Name: La leche materna mejora el crecimiento de Enteroids: un modelo Ex Vivo de la proliferación celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprende a cultivar enteroides intestinales para estudiar los efectos de la leche materna en la proliferación celular in vitro. Este modelo ex vivo utiliza intestino de ratón neonatal y permite investigar enfermedades gastrointestinales como la enterocolitis necrosante.

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MG es apoyado por becas K08DK101608 y R03DK111473 de los institutos nacionales de salud, marzo de Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-79, los niños Discovery Institute de Washington University de St. Louis los niños Hospital y el Departamento de Pediatría de la Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL es apoyado por R01DK104946 (PI: Silverman), Hospital descubrimiento Institute de Washington University infantil de St. Louis los niños.

Todos los procedimientos animales en este estudio fueron aprobados por la Universidad de Washington en St. Louis institucional Animal cuidado uso Comité (protocolo 20160187) o atención Animal institucional de la Universidad de Pittsburgh y uso Comité (protocolo 14103918). Intestino fetal humano en menos de 24 semanas de gestación se obtuvo siguiendo las directrices de contratación de Universidad de Pittsburgh anatómica del tejido después de la aprobación de la Junta de revisión institucional (protocolo PRO14100537) de la Universidad de Pittsburgh salud Ciencias Banco de tejidos a través de un sistema de intermediario honesto. Anónima la leche materna o leche materna de donantes pasteurizada se obtuvo con una dispensa del consentimiento de la Universidad de Pittsburgh Junta de revisión institucional.
1. cripta aislamiento y establecimiento de Enteroids de ratones neonatales o intestino humano prematuro
<ol><li>Preparación de medios de comunicación Nota: Los medios de comunicación deben estar preparados en la campana el día antes de aislamiento de la cripta.<ol>
<li>Preparar medios de cultivo L 1,11. Comenzar con 1 L de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L glucosa y L-glutamina y añadir suero bovino Fetal (FBS) (concentración final 10%), 11 mL insulina estéril penicilina-estreptomicina (concentración final 1%) y 1,1 mL (final de 110 mL concentración 0,1%).</li>
		<li>Preparar 500 mL de PBS-antibiótico una mezcla. Comenzar con 500 mL 1 x solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) con 10% FBS y añadir 5 mL de gentamicina (concentración final 1%), 1 mL (concentración final 0,2%), la anfotericina B y 5 mL de penicilina-estreptomicina (concentración final 1%).</li>
		<li>Prepare 30 mL Media de interrupción celular #1. Primero prepare 30 mL de medio de cultivo. Añadir 600 μl 0.5 M dihidratada del ácido (EDTA) (concentración final 10 mM), 300 μL (concentración final 1%) de gentamicina y 60 μL de anfotericina B (concentración final 0,2%).</li>
		<li>Prepare 30 mL Media de interrupción celular #2. Primero prepare 30 mL de medio de cultivo. Añadir 300 μL 0.5m EDTA (concentración final 5 mM), 300 μL (concentración final 1%) de gentamicina y 60 μL de anfotericina B (concentración final 0,2%).</li>
		<li>Preparar medios de cultivo 50 mL cripta sin factores de crecimiento. Medir 33,4 mL 1 x avanzado DMEM/F-12 y añadir 10 mL de SFB (concentración final 20%).<ol>
<li>Añadir 500 μl penicilina-estreptomicina (concentración final 1%), 500 μl (concentración final 1%), de L-glutamina 500 μl gentamicina (concentración final 1%), 100 μl (concentración final 0,2%), la anfotericina B 2,5 μL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane ácido sulfónico (HEPES) (concentración final 0,05 mM), 500 μl 100 mM N-acetilcisteína (concentración final 1 mM), 500 μl 100 x N-2 suplemento 1 mL 50 x suplemento libre de suero (por ejemplo, B-27) menos vitamina A y 500 μL 1 mM 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparar medios de cultivo 1 mL cripta con factores de crecimiento. En primer lugar preparar 1 mL de la cripta los medios de cultivo sin la factores de crecimiento. Añadir 2,5 μl 40 μg/mL Wnt3a (concentración final 100 ng/mL), 1 μl 100 μg/mL Noggin (concentración final 100 ng/mL), 2 μl 250 μg/mL R-Spondin (concentración final de 500 ng/mL) y 0,5 μl 100 μg/mL EGF (concentración final 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de la cripta
	<ol>
<li>Lugar solubilizado Extracto de membrana del sótano (véase Tabla de materiales) en el hielo se descongele antes de empezar. Nota: Mantenga la membrana del sótano en hielo o se polimerice.</li>
