Un método de cultura cooperación para investigar la interferencia entre rayos x irradia PBMC y células Caco-2

El objetivo general de este protocolo de cocultivo es medir los efectos de la radiación ionizante sobre la permeabilidad de la monocapa de células epiteliales de Caco-2 y la función de unión estrecha en presencia o ausencia de células mononucleares de sangre periférica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología de la radiación y la radioinmunoterapia sobre los posibles efectos sinérgicos entre la exposición a la radiación ionizante y las funciones de las células inmunitarias. Las principales ventajas de esta técnica son que se pueden probar diferentes estímulos y poblaciones celulares y observar fenómenos desacoplados a través de mediciones complementarias ad hoc.

Los procedimientos de radiación tienen como objetivo considerar la monocapa de células Caco-2 a medida que se irradia el volumen tumoral con el haz adecuado y una dosimetría precisa como es el caso de la radioterapia en el paciente. Una semana antes de su irradiación, sembrar cinco veces 10 a la quinta células de Caco-2 en dos mililitros de medio completo en un cultivo celular estéril de un micrómetro de diámetro de poro insertado por pocillo en una placa de cultivo celular de seis pocillos. Agregue tres mililitros de medio completo fresco en el compartimento inferior de cada pocillo y coloque las células en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante siete días.

El último día de la incubación añadir 25 mililitros de Ficoll a un tubo cónico de 50 mililitros. Y coloque cuidadosamente 25 mililitros de sangre entera recién recolectada sobre el Ficoll. Separar las células mediante centrifugación en gradiente de densidad.

Y use una pipeta Pasteur para transferir las células mononucleares de sangre periférica o PBMC en la interfaz a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, lave el PBMC aislado en dos lavados de PBS de 10 mililitros. Y cultive el PBMC en medio fresco y completo durante no más de tres a cinco horas en la incubadora de cultivo celular.

Establezca la energía de los rayos X de los fotones en un pico de seis megavoltios. Y colocar el cultivo celular de Caco-2 en una lámina de plexiglás de 1,4 centímetros de espesor dentro de la trayectoria de los rayos X y a 100 centímetros de la fuente de radiación. A continuación, coloque un bolo de 0,57 centímetros de grosor en cada muestra para garantizar el equilibrio del componente de radiación retrodispersado y las partículas cargadas.

Y use un campo de radiación plano y simétrico de 20 por 20 centímetros cuadrados y una tasa de dosis de tres grises por minuto para irradiar las células. Para evaluar la actividad metabólica y la viabilidad de las células Caco-2, siembre dos veces 10 a la quinta célula de Caco-2 en cada pocillo de una placa de 24 pocillos 24 horas antes de su irradiación en 1,25 mililitros de medio completo. A continuación, regrese las células a la incubadora de cultivos celulares durante 21 horas.

Al día siguiente, agregue 100 microlitros de cinco miligramos por mililitro de solución de MTT a cada pocillo e incube las células durante otras tres horas. Después de lavar las células con un mililitro de PBS, agregue 500 microlitros de dimetilsulfóxido a cada pocillo para disolver los cristales de formazano liberados por las células de Caco-2 y evalúe la absorbancia con un lector de placas de pocillos múltiples a una lambda de 570 nanómetros. Para evaluar la viabilidad de las células de Caco-2, se lavar las células con un mililitro de PBS por pocillo seguido de un desprendimiento de las células con 100 microlitros de solución de tripsina-EDTA durante dos minutos a 37 grados Celsius y 5% de CO2.

Detenga la reacción con 500 microlitros de medio completo y transfiera las células a tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros para la centrifugación. Vuelva a suspender los gránulos en 50 microlitros de PBS por tubo y mezcle las suspensiones celulares resultantes con un volumen igual de solución de colorante de viabilidad Trypan Blue. Después de tres minutos a temperatura ambiente, cuente el número de células viables no teñidas y no viables en el hemocitómetro.

