4.7: Electroforesis en Gel bidimensional

La electroforesis en gel bidimensional, o 2D, es una técnica que utiliza dos métodos de separación distintos que pueden separar miles de proteínas de una sola mezcla. Una de las técnicas, SDS-PAGE o electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio, no puede separar completamente las mezclas complejas por sí sola. La electroforesis en gel 2D acopla el SDS-PAGE a un segundo método, el enfoque isoeléctrico o IEF, que separa en función de puntos isoeléctricos, lo que permite la resolución de potencialmente todas las proteínas en un lisado celular. Este video mostrará los principios de la electroforesis en gel 2D, un procedimiento general y algunas de sus aplicaciones biomédicas.

La electroforesis en gel 2D comienza con IEF como primera dimensión. Cada proteína tiene un valor de pH, llamado punto isoeléctrico o pI, donde la carga neta es cero. Cuando una proteína se somete a un campo eléctrico, se moverá hacia el electrodo con carga opuesta. Las muestras de interés se cargan en tiras de gradiente de pH inmovilizado, o IPG, que tienen anfolitos incrustados, moléculas que contienen grupos ácidos y básicos. A continuación, se aplica un campo eléctrico a la franja de gradiente de pH, lo que hace que las proteínas migren hasta que alcancen el valor de pH que coincida con su pI, donde pierden su carga neta.

Antes de ejecutar la segunda dimensión, las proteínas incrustadas se tratan con SDS, desnaturalizándolas y proporcionando una carga negativa uniforme. Una vez completadas, las tiras de IPG se colocan sobre un gel de poliacrilamida. Un campo eléctrico aplicado atrae las proteínas hacia el ánodo, y las proteínas más grandes se mueven más lentamente a través del gel.

Una vez que se ha separado la mezcla de proteínas según pI y peso molecular, se visualiza el mapa del proteoma mediante tinciones y se identifican las proteínas de interés.

Ahora que hemos discutido los principios de la electroforesis en gel 2D, repasemos un procedimiento típico de laboratorio.

Antes de que se pueda realizar el experimento, las proteínas deben solubilizarse en medios. La solubilización de la muestra se logra mediante la desagregación de proteínas con una combinación de agentes caotrópicos para interrumpir las interacciones de enlace de hidrógeno, detergentes no iónicos para evitar la alteración de la carga de las proteínas, agentes reductores para romper los enlaces disulfuro y tampones. Para eliminar las proteínas abundantes y otras moléculas que interfieren, el material se extrae secuencialmente por centrifugación y recolección de la pellets resultante; seguido de un tratamiento con endonucleasa, una enzima utilizada para consumir cualquier ADN que interfiera con el experimento.

Una vez que las proteínas se han solubilizado, las tiras de IPG se preparan enjuagando con una solución limpiadora de tiras y se dejan secar boca abajo. A cada tira se le asigna un número de soporte de tira. Una vez listo, el extracto celular se carga en las tiras con un movimiento lento y deslizante desde el extremo negativo al positivo. Con el fin de rehidratar, se coloca papel secante húmedo encima del electrodo y debajo de las tiras de gel; A continuación, las tiras de IPG se alinean en el instrumento IEF. Se aplica una corriente eléctrica alta y las proteínas comienzan a migrar.

Una vez completada la primera dimensión, el gel para SDS-PAGE se prepara en un aparato de fundición. Las tiras de IPG se tratan colocándolas boca abajo en un tampón de equilibrio que contiene SDS. La unidad de electroforesis se prepara con la adición de tampón de electroforesis. Las tiras de IPG tratadas se recogen con pinzas, se colocan encima de las placas de gel y se sellan con una solución selladora de agarosa. Luego, una fuente de voltaje aplica un campo eléctrico, que se mantiene hasta que las proteínas que se mueven más rápido están a 1 cm del fondo del gel.

Una vez finalizada la electroforesis, se deben visualizar las proteínas. Tradicionalmente, esto se realiza teñiendo con azul de Coomassie o nitrato de plata. Las proteínas de interés pueden transferirse del gel y analizarse mediante análisis de Western blot.

Un segundo enfoque de identificación implica la escisión de las proteínas del gel, digeriéndolas, y luego analizarlas mediante espectrometría de masas.

Ahora que hemos revisado un procedimiento, veamos algunos de los usos de la electroforesis en gel 2D.

Uno de los usos más comunes de esta técnica es la identificación de moléculas implicadas en el inicio y la progresión de la enfermedad. La electroforesis en gel 2D, junto con la espectrometría de masas, puede detectar la regulación positiva o negativa de proteínas específicas en áreas enfermas en comparación con las sanas.

Además, la electroforesis en gel 2D es útil para seguir el progreso de la respuesta de los pacientes a un posible fármaco terapéutico. Se pueden tomar muestras de los pacientes en varios momentos después de la administración del tratamiento. De esta manera, la electroforesis en gel 2D junto con el Western blot o el análisis de espectrometría de masas, pueden detectar proteínas asociadas con respuestas negativas como la inflamación; o la ausencia de proteínas en un estado aliviado.

Otro uso de la electroforesis en gel 2D es en el estudio de la estructura y función de las proteínas después de la modificación postraduccional, o PTM, que son adiciones a las proteínas después de su traducción desde el ARNm. Los PTM pueden regular una variedad de funciones, incluida la señalización de proteínas, la expresión génica o causar daño oxidativo. La electroforesis en gel 2D es sensible a modificaciones como la metilación o la acetilación, que pueden causar un cambio en el pI, así como en el peso molecular.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la electroforesis en gel 2D. En este vídeo se describen los principios de la técnica, un procedimiento experimental típico, y varias de sus aplicaciones en el campo de la biomedicina.

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