Name: Ligadura del conducto biliar parcial en el ratón: un modelo controlado de la colestasis obstructiva localizada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: Aprende la ligadura parcial del conducto biliar en ratones C57BL/6 para estudiar colestasis obstructiva localizada y regeneración hepática. Este modelo permite comparar lóbulos ligados y no ligados en el mismo animal.

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El Dr. Khan reconoce apoyo de subvenciones de NIH/NICHD K12HD052892, la Fundación alfa-1, la Fundación Hillman y el centro de investigación de hígado Pittsburgh. Dr. Michalopoulos reconoce apoyo de subvención del NIH/NIDDK P01DK096990. Agradecemos la asistencia técnica excelente y generosa de Anne Orr. Agradecemos también al Dr. David A. Geller para facilitar el acceso al laboratorio de microcirugía de trasplante/roedor.

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con arreglo a las normas éticas del Comité de uso de la Universidad de Pittsburgh y cuidado institucional del Animal.
1. básicas técnicas y procedimientos comunes
<ol><li>Autoclave equipo microcirugía todos antes de usar.</li>
	<li>Para evitar matar el ratón por la anestesia, revise cuidadosamente su patrón de respiración.</li>
	<li>Toque lo menos posible para evitar dañar órganos y causar sangrado de intestinos y órganos. Presione los puntos sangrantes con torundas de algodón húmedas o esponjas de Gasa.</li>
	<li>Utilizar torundas de algodón húmedas para la suave manipulación de los órganos. Esponjas de gasa húmeda, no tejidos se utilizan en dos tamaños, 3.5 × 3.5 cm y 6.0 × 6,0 cm. usar uno más pequeño para retraer el hígado entero. Use la más grande para envolver los intestinos pequeños y grandes.</li>
</ol>2. preparación prequirúrgica
<ol><li>Utilizar ratones c57/b6 machos, 8-12 semanas de edad (cuando el peso corporal es aproximadamente de 20-35 g) para la ligadura del conducto biliar parcial.</li>
	<li>Permitir que los ratones libre acceso a agua y alimentos hasta la inducción de la anestesia.</li>
</ol>3. operación de ligadura de conducto biliar parcial
<ol><li>Anestesiar el ratón colocando el animal en una cámara de inducción con una mezcla de 1.5-2.0% isoflurano y 1 L/min de oxígeno. Controle con cuidado el animal mediante la observación de la tasa de respiración. Cuando la tasa de respiración de los animales es una respiración por segundo, el ratón está bien anestesiado. Ya que reflejo de retirada del miembro delantero desaparece más rápidamente, pellizcar el pie de extremidades así como para confirmar la ausencia total del reflejo de retirada. Ojos deben lubricarse con un agente lubricante oftálmico para evitar úlceras corneales. Nota que la primera dosis de analgésico puede administrarse pre-operatively para prevenir la estimulación de receptores del dolor.</li>
	<li>Afeitarse la pared abdominal con cortar el pelo y coloque el ratón sobre la mesa quirúrgica bajo el microscopio quirúrgico. Fijar las extremidades a la mesa con cinta adhesiva. Utilizar la inhalación isoflurane para mantener el ratón bajo anestesia general.<ol>
<li>Ajustar el vaporizador de isoflurano e isoflurano de 2.0-3.0% para inducción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizando hisopos estériles, desinfectar la pared abdominal primero con 0.3-0.5 mL de povidona-yodo aplicada tópicamente, seguido de etanol al 70%. Animal debe cubrirse con un paño estéril.</li>
	<li>Hacer una incisión abdominal de línea media larga desde el xifoides al pubis con la tijeras y fórceps de Adson. Después de realizar la incisión abdominal, reducir el isoflurano a 0.8-1.0% para el mantenimiento.</li>
	<li>Exponer la cavidad abdominal utilizando un Micro retractor. Sostenga el xifoides con pinzas mosquito y retracción hacia la cabeza del ratón. Fijar las pinzas de mosquito usando arcilla suave.</li>
	<li>Instilar 1-2 mL de precalentado (37 ° C) esterilizada con tampón fosfato salino (PBS) en la cavidad abdominal para evitar lesionar los órganos abdominales. Mantener el intestino con algodón húmedo y suavemente los retraiga hacia la cabeza del ratón. Cortar los ligamentos entre el intestino delgado y el retroperitoneo para evitar lesionar el intestino (figura 1A).</li>
	<li>Envuelva los intestinos delgado y grueso con una esponja de gasa húmeda, no tejida. Colocarlos en la parte caudal de la cavidad abdominal. Intestinos, envueltos en una gasa estéril pueden colocarse en el campo estéril cubierto para evitar la contaminación.</li>
	<li>Suavemente Retire el hígado entero hacia el xifoides usando una esponja pequeña mojada no tejido de gasa para exponer el hilio hepático y ligamento hepato-duodenal (figura 1B).</li>
	<li>Comprobación para confirmar la anatomía del hilio hepático. El conducto biliar común se encuentra en el lado ventral de la vena porta. Confirman lugares de la derecha y el conducto biliar hepático izquierdo, que drenan en la confluencia biliar principal en el hilio hepático.</li>
	<li>Identificar el conducto de bilis hepático izquierdo que drena el lóbulo izquierdo y rodearlo con una sutura de nylon 10-0 usando el lado Romo de una aguja de sutura (figura 2A). Evitar lesionar la superficie hepática, vena porta y arteria hepática.</li>
	<li>Ligar el conducto biliar izquierdo con nylon 10-0. (Figura 2B).</li>
	<li>Coloque los intestinos pequeños y grandes en la misma posición que antes de la operación mediante el uso de torundas de algodón húmedas.</li>
	<li>Confirmar que no existe torsión intestinal y sangrado intrabdominal y cerrar el músculo y la piel en dos capas con vicryl 4-0. Sutura trenzada (Vicryl) fue utilizada para el cierre de la piel, pero monofilamento es preferido para reducir la probabilidad de infección. Nota: Cerrar fascia sutura continua desde el xifoides al pubis y cerrar la piel sutura continua del pubis al xifoides.</li>
	<li>Deje de anestesia después de cerrar la incisión.</li>
</ol>4. postoperatorio tratamiento y seguimiento
<ol><li>Sólo después de la cirugía, pellizcar la piel dorsal del ratón e inyectar Buprenex (0.1 mg/kg) y cefazolina (100 mg/kg) por vía subcutánea, seguido de Buprenex inyección cada 12 h durante 3 días y cefazolina cada 24 h durante 3 días respectivamente11,12 ,13. Nota que la primera dosis de analgésico puede administrarse pre-operatively para prevenir la estimulación de receptores del dolor. Cefazolina y otros antibióticos perioperatorios sólo son necesarios para los animales inmunes suprimidos, como los utilizados en los estudios de trasplante. Nota: Si la cirugía se realiza con éxito, el mouse generalmente se recupera dentro de 30 minutos actividad de los ratones será casi igual que la condición preoperatoria.</li>
	<li>Compruebe los ratones diariamente para detectar cualquier signo de angustia.<ol>
<li>Sacrificar a los ratones por la dislocación cervical bajo anestesia general para procurar hígados y otras muestras de tejidos en puntos de tiempo definido (es decir, 7, 14, 21 días) después de pBDL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen ninguna revelación.