Para evaluar la resistencia eléctrica transepitelial o TEER de las células de Caco-2, inmediatamente después de la irradiación, transfiera la mitad de los insertos de cultivo de células de Caco-2 a una nueva placa con tres mililitros de medio completo fresco en cada pocillo y la mitad de los cultivos de insertos a una nueva placa sembrada con dos veces 10 a la sexta PBMC por tres mililitros de medio completo por pocillo. A continuación, coloque un electrodo de palillo TEER en el inserto de cultivo celular cada hora durante las primeras seis horas y luego cada tres horas hasta 48 horas después de la irradiación. Para el análisis de Western blot, 48 horas después de su irradiación lisar las células de Caco-2 y PBMC con 40 microlitros por una vez 10 a la sexta celda de tampón de lisis celular.

Al lisar y raspar las células de Caco-2, tenga cuidado de no separar la membrana porosa del inserto, lo que puede resultar en una pérdida de lisado celular y un resultado sesgado. Almacene las muestras de células lisadas a menos 20 grados centígrados. Después de cuantificar la cantidad total de proteína en cada muestra de lisis celular por el método del ácido bicinconínico, agregue volúmenes iguales de tampón de muestra Laemmli suplementado con beta-mercaptoetanol a cada muestra de proteína total en tubos de microcentrífuga individuales.

Calentar las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, recoja las proteínas desnaturalizadas por centrifugación y cargue volúmenes totales de proteínas iguales de cada muestra en un gel prefabricado del cuatro al 20%. Haga funcionar las muestras durante una hora a 120 voltios.

A continuación, utilice un sistema de transferencia eléctrica semiseco para transferir las proteínas a una membrana de fluoruro de polivinilideno. A continuación, coloque la membrana en un recipiente y bloquee los sitios de unión inespecíficos con leche en polvo descremada al 5% en PBS suplementada con 0,2%Tween 20 durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Al final de la incubación de bloqueo, lavar la membrana tres veces con 10 mililitros de 0,2%PBS Tween 20 durante cinco minutos por lavado y etiquetar la membrana con los anticuerpos primarios apropiados de interés durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave.

Después de la incubación durante la noche a cuatro grados centígrados con agitación suave, lavar la membrana tres veces con 0,2% PBS Tween 20 como se acaba de demostrar e incubar la membrana con los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante apropiados durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Después de tres lavados de PBS, incube la membrana con un kit de solución quimioluminiscente mejorada. A continuación, obtenga una imagen de la película resultante con un sistema de escaneo adecuado y cuantifique los resultados con un programa de análisis de imágenes adecuado.

La irradiación de hasta 10 grays no altera la actividad metabólica de las células Caco-2 a las 24 o 48 horas después de la irradiación, aunque la viabilidad celular disminuye con el tiempo a ambas dosis. La evaluación de TEER de células Caco-2 no cocultivadas después de la exposición a dos grises de irradiación revela valores consistentes de TEER hasta 48 horas después de la irradiación. Sin embargo, después de 10 grays de irradiación, las células muestran una disminución prolongada de TEER a partir de las tres horas posteriores a la irradiación.

El cocultivo con PBMC da como resultado una reducción de TEER que es evidente desde tres horas después de la irradiación con ambas dosis hasta 30 horas después de la irradiación, momento en el que los valores de TEER parecen permanecer relativamente constantes. El análisis de Western blot de proteínas de unión estrecha no revela diferencias en la expresión de Claudin-1 u Occludin en respuesta a la irradiación y/o al cocultivo de PBMC, mientras que se observan grandes fluctuaciones en varias proteínas de andamio. Además, la proteína total NF-kappa B no se ve afectada con ninguna de las dosis de irradiación, mientras que los niveles de proteína XIAP se regulan cuatro veces con ambas dosis.

Con este procedimiento se pueden añadir otros estímulos biológicos como las enterobacterias para responder a preguntas adicionales sobre cómo diferentes estímulos biológicos pueden modificar la respuesta de la monocapa buena a la exposición a la radiación ionizante. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir el impacto de la radiación ionizante y las células inmunitarias en la permeabilidad de las células Caco-2 y la expresión del complejo de unión estrecha.