4.9: Ensayo de cambio en la corrida electroforética (EMSA)

EMSA, el ensayo de cambio de movilidad electroforética, también conocido como ensayo de cambio de gel, es un procedimiento bioquímico versátil y sensible. EMSA dilucida la unión entre proteínas y ácidos nucleicos mediante la detección de un cambio en las bandas en la electroforesis en gel.

Este video describe los principios de EMSA, proporciona un procedimiento general y analiza algunas aplicaciones.

La replicación, transcripción y reparación del ADN, así como el procesamiento del ARN, son procesos bioquímicos críticos. Todos ellos implican la unión entre proteínas y ácidos nucleicos. Muchas enfermedades y trastornos graves se asocian con modificaciones en esta unión. EMSA es una técnica para determinar cualitativamente si una proteína específica se une a un ácido nucleico específico. Primero, el ácido nucleico se marca, generalmente con fósforo radiactivo 32, para crear una sonda. A continuación, se mezclan la proteína de prueba y la sonda de ácido nucleico. Cuando una proteína se une a una sonda de ácido nucleico, el complejo resultante tiene mayor masa y una conformación diferente a la del ácido nucleico solo.

Una vez unidos, los complejos se analizan con electroforesis en gel. En esta técnica, un campo eléctrico obliga a las macromoléculas a migrar a través de una matriz de gel. Los componentes se separan en función de la masa, la carga y la conformación. La electroforesis puede separar los complejos proteína-ADN de las sondas no unidas. Dado que tienen diferentes masas y conformaciones, migrarán a través del gel a diferentes velocidades y se separarán. La separación es fácilmente detectable, gracias a la presencia del fósforo radiactivo, y demuestra que la proteína se une con éxito al ácido nucleico dado. Para verificar la identificación de la proteína, un "ensayo de superdesplazamiento" utiliza un anticuerpo con una afinidad conocida por la proteína. Esto tiene el beneficio adicional de cambiar aún más el complejo, aumentando la resolución.

Ahora que hemos visto los principios, vamos a verlo en el laboratorio.

Para comenzar el procedimiento, se debe aislar la proteína. Para ello, se utilizan técnicas de biología molecular para expresar la proteína en las células, y luego purificarla.

El ácido nucleico se amplifica y se marca para crear una sonda. El marcaje se realiza mediante incubación durante 10 min con dCTP que contiene fósforo radiactivo-32. Se requiere un banco de trabajo a prueba de radiación y equipo de protección.

A continuación, se prepara el gel. El gel debe ser no desnaturalizante, para evitar que la proteína altere la conformación y potencialmente se desvincule de la sonda durante la electroforesis. Los geles de poliacrilamida tienen tamaños de poro de 5 a 20 nm y son útiles para sondas cortas de hasta 100 pares de bases de longitud. Los geles de agarosa tienen tamaños de poro de 70-700 nm y son útiles para sondas más grandes.

Con la sonda de proteínas y ácidos nucleicos ya preparada, procedemos a la unión. Se prepara una solución tampón TRIS y se añaden la proteína y la sonda. El pH debe ser similar a las condiciones fisiológicas y la concentración de sal suficiente para evitar que la proteína forme enlaces débiles con ácidos nucleicos no objetivo. La reacción continúa durante 20-30 min a 4 ?C.

El siguiente paso es la electroforesis. Se utiliza un tampón de baja fuerza iónica y un pH similar al utilizado en la reacción de unión. Produce un "efecto de jaula" que estabiliza los complejos, aumenta la movilidad y reduce la generación de calor. Después de la electroforesis, los componentes del gel se transfieren al papel de filtro. En una habitación oscura, el papel de filtro se expone a la película. Si la proteína se une a la sonda, dos regiones marcadas distintas serán visibles en la transferencia. Uno que representa el complejo y otro separado que representa la sonda no enlazada. La separación demuestra que la proteína se unió con éxito al ácido nucleico.

Ahora que hemos visto el procedimiento básico, veamos algunas aplicaciones.

La cromatina es el complejo compacto de ADN y proteínas que se encuentran en las células eucariotas. Las enzimas remodeladoras de la cromatina modifican la estructura para abrir el ADN a la transcripción. A medida que esto cambia la movilidad del complejo, EMSA se puede utilizar para explorar la actividad de unión de la enzima.

Un enfoque alternativo para el marcaje aprovecha la interacción entre el ADN y la enzima metiltransferasa. Un cofactor puede ser modificado para unirse permanentemente al ADN a través de la metiltransferasa. En lugar de marcarse con fósforo-32, el cofactor se conjuga con biotina, lo cual es ventajoso porque no es radiactivo. Debido a que el cofactor es específico del sitio en su unión, es relevante para el genotipado, la detección de metilación y la entrega de genes. Los ácidos nucleicos biotinilados se detectan mediante fluorescencia ultravioleta.

Cuando los estímulos ambientales activan las histidina quinasas, un ?regulador de la respuesta? está fosforilado. Esto, a su vez, se une al ADN, afectando la transcripción, que puede ser estudiada por EMSA. Por ejemplo, ¿un regulador de respuesta en? Se demostró que Desulfovibrio vulgaris se une al gen de interés. Se utilizó la EMSA para verificar que la unión se había llevado a cabo.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre el ensayo de cambio de movilidad electroforética. Ahora debe comprender sus principios de funcionamiento, los pasos de su procedimiento y sus principales parámetros de funcionamiento.

¡Gracias por mirar!