Uso del traste de una sola molécula a estudiar la correlación de las interacciones proteína

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la dinámica de sistemas complejos de proteínas de una manera cuantitativa con un enfoque en interacciones correlacionadas como la cooperatividad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología cuantitativa, donde los complejos de proteínas y sus interacciones dinámicas son de importancia central. La principal ventaja de esta técnica es que permite aplicar FRET dinámico de molécula única multicolor a sistemas biológicamente relevantes.

Antes de ensamblar la cámara de flujo, corte un canal de flujo en una película adhesiva transparente de 40 micras de espesor, rocíe adhesivo de fijación rápida en el lado no adhesivo de la película y deje que el adhesivo se seque. Para comenzar el ensamblaje de la cámara de flujo, obtenga un portaobjetos de cuarzo fundido funcionalizado PEG de biotina PEG de tres milímetros de espesor con orificios de entrada y salida. Aplique el lado recubierto de adhesivo en aerosol de la película del techo en el lado funcionalizado de la corredera, alineando el canal con los ganchos de entrada y salida.

Caliente el portaobjetos a 80 grados centígrados en una placa caliente durante un minuto. Presione la película sobre el portaobjetos durante 30 segundos con un portaobjetos de microscopio adicional para distribuir la presión de manera uniforme. Y luego deje que el conjunto se enfríe durante un minuto.

Despegue la lámina protectora que cubre el adhesivo. Coloque un cubreobjetos sobre el adhesivo expuesto para formar la cámara de flujo. Caliente la cámara a 80 grados centígrados durante un minuto.

Presione el deslizamiento de la cubierta sobre el adhesivo durante 30 segundos para sellar la cámara y permitir que la cámara ensamblada se enfríe. Aplique una gota de glicerol en la cara del prisma antes de colocar la cámara de flujo sobre el prisma. Monte la cámara de flujo en un soporte para un microscopio TIRF de tipo prisma multicolor.

Conecte los tubos de entrada y salida cuando termine. Para comenzar a configurar el instrumento para la medición de tres colores, abra el software de la cámara CCD de multiplicación de electrones, configure el sensor EMCCD a la temperatura más baja posible. Establezca la velocidad de desplazamiento vertical de la cámara en 3,3 microsegundos, elija el voltaje de reloj vertical normal, configure la tasa de lectura horizontal en 17 milihercios a 16 bits, la ganancia de preamplificación en tres y el nivel de ganancia del multiplicador de electrones en 1000.

Elija la activación de adquisición externa. Ajuste el tiempo de exposición a 70 milisegundos. Y la duración de la grabación de películas a 750 ciclos de adquisición.

Cree una nueva carpeta para los archivos de medición. Habilite el guardado automático en el software EMCCD y establezca el formato de archivo de fotogramas de película en TIFF. Establezca la ruta del archivo de guardado automático en la carpeta recién creada.

A continuación, abra el software que controla el filtro sintonizable acústico-óptico, el software de control láser y el software de disparo que sincroniza los láseres, el AOTF, los obturadores ópticos y las cámaras. Utilice el AOTF para ajustar la potencia del láser a unos tres milivatios antes de entrar en el prisma. Cargue el patrón de disparo que sincroniza todos los dispositivos para la excitación láser alterna y, a continuación, monte el portamuestras en el instrumento.

Coloque el extremo del tubo de entrada en un tubo de microcentrífuga que contenga el tampón del experimento. Conecte el tubo de salida a una bomba de jeringa configurada para el modo de extracción. Enjuague la cámara con 150 microlitros de tampón.

Enfoque la cámara CCD en la interfaz funcionalizada, alinee los haces de excitación y blanquee los contaminantes fluorescentes. A continuación, fluya 300 microlitros de una solución de 0,25 miligramos por mililitro de avidina desglicosilada y tampón en la cámara e incube durante un minuto. Enjuague la avidina desglicosilada no unida de la cámara con tampón.

A continuación, haga fluir 300 microlitros de tampón con una concentración de BSA de 0,5 miligramos por mililitro a través de la cámara para bloquear los defectos de funcionalización de la superficie. A continuación, cargue la cámara de flujo con porciones de 150 microlitros de Hsp90 biotinilado marcado con fluorescencia en tampón que contiene BSA a concentraciones crecientes de Hsp90 hasta que se logre una densidad superficial suficiente. Lave la proteína no unida de la cámara con 300 microlitros de tampón que contiene BSA.

Cargue 150 microlitros de una solución de 25 nanomolares de tampón marcado con AMP-PMP y BSA en la cámara e incube durante cinco minutos. Repita la carga y la incubación una vez. A continuación, utilice un paso piezoeléctrico para mover la cámara de muestras perpendicular al haz de excitación para cambiar el campo de visión según lo desee.