Aunque cBDL es la técnica experimental más común de colestasis obstructiva, puede presentar múltiples desafíos en roedores. Dependiendo del número de días postoperatorios requeridos para alcanzar un punto final, los animales pueden experimentar una morbilidad significativa y mortalidad as time avanza. El grado de lesión tisular y necrosis biliar es exacerbado cuando se trabaja con algunos modelos de ratón transgénico de enfermedad hepática, que demuestran anormal parénquima hepático y la función al inicio del estudio. En...

Los modelos quirúrgicos de reparación, como la hepatectomía parcial o ligadura del conducto biliar común (cBDL) y lesión del higado aguda se han utilizado durante décadas en roedores para estudiar la regeneración del hígado y pathobiology1,2. En cBDL, es ligado el conducto colédoco (que drena toda la bilis producida en el hígado), dando por resultado colestasis obstructiva, la inflamación y la fibrosis en las primeras 2-3 semanas después de la cirugía, con eventual progresión a la cirrosis3. Proliferación de conductos biliares, transdiferenciación e inducción de células progenitoras residentes de hígado son también características de cBDL4,5. Aunque cBDL elucida mecanismos específicos de cholangiopathy obstructiva, que están bien caracterizados con resultados reproducibles en ratones de tipo salvaje y en esas tensiones con hígados normales6,7,8, la procedimiento puede ser técnicamente exigente en algunos modelos de ratón transgénico de enfermedades del hígado, que requieren más animales de lo previsto debido a la mayor morbilidad y mortalidad de la obstrucción biliar en el tiempo. Esta técnica también es beneficiosa para el estudio de la enfermedad de ratones transgénicos con base de hígado, que de lo contrario no podría tolerar el estrés de los experimentos de curso prolongado tras cBDL.
pBDL puede proporcionar una alternativa razonable para ayudar a superar algunos de estos retos. PBDL inicial estudios en ratones de tipo salvaje pretenden distinguir localmente actuando y sistémicos mediadores de la inflamación9. En pBDL, cuidadosamente, la confluencia biliar principal de los conductos biliares hepáticos derecho e izquierdos por encima del conducto biliar común se visualiza en el hilum, y sólo el conducto biliar hepático izquierdo se unen para generar una colestasis obstructiva localizada. pBDL ofrece varias ventajas a cBDL. En pBDL, el lóbulo derecho unligated sirve como un control interno idénticamente coincidente para el lóbulo izquierdo ligado, sometido a los mismos efectos sistémicos, tales como estado nutricional o factores de circulación. Aunque estaban presentes mediadores pro-inflamatorios sistémicos, Osawa et al. había observado menos fibrosis y necrosis en los lóbulos unligated, pero aumento de células inflamatorias y expresión de factor de crecimiento β transformador en el lóbulo ligados9.
Más recientemente, se ha redefinido pBDL para estudiar efectos parenquimales hepáticas de bilis retenida10. Utilizando el mismo animal para los grupos experimentales y control interno (unligated "sham"), pBDL mitades con eficacia el número de animales necesarios por experimento, que a su vez es más rentable. Los ratones toleran los efectos de pBDL mucho mejor, para que el momento ideal curso de experimentar (≥2 semanas) pueden lograrse en el lóbulo ligado. Lo más importante, pBDL puede distinguir efectos directos intrahepáticas de colestasis obstructiva y conservan componentes de la bilis en el lóbulo ligado, comparado con el lóbulo de la unligated control. En general, pBDL es un método atractivo para estudiar efectos de lóbulo-específica de la colestasis localizada en el hígado.