		<li>En cumplimiento del protocolo institucional cuidado Animal y el Comité de uso de ratones más de 14 días de edad, eutanasia ratones con dos métodos de eutanasia con el segundo siendo un procedimiento físico para asegurar la muerte. Nota: Para los ratones menos de 14 días de edad, degollación es el procedimiento estándar con unas tijeras.</li>
		<li>Usando tijeras y pinzas, haga una incisión vertical hacia abajo de la línea media del abdomen, a través de la piel y el peritoneo, para toda la longitud del abdomen. Suprimir el intestino desde el estómago al intestino ciego con tijeras y retire el mesenterio con fórceps. Nota: Dos semanas de edad machos y hembras C57BL/6J ratón cachorros, cada pesaje g 5.5-7, fueron utilizados para el aislamiento de la cripta. Cualquier edad o tamaño del ratón puede utilizarse para el aislamiento de la cripta.</li>
		<li>Para preparar el intestino recién cosechado para el aislamiento de la cripta, posición del intestino recto y corte el intestino longitudinalmente a lo largo de toda su longitud con unas tijeras. Nota: Ratón y el intestino humano pueden ser preparados del mismo modo.</li>
		<li>Limpiar heces de intestino agitando suavemente el intestino ida y vuelta en un plato de Petri llenas de mezcla de PBS-antibiótico con unas pinzas.</li>
		<li>Añadir 30 mL de células interrupción medios #1 en un tubo cónico de 50 mL. Corte el intestino en trozos de longitud 0.5 cm directamente en el tubo. Fijar el tubo en un cubo de hielo y agitar suavemente el vibrador a velocidad más baja durante 15 minutos.</li>
		<li>Mientras que los tejidos se encuentran en la coctelera, obtener placas de 24 o 48 bien para crecer criptas si las enteroids se van a utilizar para el aislamiento de proteínas, RNA y DNA. Uso cámara de pozo 8 diapositivas creciendo criptas si los enteroids se van a utilizar para todo Monte proyección de imagen confocal.</li>
		<li>En la campana, añadir 15 μl de la membrana basal a la parte inferior de cada pocillo de la placa de la pozo 24 o 48. Si utiliza diapositivas cámara, añadir 9 μl de membrana del sótano en la parte inferior de cada cámara. Nota: Ajustar el volumen de la membrana basal según el tamaño de la placa si es necesario.</li>
		<li>Se extendió rápidamente la membrana del sótano con la punta de la pipeta para que la membrana del sótano forma una capa delgada en la parte inferior del pozo. Coloque la placa a 37 ° C en incubadora durante 30 min permitir que la membrana del sótano polimerizar. Nota: Las criptas no se fije si la membrana del sótano no es una fina capa o membrana basal contiene burbujas de aire.</li>
		<li>Después de 15 min en un agitador, el tejido del filtro a través de un tamiz de 100 μm. Deseche el flujo a través.</li>
		<li>Añadir 30 mL celular alteración Media #2 a un nuevo tubo cónico de 50 mL. Quitar tejido de filtro y agregar al tubo.</li>
		<li>Fijar el tubo en un cubo de hielo y agitar suavemente el vibrador a velocidad más baja durante 15 minutos.</li>
		<li>Después de 15 minutos en el agitador, filtro de tejido a través de un tamiz de 100 μm. Mantener el flujo a través de en este paso, en el caso de rendimiento es bajo en pasos posteriores. Nota: Todo flujo a través de los tubos deberá ser mantenida en hielo.</li>
		<li>Añadir 15 mL DMEM con 4,5 g/L glucosa y L-glutamina a un nuevo tubo cónico de 50 mL. Quitar tejido de filtro y agregar al tubo. Vigorosamente agite el tubo con la mano por 10 filtro s. a través de un tamiz de 100 μm y recoger el flujo a través. Repita hasta que el flujo a través de contiene no partículas.</li>
		<li>En la campana, filtrar el flujo a través del paso anterior en un nuevo tubo cónico de 50 mL con 70 μm tamices de tejido de ratón o 100 μm tamices de tejido humano. Nota: Tienen filtros adicionales en modo de espera y Vierta lentamente como filtros estorbarán con escombros.</li>
		<li>Centrifugar el tubo a 200 x g por 8 min a 4 ° C y lugar directamente en un cubo de hielo en la campana. Quite el sobrenadante con una pipeta sin perturbar el pellet. Resuspender el precipitado con la cantidad total de la cripta los medios de cultivo sin la factores de crecimiento. Nota: Las criptas enriquecidas son la capa de 'arena' de la pelotilla. Bien, cada uno requiere 250 μl del medio de cultivo sin factores crecimiento de cripta.</li>
	</ol></li>
	<li>Establecimiento de enteroids
	<ol>
<li>Placa de la mezcla de medios de comunicación de cripta directamente sobre la membrana basal.</li>
		<li>Compruebe las criptas con un microscopio para garantizar proceso de aislamiento fue exitoso. Nota: Las células y bolas de células deseadas. Aproximadamente 100 criptas individuales se platean por pozo.</li>
		<li>Incubar la placa a 37 ° C durante 3 horas permitir que las criptas que se adhieren a la membrana del sótano. Nota: La incubación es con la cripta medios de cultivo sin la factores de crecimiento.</li>
