Sola célula microfluídicos análisis de Bacillus subtilis

El objetivo general de esta configuración experimental microfluídica es permitir la observación a largo plazo de células bacterianas individuales en condiciones ambientales constantes y altamente controladas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología bacteriana, como cuáles son los patrones de respuesta a largo plazo de las células individuales al estrés o cómo varía un fenotipo heterogéneo en una población con el tiempo. La principal ventaja de esta técnica es que podemos observar linajes celulares individuales durante decenas o incluso cientos de generaciones, en condiciones ambientales constantes, uniformes y altamente controladas.

Después de preparar el polímero PDMS de acuerdo con el protocolo de texto, coloque un maestro de silicona sobre un trozo de papel de aluminio intacto en una placa de Petri de poliestireno. Vierta la mezcla de PDMS desgasificada sobre el maestro a una profundidad de aproximadamente cinco milímetros. A continuación, desgasifica el plato durante al menos 10 minutos.

Cura el PDMS en un horno a 60 grados centígrados durante al menos una hora y enfríalo a temperatura ambiente. A continuación, retire de la placa el papel de aluminio que contiene el PDMS maestro y curado. Márcalo con cuidado y retira el papel de aluminio de la parte posterior del maestro.

A continuación, pele con cuidado el PDMS del maestro. Como oblea, suelen incluir varios dispositivos microfluídicos con dimensiones ligeramente diferentes. Use un bisturí limpio y afilado para cortar un solo dispositivo al tamaño adecuado.

Coloque un trozo de cinta de oficina translúcida sobre el lado estampado del dispositivo para mejorar la visibilidad de las características estampadas. Los puertos de entrada y salida se identifican como áreas circulares en los extremos opuestos de los canales fluídicos visibles. Voltee el dispositivo PDMS con el patrón hacia abajo y use un punzón de biopsia de 0.75 milímetros para perforar el dispositivo hasta los puntos marcados.

A continuación, desecha los punzones. Es posible que se requiera una pinza para quitar los punzones del dispositivo. Inserte la cubierta de vidrio limpia y seca y el dispositivo PDMS en un limpiador de plasma de oxígeno y trate el dispositivo con plasma con la configuración que se muestra aquí.

Inmediatamente después de que finalice el tratamiento con plasma, retire el dispositivo y la cubierta de vidrio del limpiador de plasma. Invierta el PDMS y colóquelo en el centro del vidrio de cubierta para que el lado del patrón toque el vidrio. Asegúrese de que los canales de alimentación estén alineados con el acceso prolongado del cubreobjetos.

Presione muy suavemente para asegurarse de que el PDMS se selle contra el vidrio. Hornee el dispositivo ensamblado en un horno a 60 grados centígrados durante al menos una hora. Después de hornear, verifique manualmente que el PDMS esté adherido al vidrio empujando suavemente una esquina del dispositivo.

Después de cortar el tubo de polímero de acuerdo con el protocolo de texto, ensamble las uniones en Y para las válvulas de pellizco, si las usa, cortando y conectando longitudes de dos centímetros de tubo de silicona flexible a las lengüetas superiores de la Y y longitudes de un centímetro de tubo de silicona a la lengüeta inferior de la Y.A continuación, corte longitudes de 10 centímetros de tubo de polímero y luego conéctelos en un extremo a la unión del interruptor insertándolos en los segmentos de tubo de silicona de un centímetro en Conecte las longitudes de tubo en el otro extremo a agujas de calibre 21 que se hayan extraído de sus adaptadores de jeringa de plástico y dobladas aproximadamente 90 grados, aproximadamente nueve milímetros desde el extremo de la aguja. Conecte agujas romas de calibre 21 a un extremo de los segmentos del tubo que irán desde las jeringas hasta el aparato del interruptor insertando las agujas en el tubo. Inserte los otros extremos de cada tramo de tubo en los segmentos de tubo de silicona en las lengüetas de entrada de las uniones en Y.

Después de llenar las jeringas con medio de crecimiento bacteriano, complementado con BSA, de acuerdo con el protocolo de texto, conecte las jeringas cargadas a las agujas de calibre 21 preparadas, conéctelas al tubo de entrada y cargue las jeringas en las bombas de jeringa. Purgue el aire de la tubería de entrada haciendo funcionar las bombas de jeringa a un caudal alto y orientando las bombas de jeringa verticalmente, golpeando las jeringas para llevar las burbujas de aire a la parte superior. Una vez que se haya purgado el aire de la jeringa, coloque la bomba de jeringa horizontalmente y golpee o mueva progresivamente las líneas de polímero de las jeringas, hacia arriba a través del aparato de interruptor para desalojar y purgar las burbujas de aire.

