Name: Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprende a aumentar la producción de quimeras mediante una modificación simple en la orientación del embrión durante la inyección de células madre embrionarias. Este método eficiente no requiere equipo adicional ni entrenamiento especializado.

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Esta investigación fue apoyada [en parte] por el programa de investigación intramuros del NIH, Instituto Nacional de Ciencias de salud ambiental. Agradecimiento especial a Shyamal Peddada para el análisis estadístico. También queremos agradecer a Humphrey Yao, Gary Ave y Yuki Arao para la revisión de este manuscrito y Franco DeMayo por su continuo apoyo y asesoramiento.

Todas las operaciones se realizaron como parte del funcionamiento normal de la instalación de NIEHS Knock Out Mouse base. Todos los ratones fueron mantenidos en un 12:12 ciclo de h luz: oscuridad y se alimentan una dieta de agua y NIH-31 ad libitum. Todos los experimentos fueron realizados según el cuidado Animal y Comité de uso del nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental.
1. animal preparación
<ol><li>Raza de ratones donantes, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > ratones femeninos/j 8-10 semanas de edad naturalmente a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J ratones machos entre 8 y 26 semanas de edad. Verificación se conecta visualmente a la mañana siguiente (E0.5).</li>
	<li>Se crían ratones receptores, Swiss Webster ratones hembra entre 6 y 9 semanas de edad se crían naturalmente a vasectomía ratones machos Swiss Webster. Verificación se conecta visualmente a la mañana siguiente (E0.5).</li>
</ol>2. ES la célula preparación
<ol><li>Para derieved 129 AB2.2 ES cells, cultura células en DMEM suplementado con 15% FBS, 1% glutamina, 1% Penn/strep y 0.1% β-mercaptoetanol. Cultura todas las células de otras ES siguiendo las instrucciones del proveedor de celular ES, utilizando los protocolos recomendados.</li>
</ol>3. embrión colección
<ol><li>
Disección de animales
	<ol>
<li>Preparar varios platos de 60 mm, aproximadamente 1 por 5 ratones más suplemento 3, con 10 mL ráfaga colección los medios de comunicación (BCM) (10% FBS en DMEM), y un 4 plato bien con 0.5 mL de BCM por pozo. Equilibrar a 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Eutanasia a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > ratones femeninos /J en E3.5 CO2 asfixia, con un caudal de 10%.</li>
		<li>Después euthanizing, coloque el ratón en la posición supina y mojado el abdomen con etanol al 70%.</li>
		<li>Hacer la primera incisión a través de la piel, en el punto medio del abdomen, haciendo la apertura tan amplia como sea posible. A continuación abra a través de la pared abdominal, otra vez hacer la incisión lo más amplia posible. Nota: Hacerlo en dos pasos ayuda a reducir o eliminar la contaminación de la piel.</li>
		<li>A partir de un ovario y sostiene la almohadilla grasa del ovario con fórceps romos, retire con cuidado el ovario, oviducto y útero, teniendo mucho cuidado para mantener el tejido adiposo a un mínimo. Extirpar el útero como una sola unidad, o como los cuernos, sin cambio en el procedimiento siguiente.</li>
		<li>Después del retiro, colocar el útero en un plato de 60 mm que contiene medios de colección ráfaga.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eliminación de embriones
	<ol>
<li>Preparar una jeringa de 10 mL llenada de BCM y montar con una aguja de 25 G.</li>
		<li>Un útero a la vez, les quite el plato de sujeción de BCM, seque en un paño para quitar el exceso de sangre y coloque en un plato de 60 mm con un aumento bajo microscopio de disección.</li>
		<li>Sujetando con cuidado y suavemente del útero justo por debajo del extremo distal (cerca del oviducto) con pinzas de disección, inserte la aguja en el centro del útero en como paralelo un plano como sea posible. Insertar la aguja más allá de las puntas de las pinzas.</li>
		<li>Aplicar presión a las pinzas para sujetar el útero a la aguja y expulsar aproximadamente 1 mL de BCM a través del cuerno del útero. Nota: Debe tenerse cuidado en este paso, ya que demasiada presión sobre la jeringa causará un flujo incontrolable de los medios de comunicación, a menudo dejando el plato.</li>
		<li>Después del lavado del útero, útero entero hasta 5 por plato 60 mm, vuelva a colocar el plato en la incubadora hasta la colección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colección de embriones
	<ol>
<li>Utilizando una pipeta de cristal dibujado de la mano y un aparato de pipetas de boca, recoger blastocistos en un ámbito de disección, entre 25 X y 35 X. (Figura 1). Nota: Aparato de pipetas de boca consta de 30-40 cm de tubería flexible, menores de 5 mm de diámetro interior Inserte un 1 000 μl Punta de pipeta, punto primero en un extremo y colocar la pipeta de vidrio en él. Agregar un filtro de jeringa en el otro extremo, con un atado 1 cc jeringa barril, sin émbolo, a actuar como una pieza de la boca.</li>