		<li>Lentamente retire los medios de comunicación y criptas exceso que no se pudieron adjuntar utilizando una pipeta P-200. Nota: No molestes a la membrana basal como las criptas adjuntadas pueden desplazarse.</li>
		<li>Lentamente Añadir 250 μl de cripta medios de cultivo con factores del crecimiento a cada pocillo. Nota: Para 24, placas de 48 pocillos o cámara se desliza, 250 μl del medio de cultivo con factores crecimiento de cripta es suficiente.</li>
		<li>Sustituir los medios de comunicación cada 2 días con nueva cripta medios de cultivo con factores de crecimiento para 5 días antes de los tratamientos para permitir el crecimiento y fijación óptima.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ratón recolección de leche materna
<ol><li>Separar una presa lactante C57BL/6J en 7-12 días después del parto de sus cachorros durante 6 h antes de la ordeña.</li>
	<li>Anestesiar la presa lactante con isoflurano a través de un cono de nariz y administrar una inyección subcutánea de la oxitocina en 0,15 UI/kg de peso corporal. Espere 3 minutos antes de intentar el procedimiento de ordeño.</li>
	<li>Limpiar los pezones con etanol al 70% antes del procedimiento de ordeño y dejar secar.</li>
	<li>Extraer leche de las tetas una a la vez utilizando un extractor humano eléctrico con tubo de silicona de tamaño para adaptarse a las tetas de ratón en un tubo de colección de 5 mL. Nota: Extractores de leche óptima tienen dos ajustes, uno para la velocidad y succión. Es mejor comenzar con la configuración más baja de cada uno y ambos aumente lentamente hasta que se extrae la leche. Idealmente, el rendimiento total será ~ 500 μL - 1 mL de leche de ratón por presa de lactante.</li>
	<li>Leche materna inmediatamente alícuotas y conservar a-80 ° C. Nota: Evite congelar/descongelar ciclos.</li>
	<li>Tratar de enteroids el día 5 con 50 μl/mL de leche de ratón por mL de medio de cultivo con factores de crecimiento de la cripta durante 24 h a 37 ° C.</li>
</ol>3. todo montaje coloración de Enteroids
<ol><li>
Preparación de los reactivos
	<ol>
<li>Preparación de 16 mL 1 x PBS por 8 pozos.</li>
		<li>Preparación de paraformaldehído al de 4% de 2 mL (PFA) de 1 x PBS por 8 pozos.</li>
		<li>Preparar 2 mL 0,1% Tritón X-100 en PBS 1 x por 8 pozos.</li>
		<li>Preparar 24 mL PBS Tween (SAFT es 0,1% Tween 20 en 1 x PBS) por 8 pozos.</li>
		<li>Preparar 2 mL 10% burro normal de suero (NDS) en 0.1% SAFT (10% NDS/SAFT) por 8 pozos.</li>
		<li>Preparar 4 mL 1% NDS en 0.1% SAFT (1% NDS/SAFT) por 8 pozos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Día 1 la coloración
	<ol>
<li>Aspire de tratamientos y lave enteroids con PBS. Añadir 250 μl 4% PFA por pozo. Coloque en el rotador para 1-2 h a 4 ° C. Quitar 4% PFA con pipeta.</li>
		<li>Lavar 4 veces con 250 μL/pocillo 1 x PBS. Coloque en el rotador durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Nota: Es posible almacenar la placa durante 1-2 días a 4 ° C si es necesario.</li>
		<li>Añadir 250 μL/pocillo 0,1% Tritón X-100. Incubar durante 1 h a RT. retirar 0,1% Tritón X-100 con pipeta.</li>
		<li>Lavar 4 veces con 250 μL/pocillo 1 x PBS. Colocar en el rotor durante 15 min a TA.</li>
		<li>Añadir 250 μL/pocillo 10% NDS/SAFT. Incubar durante 45 minutos en quitar RT. 10% NDS/SAFT con pipeta.</li>
		<li>Añadir 250 μL/pocillo primaria del anticuerpo, diluido 1/250 en 1% NDS/SAFT e incubar toda la noche a 4 ° C. Nota: La dilución óptima del anticuerpo varía según el fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Día 2 la coloración
	<ol>
<li>Lavado al menos 5 veces 4-5 h con 250 μL/pocillo de SAFT. Coloque en el rotador a 4 º C entre cada lavado.</li>
		<li>Añadir 250 μl/pozo secundario anticuerpo, diluido 1/1.000 en 1% NDS/SAFT. Envolver la placa en hoja e incubar durante una noche a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Día 3 la coloración
	<ol>
<li>Añadir 250 μL/pocillo nuclear mancha 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) durante 15 minutos. Nota: Mantenga la placa en la oscuridad.</li>
		<li>Lavar 6 veces con 250 μL/pocillo de SAFT. Coloque en el rotador durante 10 min a 4 º C entre cada lavado.</li>
		<li>Cubreobjetos de montaje en cámara Deslice con el montaje de los medios de comunicación.</li>
		<li>Tomar imágenes con una de 40 X microscopio confocal objetiva y hacer igualmente en un editor de gráficos de trama (véase Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Drummond, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroviruses+infect+human+enteroids+and+induce+antiviral+signaling+in+a+cell+lineage-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada para revelar y sin conflictos de interés.