<table><tbody><tr><td>Microscopio-Leica Wild M650, 6&ndash; 40 veces; aumento</td><td>Leica Microsystems</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tec 3 vaporizador de llenado de embudo de isoflurano</td> Servicios <td>de anestesia general</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de tenotomía</td><td>Stevens Preciso Quirúrgico & Corporación de Instrumentos Científicos</td><td>ASSI.9193</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Adson</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas hemostáticas delicadas Mosquito classic</td><td>Codman</td><td>30-4472</td><td></td></tr><tr><td>Micro-retractor</td><td>Murdock; Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-6550</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gasa no tejidas</td><td>Fisherband</td><td>870-PC-DBL</td><td></td></tr><tr><td>Puritan 6" Hisopo pequeño de algodón con mango de madera</td><td>Puritan Medical Products Company</td><td>868-WCS Pinzas</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS - Puntas estándar/Recto/Inox/13,5 cm</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11203-23</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont SS - Puntas estándar/Ángulo 45 grados/Inox/13,5 cm</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas - Filo de corte de 3 mm</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para microagujas</td><td>Aesculap Surgical Instruments</td><td>FD231R</td><td></td></tr><tr><td>Micro AROSuture, estéril 10-0 sutura de nylon, 70 &; m, puntos TAP</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>T4A10N07</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J662H</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 5 ml</td><td>BD 309646</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos Falcon, 60 &times; 15 mm</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, Farmacopea de los Estados Unidos (USP) líquido para inhalación, 250 ml</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex inyectable (clorhidrato de buprenorfina)</td><td>Reckitt Benckiser Pharmaceuticals</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolin para inyección, USP</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-238-61</td><td></td></tr><tr><td>PVP solución exfoliante (povidona y ndash; yodo 7.5%)</td><td>Medline</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesio</td><td>LONZA</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Sirius Red</td><td>Sigma</td><td>365548</td><td></td></tr><tr><td>Hematolxilina</td><td>Fisher (Richard-Allan Scientific)</td><td>22-050-111 (7211)</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Anatech (Fisher)</td><td>832 (NC9686037)</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Fisher</td><td>SF100-20</td><td></td></tr></tbody></table>

ligadura del conducto biliar parcial en el ratón: un modelo controlado de la colestasis obstructiva localizada

Partial Bile Duct Ligation in the Mouse: A Controlled Model of Localized Obstructive Cholestasis

En roedores, ligadura del conducto biliar completa (cBDL) del conducto biliar común es una técnica quirúrgica establecida para el estudio de colestasis obstructiva, proliferación de conducto biliar. Sin embargo, experimentos a largo plazo pueden conducir a mayor morbilidad y mortalidad. En cepas de ratón seleccione con enfermedad hepática subyacente, se pueden hacer comparaciones significativas aun con la ligadura de un solo lóbulo del hígado, que puede reducir los gastos y pérdidas de animales. Aquí, describimos la ligadura parcial del conducto biliar (pBDL) en el ratón, en el que sólo el conducto biliar hepático izquierdo está ligado, que causa obstrucción biliar en lóbulo izquierdo pero no los lóbulos restantes. Con Técnica Microquirúrgica cuidadosa, pBDL experimentos pueden ser rentables, ya que el lóbulo unligated sirve como un control interno a los lóbulos ligados, cuando se someten a las mismas condiciones en el mismo animal. A diferencia de cBDL, un grupo de control independiente operado simulada no es necesario. pBDL es muy útil para comparar directamente localizada versus efectos sistémicos de la colestasis y otros componentes de la bilis retenida. también puede reutilizar pBDL como un nuevo método para investigar mecanismos relacionados con medicamentos y migración celular.

