distalmente hasta el tubérculo tibial. A continuación, libere el tejido subcutáneo subyacente con el bisturí y refleje la piel para exponer el tendón rotuliano. Ahora, alinee un alambre de Kirschner de 0,99 milímetros de diámetro contra el tendón rotuliano entre la cara distal de la rótula y la tuberosidad tibial.Luego, mientras mantiene el alambre estable, use el bisturí para hacer incisiones en ambos lados del alambre, liberando una porción de tendón de aproximadamente un milímetro de ancho. A continuación, reseca la sección central proximal y distalmente con unas tijeras finas para el iris. Paralelamente, pídale a un asistente que prepare el coágulo.Para ello, descongela la muestra de plasma y mezcla 20 microlitros con medio millón de células madre mesenquimales. A continuación, en un tubo de microcentrífuga, mezcle seis microlitros de cloruro de calcio al 10% con 100 microlitros de plasma descongelado, esto activará ese plasma. Luego, mezcle la suspensión celular en el plasma activado, esto hará que el plasma se coagule.Ahora, coloque el coágulo preparado dentro del defecto del tendón rotuliano. Limite la manipulación del coágulo para minimizar la liberación de líquido del coágulo. Luego, usando cinco o poliglactina nueve 10 suturas, cierre cuidadosamente la fascia con un patrón cruzado sin interferir con el coágulo.Termina cerrando la piel con un patrón intradérmico. Las células se aislaron de los cordones umbilicales de seis yeguas y se cultivaron en condiciones estándar o en películas de quitosano. Las células cultivadas en quitosano formaron esferoides.El modelo de defecto del tendón rotuliano se probó en muchas ratas y se utilizó una batería de pruebas de comportamiento para estimar la recuperación. A los 28 días después de la operación, las ratas habían regresado a la fuerza inicial después de un déficit inicial en la fuerza medido a los siete días después de la operación. En el examen histológico con tinción tricrómica de Masson, se observó una infiltración arterial y capilar moderada junto con una formación de colágeno de moderada a extensa, mientras que la formación de cartílago no se apoyó.En general, el modelo de defecto bilateral del tendón rotuliano limita la variación interindividual sin una morbilidad significativa. Por lo tanto, se reduce el número de animales necesarios para las pruebas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo crear un modelo de defecto de la ventana del tendón rotuliano bilateral en ratas y cómo las ratas se recuperan de esta cirugía.Una vez dominado, el procedimiento se puede realizar en menos de 30 minutos con tres investigadores. El primer investigador prepara la célula, el segundo realiza la cirugía, mientras que el tercero asiste con la cirugía y monitorea la anestesia. Después de este procedimiento, se pueden utilizar métodos como las pruebas biomecánicas, la histología y la inmunohistoquímica para comparar el efecto del tratamiento en la cicatrización del tendón.

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Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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Aprende a evaluar terapias con células madre en un modelo bilateral de lesión del tendón patelar en ratas. Este método controla la variación interindividual y reduce el número de animales necesarios para detectar diferencias entre tratamientos.

Evaluación de terapias con células madre en un modelo de lesión del tendón patelar Bilateral en ratas

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