El epitelio intestinal se compone de muchos subtipos celulares que son responsables de proporcionar la defensa del huésped frente a patógenos, mantener la integridad de la barrera del intestino y pueden ser violados en la patogenia de varias enfermedades. Mientras que los modelos animales pueden recapitular algunas facetas de la enfermedad, el modelo ex vivo de enteroids derivadas del intestino de los ratones y los seres humanos proporciona una plataforma para probar efectos de varios tratamientos. La importanci...

La enterocolitis necrotizante (NEC) es la principal causa de muerte por enfermedades gastrointestinales en los niños prematuros, que afecta a casi 1 en 10 bebés nacidos antes de las 29 semanas de gestación1,2,3. La mitad de los niños con el progreso de NEC para la forma más severa, donde la supervivencia es sólo 10-30%4,5. En los Estados Unidos, un estimado 2 billones USD al año se gastan tratando a niños con NEC6,7, sin embargo, la tasa de supervivencia ni terapia ha cambiado en los últimos 30 años. La patogenia de la NEC se caracteriza por lesiones intestinales y alteración mucosa curación8,9,10,11, sin embargo, las vías de señalización que conduce a una exacerbación respuesta inflamatoria y los mecanismos para revertir la inflamación permanecen incompleto entendidos.
La administración de leche humana se ha encontrado que la estrategia solamente protección contra NEC para recién nacidos prematuros. Previamente hemos demostrado que la leche materna protege contra el desarrollo de NEC mediante la inhibición de lo receptores inmunes innatas peaje-como el receptor 4 (TLR4) en el epitelio intestinal vía receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE) señalización vía11. La suplementación de la leche materna a un fórmula experimental de NEC atenúa la respuesta inflamatoria en NEC según lo demostrado por inhibición de la apoptosis del enterocyte y restauración de la proliferación del enterocyte en una manera que depende de crecimiento epidérmico factor (EGF) y EGFR11. En otro estudio, se demostró que el nitrato, otro componente de la leche materna, contribuye a su naturaleza protectora modulando la perfusión intestinal, en comparación con fórmula infantil, que carece de nitrato y puede contribuir a la mayor frecuencia de NEC en fórmula alimentó a niños de12,13. Otros compuestos presentes en la leche materna que han demostrado para estar implicado en la protección contra el NEC son oligosacáridos de leche humana, L-arginina, glutamina y lactoferrina14,15,16, 1718,de,19. Estos elementos beneficiosos de la leche materna revelan la necesidad de su uso en la prevención de ECN, pero también subrayan la importancia de estudiar los mecanismos de señalización de vías y efectos celulares implicados en cómo la leche materna es mediar la protección contra el NEC .
En orden para otro estudio las propiedades protectoras de la leche materna en un modelo murino de NEC, hemos desarrollado una técnica novedosa, fácil de usar por que ratón puede extraerse leche materna de una presa anestesia mediante un pecho humano eléctrico bomba11,12 . Esta estrategia de adquirir leche de ratón es ventajosa, no sólo porque los extractores de leche humana son fácilmente disponibles y eficaces en la adquisición de la leche materna, sino también porque este método permite el análisis de leche de mama específicos. Como resultado, pueden comparar los efectos de la leche materna de ratón con los de la leche materna humana expresada como pasteurizada leche humana de donante de un banco de leche en modelos específicos. Esta técnica permite el estudio de los componentes de la leche materna en relación con su contribución a la prevención de NEC. Otros investigadores han desarrollado métodos de extracción de leche materna, sin embargo, estas técnicas son manuales y requieren típicamente más de un laboratorio miembro20,21,22. Aquí se presenta una técnica fácil que puede ser utilizada mediante la modificación de un extractor de leche eléctrico humano para recoger la leche de un ratón. Esta técnica puede aplicarse también a otras especies.
Para interrogar adecuadamente las vías de señalización involucradas con NEC, modelo de los sistemas es necesarios para evaluar todos los tipos de células diferentes a ser afectados en el proceso de la enfermedad. Aquí, discutimos una tal sistema modelo - enteroids - y su establecimiento del intestino humano y ratón. Enteroids intestinales humanos (HIEs) proporcionan en particular promesa significativa, ya que ofrecen un modelo humano innovador, genéticamente diversas ex vivo para ayudar en el estudio de procesos fisiopatológicos que ocurren en el tracto gastrointestinal 23. Enteroids se han encontrado para ser cultivadas a largo plazo y puede ser congelados para su posterior uso23, y a diferencia de los organoides Intestinal humano (HIOs), cuyos cultivos se desarrollan de células madre pluripotentes inducible, enteroids son generados a partir de células madre dentro de las criptas intestinales aislados24. Enteroids requieren menos mantenimiento, puede ser infectado rápidamente25y fácilmente se puede establecer desde las criptas intestinales se diferencian más que HIOs23. Por lo tanto, HIEs ofrecen muchas ventajas sobre las técnicas existentes porque puede ser desarrollados para cada región propiedades compositivas y funcionales del epitelio gastrointestinal humano23. El uso de enteroids es una opción altamente efectiva cuando se necesita un modelo humano del intestino, con apego a las limitaciones de cada región y facilidad de uso. Aquí se demuestra la técnica de aislamiento y mantenimiento de enteroids intestinal pequeño derivado de la célula de vástago primario de ratones y humanos prematuros.

