Combinar el análisis cuantitativo de la toma de comida y por la fuerza activando las neuronas para estudiar apetito en Drosophila
24 de abril de 2018
Ensayos cuantitativos de consumo de alimentos con alimentos teñido proporcionan un robusto y alto rendimiento significa evaluar motivación alimentación. Combinando el análisis de consumo de alimentos con thermogenetic y optogenetic pantallas es un poderoso enfoque para investigar los circuitos neurales subyacentes apetito en adulto melanogaster del Drosophila.
El objetivo general de este procedimiento es medir cuantitativamente la ingesta de alimentos de Drosophila adulta, lo que proporciona un medio para evaluar los efectos de manipulaciones genéticas como las activaciones termogenéticas y optogenéticas de las neuronas. Estas medidas pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la alimentación, como la neuromecánica del hambre, la saciedad y el apetito. La principal ventaja de esta técnica es que cuantifica simultáneamente la ingesta de alimento de múltiples grupos de moscas, lo que la hace especialmente útil para identificar moscas que se alimentan anormalmente en cribados genéticos.
Para comenzar, reúna los suministros para preparar el recipiente exterior. Suspende 0,5 gramos de agarosa y 50 mililitros de agua bidestilada. Calentar con agitación frecuente y hervir hasta que se disuelva completamente en un agitador magnético con una placa de calor.
Cuando el 1% de agarosa se enfríe a unos 60 grados centígrados, transfiera cinco mililitros a un recipiente exterior vacío y mantenga el recipiente abierto hasta que la agarosa se haya enfriado a temperatura ambiente para producir una almohadilla de agarosa. A continuación, añade 0,5 gramos de agarosa a 50 mililitros de agua bidestilada. Calentar con agitación frecuente y hervir para que se disuelva completamente en un agitador magnético con una placa calefactora.
Cuando el 1% de agarosa se enfríe a unos 60 grados centígrados, agregue 1,71 gramos de sacarosa a la agarosa para obtener 100 milimoles de sacarosa. Agregue 0,25 gramos de tinte azul a la solución de agarosa para obtener un 0,5% de peso por volumen de alimento teñido etiquetado. A continuación, prepare el recipiente interior.
Coloque los recipientes vacíos dentro de una superficie horizontal plana. A continuación, añada 750 microlitros de alimento etiquetado con tinte azul a los envases individuales de alimentos. Deje que se solidifique durante al menos cinco minutos.
Transfiera un recipiente interior lleno a un recipiente exterior preparado y colóquelo en el centro de la almohadilla de agarosa. Prepare las cámaras de alimentación con alimentos sin colorantes para la sustracción de fondo. Deje las cámaras de alimentación abiertas a temperatura ambiente durante 40 minutos, hasta que la pared del recipiente exterior esté libre de condensación.
Antes de los experimentos de comportamiento, equilibre las cámaras de alimentación preparadas a la temperatura experimental de 30 grados centígrados durante dos horas para garantizar que la temperatura sea relativamente uniforme en las cámaras de alimentación. Para comenzar el proceso de alimentación, transfiera con cuidado 20 moscas de su vial doméstico a una cámara de alimentación precalentada mediante golpecitos suaves. Continúe el proceso de alimentación a 30 grados centígrados durante 60 minutos.
Deje de alimentar congelando las cámaras de alimentación a menos 80 grados centígrados durante 30 minutos. Transfiera con cuidado 20 moscas de un vial a una cámara de alimentación dando golpecitos suaves. Y luego coloque la cámara de lado en la configuración de iluminación.
Para la manipulación optogenética, utilice una matriz de LED naranjas como fuente de estimulación de luz y fije una placa de plexiglás horizontal sobre los LED para soportar las cámaras de alimentación durante la iluminación. Mantenga la instalación en una incubadora a 25 grados centígrados con 60% de humedad. Estimular el control genético de moscas en paralelo con las moscas Taotie-GAL4 UAS CsChrimson, pero en diferentes cámaras de alimentación.
Continúe el proceso de alimentación durante 60 minutos con la luz de fondo iluminada por la luz naranja. A continuación, congele las cámaras de alimentación a 80 grados centígrados negativos durante 30 minutos. Después de cesar la alimentación, vierta las 20 moscas de la cámara de alimentación en un trozo de papel de pesaje.
Luego transfiéralos a un tubo de 1,5 mililitros con un cepillo suave. Agregue 500 microlitros de PBST al tubo y homogeneice las moscas usando un molino de molienda a 60 hercios durante cinco segundos. A continuación, confirme una homogeneización suficiente mediante la observación cuando no haya fragmentos detectables de partes del cuerpo.
Gire los tubos con homogeneizados durante 30 minutos a 1300 RPM para limpiar los residuos. Después de la centrifugación, transfiera 100 microlitros de sobrenadante a un pocillo de placa de 96 pocillos. Para evitar el error de cálculo de los absorbentes causado por los residuos, saque suavemente el tubo utilizado de la centrífuga y deje caer con cuidado el sobrenadante sin alterar la paleta.
Una vez cargadas todas las muestras, coloque la placa en un lector de placas para medir los absorbentes de las muestras a 630 nanómetros. La respuesta alimentaria se cuantificó mediante la inspección visual y la puntuación de las moscas con tinte detectable en el intestino. Después de la activación de las neuronas Taotie, alrededor del 58% de las moscas Taotie dTRPA1 exhibieron fuertes comportamientos alimenticios.