Repita este proceso para el segundo banco de jeringas si cambia de medio. Después de purgar las burbujas de aire, ajuste la bomba de jeringa de fase dos a 1,5 microlitros por minuto y luego detenga el flujo. Coloque pequeños clips de aglutinante en los segmentos de tubería flexible en la rama de las uniones en Y correspondientes a la segunda fase del medio y continúe haciendo funcionar la bomba de la fase uno para purgar el segundo medio aguas abajo de la unión en Y.

Para cargar el dispositivo PDMS, comience colocando suavemente las puntas de micropipeta vacías y delgadas con carga de gel en los orificios de salida del dispositivo microfluídico. Utilizando puntas finas de carga de gel con la micropipeta P200, pasivar el dispositivo inyectando un medio que contenga un miligramo por mililitro BSA en los orificios de entrada, observando las puntas y los orificios de salida para controlar el llenado de los canales microfluídicos. Incube el dispositivo a temperatura ambiente durante aproximadamente cinco minutos.

A continuación, utilizando puntas similares, cargue cada canal con las células resuspendidas utilizando las puntas del canal de salida para controlar el progreso de las células a través del dispositivo. Retire suavemente las puntas de carga de gel de los orificios de salida, trabajando una a la vez para evitar daños al dispositivo. Centrifugar el dispositivo en una microcentrífuga de sobremesa en un adaptador de rotor adecuado a aproximadamente 6.000 veces g durante 10 minutos.

Verifique la carga exitosa bajo el microscopio pero sin fijar el dispositivo al inserto de la platina del portaportaobjetos. Monte con cuidado el dispositivo cargado en un inserto de platina pegando con cinta adhesiva el vidrio de cubierta a cada lado del PDMS a la parte inferior del inserto de platina. Invierta el conjunto del dispositivo de inserción de etapa de modo que el PDMS quede hacia arriba y colóquelo sobre una superficie suave, como una toallita sin polvo.

Ajuste el caudal de la bomba de jeringa de fase uno a 35 microlitros por minuto. A continuación, trabajando con un carril a la vez, inserte la aguja de entrada y, a continuación, la aguja de salida que va hasta el vaso de precipitados. Después de inspeccionar visualmente el dispositivo en busca de fugas, examine el tubo de salida para detectar la apariencia de un exceso de células que aparecen como una franja turbia en el menisco medio, que se moverá lentamente hacia el vaso de precipitados.

Una vez que el dispositivo haya funcionado durante aproximadamente 15 minutos, ajuste la bomba de jeringa de fase uno a 1,5 microlitros por minuto y detenga el flujo. Lleve toda la bomba y el aparato del dispositivo a un microscopio fluorescente invertido y reinicie el flujo del medio de fase uno a 1,5 microlitros por minuto. Monte con cuidado el inserto de la platina con el dispositivo en el microscopio, usando cinta adhesiva según sea necesario para enrutar los tubos de entrada y salida.

Ubique las posiciones apropiadas en el dispositivo para la obtención de imágenes y comience a tomar imágenes como desee. Tenga en cuenta que las células suelen requerir unas pocas horas para leer el crecimiento de fase exponencial en estado estacionario, y el inicio de la adquisición de imágenes puede retrasarse según se desee para que las imágenes comiencen después del período de equilibrio. Para cambiar el medio entre rondas sucesivas de imágenes, detenga el flujo de la bomba de jeringa de fase uno, suelte con cuidado los clips de carpeta del tubo de silicona de fase dos, moviendo cada uno al tubo de silicona en la rama de fase uno de la unión en Y, luego detenga el flujo de la bomba de jeringa de fase dos y continúe con la toma de imágenes.

Según lo evaluado por microscopía de contraste de fase, antes de conectar la tubería microfluídica al dispositivo, la carga celular inicial se consideraría exitosa si todos o casi todos los canales laterales microfluídicos contenían una o más células bacterianas. Una vez que el dispositivo se carga inicialmente, se equilibra a un caudal relativamente alto. Como se muestra aquí, la inspección microscópica de un dispositivo equilibrado debería revelar unas pocas células confinadas en fila india en la mayoría de los canales laterales.

Una vez que se coloca un dispositivo equilibrado en el microscopio bajo un flujo de 1,5 microlitros por minuto a 37 grados Celsius, las células reanudarán un crecimiento de fase exponencial uniforme y constante en el transcurso de aproximadamente dos horas. Las células que han reanudado el crecimiento de la fase exponencial se pueden obtener imágenes fiables mediante microscopía de campo claro o de fluorescencia durante al menos 24 horas. La introducción de un interruptor de medio amplía la gama de experimentos que se pueden realizar, pero también aumenta la frecuencia de eventos catastróficos de muerte celular a través de la presencia de burbujas de aire o grupos de células en la entrada que se desprenden y pasan a través del canal de alimentación.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente cinco horas, si se realiza correctamente. Mediante el uso de este procedimiento, con diferentes reporteros fluorescentes, cepas y condiciones ambientales, se puede examinar una amplia variedad de fenómenos fisiológicos, incluidos eventos muy raros o transitorios.