<table><tbody><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L de glucosa y L-glutamina</td><td>Suero</td> fetal bovino Lonza <td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>(FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulina N (insulina)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco ( DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano ácido sulfónico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Suplemento Menos Vitamina A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x Inhibidor de ROCK Y-27632, Dihidrocloruro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Recombinante Wnt3a Proteína</td><td>R& D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Ratón recombinante R-Spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico murino recombinante (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Factor de crecimiento Matriz de membrana basal reducida Corning</td><td></td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Placa de Petri de cultivo celular</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>célula de 48 pocillos placa de cultivo</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8 pocillos Nunc Lab-Tek II Sistema de portaobjetos de cámara</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo cónico</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; M Filtro de células estériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M Colador de células estériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehído (PFA)</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Burro normal Suero (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Cubierta de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G Aguja de 1,5 pulgadas</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Oxitocina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de leche eléctrico doble humano</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubo de ensayo de fondo redondo</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de goma Frey</td><td>Scientific 560761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ki67 Anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>humano Mki67 cebador F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Tecnologías</td> <td>de ADN integradas</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

la leche materna mejora el crecimiento de enteroids: un modelo ex vivo de la proliferación celular

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Enteroids intestinales pequeño humanos se derivan de las criptas y cuando se cultiva en un nicho de células madre contienen todos los tipos de células epiteliales. La habilidad de establecer enteroide humanas ex vivo sistemas de cultivo son importantes Fisiopatología intestinal modelo y estudiar las respuestas celulares particulares involucrados. En los últimos años, enteroids de ratones y humanos son se cultiva, los e inclinada lejos para usarlos en varios laboratorios en todo el mundo. Esta plataforma enteroide puede utilizarse para probar los efectos de diversos tratamientos y medicamentos y qué efectos se ejercen sobre los diferentes tipos de células en el intestino. Aquí, un protocolo para el establecimiento de primaria enteroids intestinal pequeño derivados de células madre derivadas de ratones neonatales y proviene de intestino humano prematuro. Por otra parte, este sistema de cultivo enteroide fue utilizado para probar los efectos de la leche materna específica. Leche de ratón puede obtenerse eficientemente usando un extractor de leche humana modificada y leche de ratón expresa entonces puede ser utilizada para experimentos de investigación adicionales. Ahora nos demuestran los efectos de ratón expresado, humano, y leche materna de donante en el crecimiento y la proliferación de las enteroids derivadas de ratones neonatales o intestino humano prematuro.