Y el 23% de ellos mostraron conductas alimentarias leves. Las neuronas Taotie-GAL4 activadas agudamente por TRPA1 aumentaron drásticamente la ingesta de alimentos, lo que sugiere que las neuronas marcadas con Taotie-GAL4 participan en la regulación de la ingesta de alimentos de Drosophila adulta. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la cantidad de ingesta de alimentos después de manipular la actividad de las neuronas para investigar los mecanismos neurológicos del control de la alimentación en Drosophila melanogaster adulta.
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Descripción general
Este artículo describe un ensayo cuantitativo de ingesta alimentaria mediante alimento teñido para evaluar la motivación alimentaria en adultos de Drosophila melanogaster. El método permite un análisis de alto rendimiento y puede combinarse con cribados termogenéticos y optogenéticos para explorar los circuitos neuronales implicados en la regulación del apetito.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del comportamiento
- Genética
Antecedentes
- Comprender el comportamiento alimentario es fundamental para obtener información sobre la regulación del apetito.
- Las manipulaciones genéticas pueden influir en la motivación para alimentarse y en la saciedad.
- Se necesitan métodos de alto rendimiento para analizar múltiples sujetos simultáneamente.
- Drosophila melanogaster sirve como organismo modelo para estudiar estos mecanismos.
Objetivo del estudio
- Medir cuantitativamente la ingesta de alimento en Drosophila adulta.
- Evaluar los efectos de manipulaciones genéticas sobre el comportamiento alimentario.
- Investigar la neuro-mecánica del hambre y el apetito.
Métodos Utilizados
- Preparación de alimento a base de agarosa para el ensayo.
- Uso de alimento teñido para rastrear el consumo.
- Aplicación de técnicas termogenéticas y optogenéticas.
- Medición simultánea de la ingesta de alimento en múltiples grupos de moscas.
Resultados principales
- El ensayo cuantifica eficazmente la ingesta de alimento en diversos contextos genéticos.
- Identifica moscas con patrones de alimentación anormales en cribados genéticos.
- Proporciona información sobre los circuitos neuronales que regulan el apetito.
- Demuestra la robustez del método para análisis de alto rendimiento.
Conclusiones
- El ensayo de ingesta de alimento es una herramienta valiosa para estudiar el comportamiento alimentario.
- Combinar este método con manipulaciones genéticas mejora la comprensión de la regulación del apetito.
- Estudios futuros pueden aprovechar este enfoque para explorar comportamientos alimentarios complejos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los ensayos cuantitativos de ingesta alimentaria combinados con la activación de neuronas en Drosophila permiten una interrogación precisa de los circuitos neuronales que regulan el apetito y el comportamiento alimentario. Este enfoque facilita la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en vías neurobiológicas implicadas en trastornos metabólicos y del apetito. La escalabilidad del método y sus resultados cuantitativos lo posicionan como una plataforma robusta para el cribado genético de alto rendimiento y el análisis funcional de vías en procesos de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la validación funcional de dianas neuronales que influyen en la motivación para alimentarse y la saciedad.
- Apoya la desestimación mecanicista al vincular la activación neuronal con resultados conductuales cuantificables.
- Facilita la selección de vías candidatas para investigaciones posteriores en modelos de enfermedades metabólicas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un ensayo estandarizado y cuantitativo para evaluar perturbaciones genéticas y farmacológicas.
- Permite mediciones reproducibles y de alto rendimiento del consumo de alimento en múltiples grupos experimentales.
- Posibilita la identificación confiable de fenotipos anormales de alimentación en cribados genéticos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con mecanismos relevantes para la enfermedad al modelar la regulación del apetito en un sistema manejable.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de dianas neurobiológicas.
- Ofrece valor predictivo para estudios posteriores en modelos de orden superior de trastornos alimentarios.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
Este método se integra en la continuación del descubrimiento, desde la prueba temprana de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos y la selección de modelos preclínicos.
- Biología del Descubrimiento: La medición cuantitativa de la ingesta de alimento permite la interrogación basada en hipótesis de circuitos neuronales.
- Selección: La estandarización y escalabilidad del ensayo respaldan flujos de trabajo robustos para cribados genéticos y farmacológicos.
- Análisis: La cuantificación basada en absorbancia proporciona lecturas objetivas y comparables para el análisis entre condiciones.
- Investigación Traducional: Los resultados funcionales informan el alineamiento de biomarcadores y la continuidad traslacional para dianas relacionadas con el apetito.
- Reutilización Empresarial: La plataforma de ensayo es adaptable para diversas manipulaciones genéticas y campañas de cribado.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos neuronales y reduce la ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Proporciona resultados de ensayos estandarizados, reproducibles y escalables para uso entre equipos.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción del proyecto y la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en hipótesis biológicas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de objetivos neurobiológicos en las líneas de investigación de enfermedades metabólicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en genética de Drosophila y técnicas de manipulación neurogenética.
- Necesita acceso a lectores de placas, configuraciones de estimulación con temperatura y luz controladas, e infraestructura básica de biología molecular.
- Exige la estandarización entre equipos de las condiciones del ensayo y los protocolos de análisis de datos.
- Adaptable a diversos fondos genéticos y objetivos neuronales dentro del modelo Drosophila.
- Las limitaciones incluyen las restricciones del organismo modelo y la necesidad de una cuidadosa sustracción del fondo en las mediciones de absorbancia.