		<li>Eliminar platos de la incubadora y usando un patrón cuadriculado, examinaron cada parte del plato para embriones. Embriones se recogen hasta individualmente y coloque sobre la gota de BCM en un plato secundario.</li>
		<li>Después de recoger de todos los platos, lavar los embriones una vez más en una gota de dulce BCM y luego colocar en el plato bien 4 a la espera de la inyección.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. embrión inyección
<ol><li>Recoger células madre embrionarias individualmente con la aguja de inyección basada en la confirmación.<ol>
<li>Preparar un plato de inyección mediante la adición de 5-7 mL de medio de inyección (DMEM, 10% FBS y 20 mM HEPES) a un plato de inyección de fondo de cristal. Las inyecciones se realizan a temperatura ambiente.</li>
		<li>Uso microinyector aire o aceite, aplique vacío a la aguja para extraer células madre embrionarias. Tenga cuidado de mantener como poco espacio como sea posible entre las células. Cuentan las células ES aquí o en la etapa de inyección.</li>
		<li>Seleccione las celdas ES que son de mediano a pequeño tamaño en comparación con la población en general de las células, con una superficie lisa y sin defectos obvios como las vacuolas. Nota: Poblaciones celulares ES varían mucho en calidad morfológica, y las normas utilizadas tendrán que ajustar con ellos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyectar los embriones con aproximadamente 15 células madre embrionarias (figura 1).<ol>
<li>Colocar una pipeta de sujeción punta un microinyector segundo de aire y coloque un embrión cerca de la abertura del titular. Se aplica vacío para sujetar el embrión al titular.</li>
		<li>Ajuste para el eje z moviendo la pipeta holding hacia arriba o hacia abajo para que el embrión apenas toca la diapositiva, seguida de concentración de la multa en la zona. A continuación, ajuste el eje Z de la aguja de inyección para que células madre embrionarias cerca de la punta están en foco.</li>
		<li>Ajuste el embrión ahora empujando suavemente de la aguja de inyección en la parte superior o inferior, girando para poner el ICM en la posición deseada.</li>
		<li>Inserte la aguja a través de la zona y el ICM o trofoblasto, usando una presión firme pero controlada. Aplicar una ligera presión a la microinyectora de la aguja de inyección para ayudar a mantener el blastocoel de derrumbarse.</li>
		<li>Una vez que la aguja ha penetrado el blastocoel, aplicar presión de la microinyectora para transferir células madre embrionarias para el blastocoel del embrión. PAUSE brevemente como el bisel de la aguja empieza a salir el embrión para permitir la presión en el embrión para volver a la normalidad, al tiempo que conserva las células. Nota: Referencia grupo células madre embrionarias fueron inyectados normalmente, siguiendo un tradicional ES la célula de inyección protocolo9, teniendo cuidado de no para tocar el ICM. También se inyectaron células madre embrionarias a través del ICM, empuja la aguja directamente a través de la ICM (TICM) (figura 2película suplementario).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. transferencia de eEmbryos
<ol><li>Transferencia de embriones de ratones Swiss Webster en E2.5, utilizando un dispositivo de transferencia embrionaria no quirúrgica, por procedimientos de fabricación. Este procedimiento no quirúrgico no requiere anestesia ni cuidados especiales después de la operación. Ratones de la casa individualmente después de la transferencia de embriones y a través de la entrega y posterior al destete.</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li>
<li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li>
<li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+knockout+mouse+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li>
<li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells%3A+A+Case+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li>
<li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+embryo%22">Manipulating the Mouse embryo</a>. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22Advanced+Protocols+for+Animal+Transgenesis%22">Advanced Protocols for Animal Transgenesis</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).</li>
<li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).</li>
</ol>

Los autores tienen intereses que compiten a revelar.

Durante mucho tiempo se ha pensado que cualquier disturbio del ICM podría conducir a la mortalidad, de hecho, los protocolos actuales de microinyección blastocisto todavía advierten de esta12,13. Lo que hemos mostrado aquí es la microinyección a través de la RIC no es perjudicial para el embrión y aumenta la producción de quimeras.
El mecanismo exacto de este efecto no ha sido identificado. Sin embargo, la interrupción mecánica del ICM...