Primero intentamos investigar ya sea leche materna o leche materna de donantes pasteurizada tuvo un efecto en pequeños enteroids intestinal. De hecho, la leche materna y leche materna de donante aumentan el crecimiento de ratón neonatal (figura 1A) y enteroids derivados humanos prematuros (figura 1B).
Puesto que la leche materna humana aumentó el crecimiento de pequeños...

Este protocolo describe cómo establecer un sistema de cultivo enteroide de ratón neonatal o precoz del intestino humano así como un método eficiente para recoger la leche de ratones.

La leche materna mejora el crecimiento de Enteroids: un modelo Ex Vivo de la proliferación celular

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar intestinos en miniatura, llamados enteroides, en el laboratorio. Los enteroides se tratan con leche materna de ratón extraída en el laboratorio para dilucidar los efectos de la leche materna sobre la proliferación in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con diversas enfermedades gastrointestinales, como la enterocolitis necrotizante, que afecta a los bebés prematuros.La principal ventaja de esta técnica es que los enteroides requieren poco mantenimiento, se pueden establecer rápidamente y exhiben muchas de las propiedades funcionales del epitelio gastrointestinal. Esta técnica de establecimiento de enteroides es un modelo altamente efectivo del intestino delgado humano. Aunque este método puede proporcionar información sobre el intestino delgado, también se puede aplicar a otros sistemas de órganos en otras regiones del tracto gastrointestinal.Para empezar, descongele el extracto de membrana basal solubilizado en hielo. Luego, use tijeras y fórceps para hacer una incisión vertical a lo largo de toda la línea media abdominal de un ratón sacrificado. Con fórceps, extirpe el intestino delgado y extraiga el mesenterio.Para preparar el intestino delgado para el aislamiento de la cripta y la creación de enteroides, coloque el intestino recto y use tijeras para cortar longitudinalmente a lo largo de toda su longitud. Retire las heces agitando suavemente el intestino con pinzas en una placa de Petri llena de una mezcla de antibióticos PBS. Luego, agregue 30 mililitros de medio de disrupción celular número uno a un tubo cónico de 50 mililitros.Coloque segmentos de medio centímetro de intestino en el tubo y coloque el tubo en una cubeta de hielo en una coctelera. En una campana, agregue 9 microlitros de membrana basal al fondo de cada pozo en un portaobjetos de ocho pocillos. Extienda rápidamente la membrana con una punta de pipeta y permita que la membrana basal se polimerice en una incubadora.Es importante extender rápidamente la membrana basal para que forme una capa delgada en el fondo del pozo. Las criptas no se adherirán si hay burbujas de aire o si la membrana basal es demasiado gruesa. Después de agitar el tubo cónico, use un colador de 100 micrómetros para filtrar el tejido de la membrana y deseche el flujo.Agregue 30 mililitros de medio de disrupción celular número dos a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y luego agregue el tejido intestinal al tubo. Después de agitar el tubo durante 15 minutos, filtre el tejido a través de un colador de 100 micrómetros. Mantenga el flujo a través de este paso.Añadir 15 mililitros de TMEM con 4,5 gramos por litro de glucosa y L-glutamina a un nuevo tubo cónico. Retire el tejido del colador de 100 micrómetros y agréguelo al nuevo tubo cónico. Luego, agite manualmente el tubo durante 10 segundos y filtre a través de un colador de 100 micrómetros.En la campana, use un colador de 70 micrómetros para filtrar el tejido en un nuevo tubo cónico. Después de centrifugar el tubo durante 8 minutos, colóquelo en una cubitera en la campana. Utilice una pipeta para eliminar con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet formado.Vuelva a suspender el pellet con una cantidad adecuada de medios de cultivo criptográfico sin factores de crecimiento. Después de incubar el portaobjetos de la cámara durante 30 minutos, coloque la mezcla de medio de cripta directamente sobre la membrana basal e incube a 37 grados centígrados durante 3 horas mientras las criptas se adhieren. Después del período de incubación, utilice una pipeta P200 para retirar con cuidado los medios y las criptas no adheridas.Otro paso crítico es asegurarse de eliminar lentamente los medios y el exceso de criptas que no se pudieron adherir con una pipeta P200. No moleste la membrana