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La cristalización de proteínas es el proceso de obtener una forma sólida reticular de una proteína. Estos cristales son especialmente valiosos para los biólogos estructurales, ya que ayudan en el estudio de la función de las proteínas. Otras técnicas, como la espectrometría de masas o SDS-PAGE, solo pueden proporcionar información sobre la estructura unidimensional de las proteínas. La cristalización de proteínas se complementa con las técnicas de expresión de proteínas recombinantes y difracción de rayos X. Este video mostrará los principios de la cristalización de proteínas, un procedimiento general de laboratorio y varias de sus aplicaciones en el campo bioquímico.
El primer paso requerido en el proceso es obtener cantidades de miligramos de proteína muy pura, generalmente utilizando la expresión de proteínas recombinantes. El gen correspondiente a la proteína de interés se clona en un vector de expresión, y la proteína expresada se fusiona a una etiqueta de afinidad, como la polihistidina, para ayudar en la purificación por cromatografía de afinidad. Para obtener más información, vea el video de esta colección sobre cromatografía de afinidad.
La formación de la proteína purificada en cristales depende de la combinación adecuada de muchos factores, incluido el pH, la fuerza iónica, las concentraciones de precipitante y proteína, la temperatura y la tasa de equilibrio. El método más común utilizado es la difusión de vapor, de la cual hay dos categorías: caída colgante y caída sentada. Una gota que contiene proteína pura, tampón y precipitante, que es un sólido iónico que se une a las moléculas de agua, reduciendo la disponibilidad de agua para la proteína e imitando una mayor concentración de proteína, se encuentra en un micropozo cerrado con un depósito con una mezcla más concentrada del mismo tampón y precipitante. Al principio, las concentraciones de proteína y precipitante son demasiado bajas para causar cristalización. Durante el transcurso del experimento, el agua se vaporiza de la gota y se acumula en el depósito; Una disminución en la cantidad de agua en la gota hace que el sistema se sobresature y pueda ocurrir la nucleación, seguida de la cristalización. La transferencia neta de agua de la gota está en equilibrio y el sistema se mantiene hasta que se completa el proceso.
Para visualizar la estructura 3D, se utiliza la difracción de rayos X. Para obtener datos de rayos X de un cristal, se coloca en un haz de rayos X monocromático, donde se expone al haz en todos los ángulos. Cada exposición proporciona una imagen, donde cada punto es un rayo X difractado, que emerge del cristal y es registrado por un detector. Los datos se combinan para producir un modelo de la disposición de los átomos dentro del cristal. La estructura cristalina resultante demuestra la ubicación tridimensional de los átomos, con una resolución típica de 2 angstroms.
Ahora que hemos cubierto los principios de la cristalización de proteínas, veamos un protocolo generalizado.
Para comenzar el procedimiento, un vector de expresión que contiene el gen de interés se transforma en células. Las células se incuban y, en la fase intermedia de registro, la expresión se inicia mediante la adición de un inductor, como el IPTG, que desencadena la transcripción del ARNm del gen. Después de la expresión de la proteína, el material crudo se suspende en el tampón de lisis y luego se clarifica por centrifugación.
A continuación, el lisado clarificado se carga en una columna de níquel, y la proteína marcada con polihistidina se une a la columna mientras que todas las demás biomoléculas se eliminan.
Una vez que se han obtenido varios miligramos de proteína pura, está lista para la cristalización por difusión de vapor. Una bandeja de 24 pocillos para colgar/sentar está llena con diferentes concentraciones de cloruro de sodio y soluciones tampón de acetato de sodio. Para el método de gota sentada, se pipetean volúmenes iguales de proteína y solución de depósito en el estante encima de cada pocillo, y luego la bandeja se cubre con cinta adhesiva transparente. Luego, la bandeja se coloca en una cámara de incubación y los pocillos se monitorean para determinar su crecimiento al día siguiente, luego cada pocos días.
Una vez que se ha obtenido un cristal adecuado, está listo para el análisis de difracción de rayos X. El cristal está montado en un goniómetro para posicionar el cristal en las orientaciones seleccionadas. El cristal se ilumina con un haz monocromático de rayos X en todos los ángulos, produciendo un patrón de difracción. El software convierte las imágenes bidimensionales, tomadas en diferentes orientaciones, en un modelo tridimensional de la densidad de electrones dentro del cristal mediante la determinación de las posiciones de los átomos en el cristal.
Ahora que hemos revisado un procedimiento, repasemos algunas aplicaciones útiles de la cristalización de proteínas y otra técnica de cristalización.
La cristalización de proteínas se puede utilizar para el diseño de fármacos in silico. La estructura tridimensional de la proteína básica 2 de la polimerasa del virus de la gripe, que se ha relacionado con la infección viral en mamíferos, se determinó mediante cristalización y difracción de rayos X. Se visualizan los posibles sitios de unión en la proteína y, con el uso de un programa de acoplamiento, se diseñó una molécula tridimensional que se insertaría en una hendidura de la proteína.
La cocristalización de complejos proteína-ADN también es una técnica útil. Las proteínas de unión al ADN modulan una amplia variedad de funciones biológicas, como la transcripción y la polimerización del ADN y la reparación del ADN; Y las estructuras cristalinas de estos complejos pueden proporcionar información sobre la función de las proteínas, el mecanismo y la naturaleza de la interacción específica. La proteína SeqA de E. coli, un regulador negativo de la replicación del ADN, se cocristalizó con ADN hemimetilado.
Las proteínas de membrana integrales, como los receptores acoplados a proteínas G, o GCPR, son difíciles de cristalizar debido a su limitada cantidad de superficie polar disponible para formar contactos de red cristalina, lo que ha llevado al desarrollo de la cristalización de proteínas asistida por fusiones. Los genes que codifican el receptor adrenérgico ?2, un GCPR y una lisozima se insertaron en un vector de expresión. La cristalización de la proteína de fusión ?2AR-lisozima se logró debido al aumento de la superficie hidrofílica extracelular sobre el ?2AR naturalmente hidrofóbico, proporcionado por la lisozima, necesaria para formar interacciones de empaquetamiento en la red cristalina.
Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la cristalización de proteínas. En este vídeo se describen sus principios, un protocolo generalizado y algunos de sus usos en el ámbito biomédico. ¡Gracias por mirar!
