Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

El objetivo general de este procedimiento modificado es aumentar la producción quimérica sin incurrir en costos adicionales o largos períodos de capacitación. Este método puede ayudar a los laboratorios a ser más eficientes en la producción de quimeras, especialmente en los casos en que las células madre embrionarias no son óptimas. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere equipo adicional ni formación especializada.

El demostrador del procedimiento será Thomas Hagler. Es un biólogo y estudiante de posgrado que trabaja en el laboratorio central. Para recolectar los embriones, seque el útero en un tejido de laboratorio para eliminar el exceso de sangre y coloque el órgano en una nueva placa de 60 milímetros bajo un microscopio de disección de bajo aumento.

Usando pinzas de disección para sostener el útero con cuidado y suavidad cerca del oviducto, inserte una aguja de calibre 25 conectada a una jeringa de 10 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de recolección de blast en el centro del útero, justo más allá de las puntas de las pinzas en un plano lo más paralelo posible. Aplique presión a las pinzas para asegurar la aguja dentro del útero y enjuague suavemente aproximadamente un mililitro de medio a través del cuerno uterino. Cuando se hayan expulsado todos los blastocistos, ensamble el aparato de pipeta bucal y utilice la pipeta bucal para transferir los embriones individuales a gotas individuales de medio de recolección de blast en una segunda placa de 60 milímetros.

A continuación, lave cada embrión en una segunda gota de medio de recolección y transfiera los embriones a una placa de cuatro pocillos hasta su inyección. Para comenzar, use un microinyector para aplicar vacío a la aguja de inyección. Coloque una placa de células madre embrionarias debajo del microscopio de inyección donde se colocan la aguja de inyección y la pipeta portaembriones.

Es esencial para el éxito de la inyección tomarse el tiempo necesario para configurar correctamente el microscopio. Esto incluye la cantidad adecuada de medios en la aguja y la alineación correcta del eje z. Use un microinyector para aplicar vacío a la aguja de inyección.

Manteniendo el menor espacio posible entre las células, extraiga células embrionarias de tamaño pequeño a mediano con superficie lisa y sin defectos obvios del plato de embriones. Después de recolectar al menos 15 células, coloque un embrión cerca de la abertura del soporte. Aplique vacío para asegurar el embrión al soporte y mueva la pipeta de sujeción hacia arriba o hacia abajo para ajustar el eje z hasta que el embrión toque el portaobjetos.

Enfoque fino en la zona pelúcida y ajuste el eje z de la aguja de inyección hasta que las células embrionarias cerca de la punta de la aguja estén enfocadas. Si es necesario, utilice la aguja de inyección para hacer rodar suavemente el blastocisto hasta que la masa celular interna esté en la posición adecuada para la inyección. Con un empuje firme pero controlado, inserte la aguja de inyección a través de la zona de pellucida en la masa celular interna y aplique una ligera presión al microinyector de la aguja de inyección para ayudar a evitar que el blastocelelo colapse.

Una vez que la aguja haya penetrado en el blastocele, aplique presión al microinyector para transferir todas las células madre embrionarias al embrión, deteniéndose brevemente cuando el bisel de la aguja comience a salir del embrión para permitir que la presión en el embrión vuelva a la normalidad mientras aún retiene las células. Cuando se hayan inyectado todos los blastocistos, utilice un dispositivo de transferencia de embriones no quirúrgico para entregar los embriones a ratones Swiss Webster en etapa embrionaria 2.5 de acuerdo con las instrucciones del fabricante y aloje a los ratones individualmente después de cada transferencia hasta el parto y el destete posterior. En este experimento representativo, las tasas de embarazo no se alteraron entre la masa de células trans internas inyectadas y los grupos de control inyectados tradicionalmente y un número igual de crías sobrevivieron hasta el destete de cada grupo.

En particular, mientras que el número de ratones al destete se mantuvo sin cambios, un número significativamente mayor de crías del grupo de masa de células internas trans inyectadas mostraron quimerismo del color del pelaje en comparación con el grupo de control inyectado. Lo mejor de esta técnica es que solo requiere un simple cambio en la orientación del embrión para facilitar una mayor producción en quimeras. La configuración adecuada del microscopio es esencial.

Si el microscopio y los manipuladores no están configurados correctamente y no se mantienen bien, el proceso de inyección no funcionará. Si eres nuevo en las inyecciones de embriones, la repetición es la única forma de aprender. Para los principiantes, el manejo de embriones tiende a ser la parte más difícil del procedimiento.

Ser capaz de mover embriones de manera eficiente de un plato a otro sin perder ninguno es la parte más crucial del experimento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo un simple cambio en su técnica de inyección estándar puede ayudarlo a ser más eficiente en la producción de quimeras.