basal, ya que las criptas adheridas pueden desprenderse. Agregue lentamente 250 microlitros de medio de cultivo criptográfico con factores de crecimiento a cada pocillo.Anestesiar una madre lactante con isoflurano administrado a través del cono nasal y administrar la dosis adecuada de oxitocina subcutánea. Limpie los pezones con etanol al 70% y déjelos secar antes de iniciar el procedimiento de ordeño. Usando un extractor de leche humano eléctrico equipado con un tubo de silicona del tamaño adecuado para ratones y un tubo de 5 mililitros, extraiga la leche de los pezones uno a la vez.Finalmente, alícuota la leche inmediatamente y almacene a menos 80 grados centígrados. Trate los enteroides en el quinto día con leche materna de ratón almacenada durante 24 horas a 37 grados centígrados. El primer día de tinción, use PBS para eliminar los tratamientos experimentales y lave los enteroides.Agregue 250 microlitros de PFA al 4% a cada pocillo y coloque el portaobjetos en un rotor durante 1 a 2 horas a 4 grados centígrados. Use una pipeta para eliminar el PFA y luego lave suavemente cada pocillo cuatro veces con 250 microlitros de PBS. Coloque el portaobjetos de la cámara en un rotador durante 10 minutos a temperatura ambiente.Añadir 250 microlitros de Triton X-100 al 0,1% a cada pocillo e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el Triton X-100 con una pipeta y lave cuatro veces con 250 microlitros de PBS en cada pocillo. Coloque el portaobjetos en un rotador durante 15 minutos a temperatura ambiente.Agregue 250 microlitros de 10%NDS/PBST a cada pocillo e incube durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el NDS/PBST con una pipeta. Por último, añadir 250 microlitros de anticuerpo primario diluido a cada pocillo e incubar durante la noche a 4 grados centígrados.En el segundo día de tinción, lave cada pocillo al menos cinco veces con 250 microlitros de PBST y coloque el portaobjetos en un rotador a 4 grados centígrados entre cada lavado. Agregue 250 microlitros de anticuerpo secundario diluido en 1%NDS/PBST a cada pocillo. Envuelva el portaobjetos en papel de aluminio e incube durante la noche a 4 grados centígrados.El último día de tinción, agregue 250 microlitros de DAPI teñido nuclear a cada pocillo y déjelo reposar durante 15 minutos. Luego, lave cada pocillo seis veces con 250 microlitros de PBST. Coloque el portaobjetos en un rotador durante 10 minutos a 4 grados centígrados entre cada lavado.Finalmente, prepare el portaobjetos para la obtención de imágenes microscópicas montando un cubreobjetos en el portaobjetos de la cámara con medios de montaje y dejándolo secar durante 24 horas. En este estudio, los enteroides del intestino delgado derivados de ratones neonatos se trataron con leche materna recolectada de ratones lactantes. Como se muestra en esta figura, la leche materna de ratón aumentó la proliferación en los enteroides de ratón.Para investigar los efectos específicos de la leche materna, la leche materna humana y la leche materna pasteurizada de donante también se aplicaron a los enteroides de ratón. Como se muestra en esta figura, la leche materna humana y la leche materna pasteurizada de donante aumentaron la proliferación de enteroides de ratón. Al intentar este procedimiento, es importante mantener las criptas en hielo durante los pasos de aislamiento.Realice lenta y suavemente todos los métodos después de que los enteroides estén en cultivo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como tratamientos con células inmunitarias, microbiota o diversos fármacos, con el fin de responder a preguntas adicionales para recapitular mejor el microambiente del intestino. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cultivar, tratar y realizar la inmunofluorescencia en los enteroides.Además, debería poder extraer eficazmente la leche materna de un ratón lactante. No olvide que trabajar con tejidos y fluidos corporales humanos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se debe usar equipo de protección personal mientras se realizan estos procedimientos.

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Describimos un método para establecer enteroides humanos a partir de criptas del intestino delgado y colonoides a partir de criptas de colon recogidas tanto de tejido quirúrgico como de biopsias. En este artículo metodológico, presentamos las modalidades de cultivo que son esenciales para el crecimiento y mantenimiento exitoso de enteroides y colonoides humanos.