Para este experimento típico, pBDL fue realizado en ratones transgénicos de triplicado PiZ, que recapitulan la enfermedad del higado humana encontrada en la deficiencia de alfa-1 antitripsina (A1AT). El ratón PiZ overexpresses un transgen consistente en múltiples fragmentos genomic de la DNA que contienen las regiones de codificación del gen mutante de A1AT humano y promotor, junto con intrones y ~ 2 kilobases de upstream y downstream flanqueando las regiones14<sup...

Presentamos la ligadura del conducto biliar parcial como modelo quirúrgico de lesión hepática y regeneración en roedores.

Ligadura del conducto biliar parcial en el ratón: un modelo controlado de la colestasis obstructiva localizada

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile ...

El objetivo general de esta intervención quirúrgica es observar los efectos de la colestasis obstructiva localizada. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la hepatología sobre cómo identificar los mecanismos de regeneración hepática. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden hacer comparaciones significativas entre el lóbulo experimental ligado y el lóbulo control no ligado dentro del mismo animal.El Dr. Toshimasa Nakao, postdoctorado del laboratorio de cirugía de trasplantes, demostrará el procedimiento hoy. Después de confirmar una falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie en un ratón C57 negro 6 anestesiado de ocho a 12 semanas de edad, afeite la región abdominal con cortapelos y coloque al animal bajo un microscopio quirúrgico. Asegure las extremidades a la mesa y use hisopos estériles para desinfectar secuencialmente el área quirúrgica con 0,3 a 0,5 mililitros de povidona yodada y etanol al 70%.A continuación, haz una incisión en la línea media desde el xifoides hasta el pubis y utiliza un microrretractor para abrir la cavidad abdominal. Use pinzas para mosquitos para retraer el xifoides hacia la cabeza del ratón y use arcilla blanda para sostener las pinzas y el xifoides en esta posición. Hidrate la cavidad abdominal con uno o dos mililitros de PBS esterilizado a 37 grados centígrados y use hisopos de algodón húmedos para mover suavemente el intestino delgado hacia la cabeza del ratón.Corte los ligamentos entre el intestino delgado y el retroperitoneo para evitar dañar el tejido y envuelva los intestinos delgado y grueso con una esponja de gasa no tejida húmeda. Coloque el tejido intestinal en el lado caudal de la cavidad abdominal y use una pequeña esponja de gasa húmeda no tejida para retraer suavemente todo el hígado hacia el xifoides para exponer el hilio hepático y el ligamento hepatoduodenal. Localice el hilio hepático, el conducto biliar común en el lado ventral de la vena porta y los conductos biliares hepáticos izquierdo y derecho que drenan en la confluencia biliar principal en el hilio hepático.Con una sutura de nailon 10-0 y el lado romo de una aguja de sutura, ligar el lóbulo del conducto biliar hepático izquierdo. Una vez colocada la sutura, devolver el intestino delgado y el intestino grueso a su ubicación anatómica y confirmar la ausencia de torsión intestinal o sangrado intraabdominal. A continuación, retire las pinzas antimosquitos, cierre por separado las capas musculares y cutáneas con suturas continuas de Vicryl 4-0 y coloque el ratón bajo una lámpara de calor con supervisión hasta la recuperación completa.La comparación de las bioquímicas hepáticas séricas entre ratones ligados parcialmente a las vías biliares y ratones transgénicos ligados a las vías biliares completas para la agregación de proteínas hepáticas insolubles revela una lesión hepática mínima o colestasis en los ratones ligados a las vías biliares parciales y una lesión grave y acumulación de enzimas en los animales transgénicos ligados a las vías biliares completas. A medida que los ratones sometidos a una ligadura parcial del conducto biliar desarrollaron colestasis obstructiva específica del lóbulo con el tiempo, el lóbulo ligado parece un color ligeramente más pálido 14 días después de la cirugía en comparación con los lóbulos no ligados que mantuvieron su color marrón rojizo oscuro normal. El lóbulo ligado también muestra un aumento en la proliferación del conducto biliar y la fibrosis en comparación con los lóbulos no ligados en respuesta a la colestasis localizada inducida por la ligadura.Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 10 a 12 minutos si se realiza correctamente. Después de este procedimiento, se pueden usar otros métodos, como el rastreo de linaje, para responder preguntas adicionales sobre la localización de células madre en sitios de lesión y regeneración hepática. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer comparaciones significativas con la ligadura parcial de las vías biliares para identificar los efectos locales frente a los sistémicos.

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Investigación

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Biología

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Ligadura del conducto biliar parcial en el ratón: un modelo controlado de la colestasis obstructiva localizada

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