Captura de la cinética de la interacción de una proteína de canal iónico con moléculas pequeñas por el ensayo de interferometría de la Bio-capa

El objetivo general de este ensayo de interferometría de biocapa o BLI es medir la interacción potencial entre la proteína del canal iónico hEAG1 purificada y los lípidos de moléculas pequeñas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la farmacología de canales iónicos, como si la pequeña molécula de interés puede interactuar directamente con este canal iónico y cuál es la cinética de la interacción. La principal ventaja de esta técnica es que es un método libre de mano de obra y de alto rendimiento.

Solo se necesita una pequeña cantidad de proteína inmovilizada. Por lo general, las personas que son nuevas en este método tendrán dificultades porque un ensayo exitoso implica múltiples pasos, incluida la expresión de proteínas, la purificación, el etiquetado, el sensor ajustado con precisión y el análisis de datos. Después de cultivar células T HEK293 que expresan hEAG1 durante dos o tres días, recoseche las células eliminando el medio de crecimiento y use cuatro mililitros de PBS para lavar las células dos veces.

Deseche el PBS. Separe las células en dos mililitros de PBS por plato y use una pipeta de un mililitro para transferir las células a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 420 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

A continuación, decantar el sobrenadante y utilizar cuatro mililitros de tampón de lisis para resuspender el pellet. Incubar la suspensión en hielo durante 30 minutos, vórtice completamente el lisado cada 10 minutos. A continuación, centrifuga el lisado celular a 12.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo de cinco mililitros y manténgalo en hielo para su uso inmediato. Para preparar la resina de afinidad anti-FLAG M2, suspenda completamente la resina mediante una inversión suave para asegurarse de que el frasco de gel de afinidad anti-FLAG M2 sea una suspensión uniforme de perlas de gel. Transfiera inmediatamente 400 microlitros de suspensión a un tubo refrigerado de 1,5 mililitros.

Luego, centrifuga la suspensión a 8.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 30 segundos, y desecha con cuidado el sobrenadante para lavar el tampón de almacenamiento. Para volver a suspender el pellet de resina, agregue 500 microlitros de sobrenadante de extracto de proteína a la resina y transfiera la suspensión a un nuevo tubo refrigerado de cinco mililitros. Pipetea 500 microlitros adicionales de extracto de proteína en el tubo original para recoger las perlas restantes y transfiere el extracto al tubo de cinco mililitros.

Incubar la mezcla en un agitador a ocho rpm y cuatro grados centígrados durante la noche para unir la proteína de fusión FLAG a la resina. A continuación, centrifuga la mezcla a 1.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet tres veces con 500 microlitros de un x PBS.

Manténgalo en hielo para su uso inmediato. Agregue 10 microlitros de tres soluciones de elución de FLAG a 390 microlitros de PBS para una concentración final de 200 nanogramos por microlitro. A continuación, añada 400 microlitros de tres soluciones de elución FLAG a las perlas de gel previamente preparadas.

Incubar la muestra en una incubadora agitadora a ocho rpm y cuatro grados centígrados durante dos horas. A continuación, centrifuga la resina a 8000 veces la gravedad durante 30 segundos. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mililitros y guárdelo a cuatro grados centígrados para su uso inmediato.

Utilice el ensayo de proteína BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante para determinar la concentración de la proteína purificada. A continuación, utilice una muestra de 30 microlitros para el análisis de Western Blot con un anticuerpo anti-Flag para confirmar que la proteína de interés se ha purificado. Para etiquetar la proteína purificada con biotina, prepare cinco miligramos por mililitro de solución madre de biotina en PBS.

Para cada prueba de dos biosensores, agregue un exceso molar tres veces mayor de biotina a 20 microgramos de proteína purificada para lograr una biotinilación N-terminal preferible de la proteína purificada en PBS. Incubar la muestra en la oscuridad sobre hielo durante al menos 30 minutos. Para eliminar la biotina no unida y el tampón, intercambie la proteína en tampón SD.

Transfiera la proteína a un dispositivo de ultrafiltración con un corte molecular de 30 kilodaltons. A continuación, añada un tampón SD y centrifuga la muestra a 12.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Retire el ultrafiltrado del tubo de centrífuga.

Añada 200 microlitros de tampón SD en el dispositivo de filtrado y vuelva a centrifugar la muestra. Repite el proceso al menos tres veces. Recoja la muestra intercambiada de tampón volteando el dispositivo de filtración y colóquelo en un tubo de 1,5 mililitros.

Centrifugar la muestra a 2.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Mantenga la muestra en hielo para su uso inmediato. Para realizar el ensayo BLI, 30 minutos antes del estudio, precaliente el equipo encendiendo el instrumento.

Verifique la ventana de estado del instrumento para confirmar que la máquina está en estado listo antes de comenzar. Asegúrese de que la puerta del instrumento esté cerrada antes de abrir el software de adquisición de datos y, en el asistente de experimentos, elija el Nuevo experimento cinético. Defina los pocillos que se utilizarán en la placa de 96 pocillos haciendo clic con el botón derecho para elegir el búfer, la carga y la muestra.

En el caso de los pocillos de muestra, la unidad de concentración de PIP2 debe introducirse en forma de molares. Para definir los pasos del ensayo, elija un paso y haga doble clic en la columna correspondiente. Se establece un duplicado de la definición del ensayo para los sensores de control.

Ajuste las rpm a 1, 000. Elija un minuto para el paso de línea base y de cinco a 10 minutos para la carga, la asociación y la disociación, respectivamente. Realice la prueba a temperatura ambiente.

Haga clic en las columnas que contienen los sensores y haga clic en rellenar para indicar la ubicación de los sensores en la bandeja de sensores. Revise todos los pasos planificados para verificar si hay errores y volver a corregirlos. En toda la operación del ensayo BLI, el paso de revisar todos los pasos planificados podría ser descuidado por el investigador.

Sin embargo, es muy importante comprobar que todos los pasos previstos son correctos. Establezca la ubicación de los archivos de datos y haga clic en Ir para iniciar el ensayo. Ejecute el ensayo y analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto.

Como se vio en este experimento de fijación de parche en una célula T HEK293, que expresa de manera estable hEAG1, las corrientes de potasio hacia afuera dependientes del voltaje sugieren que los canales funcionales de hEAG1 se expresan altamente en las células. Utilizando el anticuerpo anti-FLAG, este Western Blot de hEAG1 a partir de muestras de proteínas purificadas indica la calidad y la especificidad de la proteína purificada. La proteína del canal purificado se biotinila para realizar un ensayo de interacción con el lípido PIP2 mediante el ensayo BLI en tiempo real.

Aquí se muestra una curva de unión típica entre hEAG1 y PIP2. hEAG1 se une a PIP2 de forma dependiente de la concentración. Las concentraciones acumuladas de PIP2 corresponden a las trazas de datos del biosensor.

Este ensayo representativo muestra los cambios en la interferencia óptica en diferentes concentraciones de PIP2. Finalmente, se obtuvo un ajuste de la curva con la ecuación de Hill a partir del valor pico de la señal de interferencia óptica medido a diferentes concentraciones de PIP2 y se determinaron las constantes de disociación de equilibrio entre hEAG1 y PIP2. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar revisar todos los pasos planificados para asegurarse de que este procedimiento sea correcto. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la fijación de parche para responder preguntas adicionales como la identificación de la función de este canal iónico después de unirse a la molécula pequeña. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la detección de ligandos de canales iónicos exploraran los nuevos ligandos en el descubrimiento de fármacos de canales iónicos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar la proteína del canal iónico y cómo probar su interacción con moléculas pequeñas, con el método BLI.