Establecimiento de Human epitelial Enteroids y Colonoids de Whole Tejidos y Biopsia

Enteroids se perfila como un modelo novedoso en el estudio de las enfermedades humanas. El protocolo describe cómo simular un modelo enteroide de enterocolitis necrosante humana tratamiento de lipopolisacárido (LPS) de enteroids generados a partir de tejido neonatal. Enteroids recogidos demuestran cambios inflamatorios similares a los observados en humana enterocolitis necrotizante.

Un modelo de enteroide epitelial humano novedoso de Enterocolitis necrosante

Los organoides desarrollados a partir de glándulas mamarias de ratones fueron irradiados y caracterizados para evaluar rasgos epiteliales e interacciones con las células inmunitarias. Los organoides irradiados se pueden utilizar para evaluar mejor las interacciones de células celulares que pueden conducir al reclutamiento de células tumorales en tejido normal irradiado.

Crecimiento y caracterización de organoides irradiados de glándulas mamarias

El protocolo presentado utiliza citometría de flujo para cuantificar el número de células muertas y proliferantes en enteroides de ratón cultivados. Este método es útil para evaluar los efectos del tratamiento farmacológico en la proliferación y supervivencia de los organoides.

Cuantificación de células proliferativas y muertas en enteroides

La glándula mamaria es una estructura bicapa, que comprende células epiteliales mioepiteliales externas e internas. Presentado es un protocolo para preparar organoides utilizando la trippsinización diferencial. Este método eficiente permite a los investigadores manipular por separado estos dos tipos de células para explorar preguntas sobre sus funciones en la forma y función de la glándula mamaria.

Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

Este protocolo proporciona herramientas experimentales in vitro para evaluar la transformación de las células mamarias humanas. Se describen los pasos detallados para el seguimiento de la tasa de proliferación celular, la capacidad de crecimiento independiente del anclaje y la distribución de linajes celulares en cultivos 3D con matriz de membrana de sótano.

Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas

La diafonía entre las células epiteliales mamarias y las células endoteliales contribuye de manera importante a la progresión del cáncer de mama, el crecimiento tumoral y la metástasis. En este estudio, los esferoides se han hecho de células de cáncer de mama junto con células endoteliales vasculares y / o linfáticas y demuestran su aplicabilidad como un sistema in vitro para la investigación del cáncer de mama.

Esferoides epiteliales y endoteliales mamarios como un modelo funcional potencial in vitro para la investigación del cáncer de mama

Este protocolo describe un modelo apical-out necrotizante enterocolitis (ECN) en un plato que utiliza enteroides del intestino delgado con polaridad invertida, lo que permite el acceso a la superficie apical. Proporcionamos un protocolo de tinción inmunofluorescente para detectar la disrupción epitelial relacionada con NEC y un método para determinar la viabilidad de enteroides apicales sometidos al protocolo NEC en un plato.

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

Este protocolo detalla el establecimiento de enteroides, un modelo intestinal tridimensional, a partir del tejido intestinal fetal. Se utilizaron imágenes inmunofluorescentes de biomarcadores epiteliales para la caracterización del modelo. La exposición apical de lipopolisacáridos, una endotoxina bacteriana, mediante la técnica de microinyección indujo la permeabilidad epitelial de una manera dependiente de la dosis medida por la fuga de dextrano fluorescente.

Prueba de permeabilidad epitelial en enteroides derivados de tejido fetal

Los enteroides están emergiendo como un modelo novedoso para estudiar la fisiología y la fisiopatología de los tejidos, el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Aquí, describimos un sistema de cultivo derivado de enteroides 2D de células primarias bovinas que permite el cocultivo con tipos de células de tejido relevantes. Este modelo ofrece una ventaja traslacional para el modelado de la investigación gastrointestinal.

Generación de un sistema de cultivo monocapa bidimensional derivado de enteroide primario bovino para aplicaciones en investigación biomédica traslacional

El presente estudio informa de un protocolo más fácil, económico y que ahorra tiempo para aislar y cultivar de manera eficiente células epiteliales mamarias humanas primarias (HMEC) a partir de pequeñas cantidades de tejido mamario. Este protocolo es adecuado para producir rápidamente HMEC primarios tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas.

Aislamiento y cultivo de células epiteliales mamarias humanas primarias

Aprende a cultivar enteroides intestinales para estudiar los efectos de la leche materna en la proliferación celular in vitro. Este modelo ex vivo utiliza intestino de ratón neonatal y permite investigar enfermedades gastrointestinales como la enterocolitis necrosante.

La leche materna mejora el crecimiento de Enteroids: un modelo Ex Vivo de la proliferación celular

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