Ajuste el enfoque de la imagen si es necesario. Inicie las grabaciones de la cámara en el software de la cámara haciendo clic en el botón tomar señal como se muestra. Inicie los ciclos de adquisición de excitación en el software de disparo para comenzar la adquisición de datos.

Para comenzar el análisis de datos, abra el software de análisis e importe los vídeos grabados de las dos cámaras. Haga clic en buscar trazas para determinar las trazas de intensidad de fluorescencia correspondientes a posibles moléculas individuales. Para cada molécula, calcule la suma de todas las trazas de esa mancha con el mismo color de excitación.

Evalúe los perfiles de intensidad en todos los canales para obtener una meseta más o menos plana en la intensidad bruta de la unión y un solo paso de blanqueo para todos los colores de excitación. Busque el comportamiento anticorrelacionado en los canales de detección apropiados y la aparición de fluorescencia roja en la traza. Si se cumplen todos los criterios, guarde las trazas de fluorescencia para un análisis posterior.

Solo la molécula indicada cumple los criterios de este ejemplo. Excluya las trazas que no tengan mesetas planas, que muestren eventos de parpadeo en lugar de anticorrelación o que tengan varios pasos de blanqueo. La selección de trazas es un paso crítico en todas las técnicas de moléculas individuales.

Solo se deben seleccionar los seguimientos que cumplan criterios bien definidos. En este caso, estos criterios son la anticorrelación, los pasos únicos de blanqueo y las mesetas planas. A continuación, muestre las moléculas guardadas una tras otra y un conjunto de trazas de intensidad seleccionará un intervalo de tiempo en el que todos los pisos cuatro ya están blanqueados.

Calcule la intensidad de fondo del haz para este intervalo de tiempo, luego seleccione el rango de eficiencia FRET en el que ambos tintes en Hsp90 están presentes, asegurándose de excluir las trazas con eventos parpadeantes. Calcule las trazas parciales de fluorescencia. Excluya las moléculas con una baja relación señal/ruido en las trazas.

A continuación, genere proyecciones 2D vinculantes de los datos de fluorescencia parcial e inicie la herramienta de cálculo de población relativa. Haga clic en Inicializar. Dibuja un polígono alrededor del pico de interés.

Y haga clic en recuento para calcular la población relativa para ese pico. Genere un histograma 3D de los datos de fluorescencia parcial y normalice el histograma. Excede los parámetros iniciales para un ajuste gaussiano 3D y suma las poblaciones de estado al final del vector de parámetros.

Ajuste los datos y muestre los resultados. Después de definir la posición y el ancho de cada estado en el espacio fluorescente parcial 3D, inicialice la interfaz del modelo de Markov oculto. Seleccione el número adecuado de estados, el número de dimensiones de la señal de entrada y el tipo de entrada.

Optimice los parámetros de HMM para determinar los estimadores de máxima verosimilitud para las probabilidades de transición. Repita la selección de población, el ajuste y la optimización de HMM para los subconjuntos de datos. Por último, calcule el intervalo de confianza para las probabilidades de transición y contraiga los estados conformacionales para simplificar los datos para su posterior análisis.

Los estados conformacionales de la proteína Hsp90 se estudiaron con FRET de una sola molécula de tres colores en presencia del nucleótido reportero marcado AMP-PMP. Cinco estados conformacionales fueron distinguidos por intensidades de fluorescencia, con cuatro de esos estados siendo funcionalmente distintos. El FRET de una sola molécula de tres colores dio como resultado los datos de fluorescencia parcial que abarcan un espacio 3D.

Se utilizaron proyecciones 2D para ayudar a separar los estados, ya que todos los estados teóricamente esperados en las condiciones del experimento se distinguen por su fluorescencia parcial en las proyecciones 2D. Las poblaciones relativas de estos estados se determinaron a partir de las proyecciones 2D y se utilizaron como restricciones para los ajustes gaussianos 3D. La posterior optimización y modelado de HMM 3D proporcionó las probabilidades de transición de estado extraídas.

Se calcularon intervalos de confianza para cada constante de tasa extraída. La repetición de los experimentos en presencia de 250 micromolares adicionales de AMP-PMP sin marcar aclaró la influencia de la unión de un nucleótido en el segundo sitio de unión en el dímero Hsp90. El colapso de las conformaciones ligadas y no ligadas permitió el cálculo del tiempo de permanencia promedio para la disociación fluorescente de AMP-PMP de Hsp90 en presencia y ausencia de AMP-PMP adicional no marcado.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer información cinética de un sistema de proteínas dinámicas utilizando FRET multicolor y un microscopio TIRF. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en ciencias de la vida determinen interacciones correlacionadas en sistemas de proteínas múltiples. Esto es importante para una comprensión más profunda de los mecanismos reguladores fundamentales, como la cooperatividad.