Durante casi 25 años, la creación de ratones genéticamente apuntados ha sido un proceso lento, a menudo obstaculizado por un cuello de botella en la etapa de blastocistos ES células microinyección para la generación de germline transmisión de quimeras. Los avances recientes, incluyendo CRISPR/Cas91,2 en células madre embrionarias y de alto rendimiento ES célula consorcios de generación como KOMP, han mejorado la generación y disponibilidad de modificados genéticamente células madre embrionarias. Sin embargo, la generación de quimeras del germline sigue siendo un cuello de botella en la creación de ratones modificados genéticamente de estas células ES3,4. Proyectos de generación de alto rendimiento ES la célula han estado plagados de alta variabilidad en la calidad de células ES, que es crítica para la exitosa creación de quimeras del germline. Además, algunas de las líneas de células ES comúnmente utilizadas son conocidos por aneuploidia alta y la difícil producción de germline quimeras competentes5.
Muchos métodos se han desarrollado para la creación de ratones con una quimera o superior, o totalmente celular ES derivado ratones6,7,8,9,10. Mientras que cada uno de estos sistemas tiene sus propios méritos, también tienen sus defectos. La generación de quimeras tetraploides, mientras que la generación de celulares ES de 100% derivados de ratones, es ineficiente y generalmente limitado a líneas exogámica 5,6. Más nuevos métodos de inyección de mórula pueden producir alto porcentaje quimeras, cercana al 100%, pero generalmente requieren equipo adicional significativa (láser o piezoeléctricos) y capacitación10,11. En laboratorios donde estas técnicas ya están en marcha, esta nueva metodología puede no ser necesaria.
Objetivo de este estudio fue encontrar un método que utiliza técnicas comunes y equipos disponibles para aumentar la velocidad de generación de quimera, aumentando la posibilidad de transmisión del germline del alelo del mutante para establecer la colonia de ratón posterior.

<table><tbody><tr><td>Aguja de inyección de células ES</td><td>Humagen</td><td>MSC-20-0</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo NSET</td><td>Paratechs</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (tecnologías de vida)</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (tecnologías de vida)</td><td>10439-024</td><td>lotes deben probarse individualmente para comprobar la compatibilidad de células ES.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Micro manipulador</td><td>Leica</td><td>Micro manipulador</td><td></td></tr><tr>micro<td>inyector</td><td>Eppendorf AG</td><td>Cell Tram Air 5176</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>Plato de 4 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Plato de 60 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td></td></tr><tr><td>B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J</td><td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, EE. UU</td>. <td>000058</td><td></td></tr><tr><td>ratones Swiss Webster</td><td>Taconic, EE. UU</td>. Plato de inyección <td>Tac:SW</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MatTek Corp.</td><td>P50G-0-30-F</td><td></td></tr></tbody></table>

trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

En un esfuerzo por aumentar la eficiencia en la creación de ratones modificados genéticamente a través de metodologías ES celular, presentamos una adaptación del protocolo actual de inyección de blastocisto. Aquí divulgamos que una simple rotación del embrión y de la inyección a través de la masa celular de Trans-interno (TICM) aumentó el porcentaje de ratones quiméricos del 31% al 50%, con ningún equipo adicional o formación más especializada. endogámicas de 26 diferentes clones y clones total 35 fueron inyectados en un período de 9 meses. No hubo diferencias significativas en la tasa de embarazo o índice de recuperación de embriones entre técnicas de inyección tradicional y TICM. Por lo tanto, sin ninguna alteración importante en el proceso de inyección y un simple posicionamiento del blastocisto e inyectar a través del ICM, liberación de las células madre embrionarias en la cavidad del blastocoel puede mejorar potencialmente la cantidad de producción quimérica y posterior transmisión de la línea germinal.

Tratamiento de la línea celular como el efecto aleatorio, un modelo lineal de efectos mixtos se utilizó para analizar los datos en el software (e.g. SAS (versión 9.2)). Cada análisis para el número de embriones transferidos y la línea celular. El segundo análisis también controlado por el número de cachorros que sobrevivieron.
Para este estudio, cada línea ES celular y el clon fue inyectado con tradicionales y técnicas TICM, alt...

Aquí presentamos un protocolo para aumentar la producción de quimeras sin el uso de nuevos equipos. Un cambio de orientación simple del embrión para la inyección puede aumentar el número de embriones producidos y potencialmente reducir la línea de tiempo a la transmisión de la línea germinal.

Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

El objetivo general de este procedimiento modificado es aumentar la producción quimérica sin incurrir en costos adicionales o largos períodos de capacitación. Este método puede ayudar a los laboratorios a ser más eficientes en la producción de quimeras, especialmente en los casos en que las células madre embrionarias no son óptimas. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere equipo adicional ni formación especializada.El demostrador del procedimiento será Thomas Hagler. Es un biólogo y estudiante de posgrado que trabaja en el laboratorio central. Para recolectar los embriones, seque el útero en un tejido de laboratorio para eliminar el exceso de sangre y coloque el órgano en una nueva placa de 60 milímetros bajo un microscopio de disección de bajo aumento.Usando pinzas de disección para sostener el útero con cuidado y suavidad cerca del oviducto, inserte una aguja de calibre 25 conectada a una jeringa de 10 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de recolección de blast en el centro del útero, justo más allá de las puntas de las pinzas en un plano lo más paralelo posible. Aplique presión a las pinzas para asegurar la aguja dentro del útero y enjuague suavemente

trans-inner-cell-mass-injection-embryonic-stem-cells-leads-to-higher

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Debido a que el corion duro y blando de embriones, la manipulación de embriones medaka es más complicado que en el pez cebra. Este video muestra paso a paso los procedimientos para la forma de manipular embriones medaka, incluyendo dechorionation, montaje de agarosa para la imagen y el trasplante de células para la producción de quimeras. Estos procedimientos son esenciales para el uso medaka y pez cebra en un laboratorio para sacar el máximo provecho de sus características complementarias para...

Dechorionation de embriones de medaka y trasplante de células para la generación de quimeras

Usando la punta fina micropipetas se inyecta el plásmido de ADN en subdominios de somitas pollo o tubos neurales. La concentración del plásmido se ajusta a generar solo las células transfectadas. A continuación, permitir que las células se desarrollan en poblaciones clonales.

Transfección de células individuales en embriones de pollo

Estamos aquí demostrar que la reprogramación epigenética mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) puede ser utilizado como una herramienta para generar modelos de ratones con la pre-definido de receptores de células T (TCR) especificidades. Estos ratones transnuclear expresar la correspondiente TCR de su locus endógeno bajo el control del promotor endógeno.

Los ratones con Transnuclear predefinidos Especificidades receptor de células T contra la Toxoplasma gondii Obtenidos a través de la SCNT

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

Demostramos un método para injertar células cultivadas en sitios definidos de embriones tempranos de ratón para determinar su potencial in vivo. También introducimos un método de electroporación optimizado que utiliza capilares de vidrio de diámetro conocido, lo que permite la entrega precisa de ADN exógeno a unas pocas células en los embriones.

Los métodos para la transferencia Precisamente localizada de células o ADN en Early postimplantación embriones de ratón

Aquí presentamos un protocolo para la conversión directa de fibroblastos embrionarios murinos en células madre trofoblásticas completamente funcionales y estables mediante la sobreexpresión de diez días de Tfap2c, Gata3, Eomes y Ets2.

Protocolo para la conversión directa de murinos fibroblastos embrionarios en células madre Trofoblasto

Se describe un protocolo para realizar un trasplante en el útero (IUT) a través de rutas intravenosa e intraamniótica de inyección en el modelo murino. Este protocolo puede utilizarse para introducir las células, vectores virales y otras sustancias en el ambiente fetal inmune tolerante único.

Intravenosa y Intra-amniótico en el útero el trasplante en el modelo murino

En este método, los tejidos cardíacos embrionarios son quirúrgicamente microdissected, disociado, etiquetado fluorescente e implantado en los tejidos embrionarios de host. Esto proporciona una plataforma para el estudio de la organización del desarrollo nivel individuo o tejido bajo condiciones hemodinámicas ectópicas o alteración paracrina/yuxtacrina entornos.

Sistema basado en la microinyección en Vivo implantación de cardiomiocitos embrionarios en el embrión aviar

El objetivo general de este artículo es describir cómo realizar la inyección intracelular ovo de materiales exógenos en embriones de pollo. Este enfoque es muy útil para estudiar la biología del desarrollo de los embriones de pollo.

En Ovo Inyección intravascular en embriones de pollo

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar modelos de ratón modificados genéticamente utilizando células madre embrionarias, especialmente para ADN grande knock-in (KI). Este protocolo se ajusta utilizando la edición del genoma CRISPR / Cas9, lo que resulta en una eficiencia de KI significativamente mejorada en comparación con el método convencional de orientación de ADN linealizado mediado por recombinación homóloga.

Focalización génica altamente eficiente mediada por CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias para desarrollar modelos de ratón manipulados genéticamente

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