Una plataforma integrada para la asignación de todo el genoma de cromatina Estados mediante secuenciación del ChIP de alto rendimiento en los tejidos del Tumor

El objetivo general de este protocolo es identificar de forma imparcial los patrones de estado combinatorio de la cromatina en tejidos tumorales y líneas celulares cancerosas. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética del cáncer, como cómo un estado de modificación de histonas estéril podría contribuir a la génesis del tumor. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden procesar múltiples modificaciones de histonas, así como múltiples muestras, tanto de manera simultánea como eficiente.

Primero, disocie 50 miligramos de tejido de melanoma manualmente y dos mililitros de la solución salina equilibrada de Hank o HBSS, usando una hoja de afeitar estéril. Picar el tejido en trozos de tres o cuatro milímetros durante aproximadamente cinco minutos en una placa de cultivo de tejidos estéril. Transfiera la solución tisular a un tubo disociador y agregue otro octavo de mililitros de HBSS.

Disociar aún más el tejido, utilizando un disociador, hasta homogeneizarlo. A continuación, reticular el tejido, añadiendo 200 microlitros de formaldehído al 16% por cada tres mililitros de HBSS. Con una batidora, agite la mezcla a 10 rpm durante exactamente 10 minutos a 37 grados centígrados.

Después de retirar la muestra de la incubadora, agregue 200 microlitros de glicina tumoral por tres mililitros de muestra y agite la mezcla a 10 rpm durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Haga girar la muestra a 934 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados utilizando una centrífuga de sobremesa. Cuando termines, retira el sobrenadante y añade cinco mililitros de PBS helado.

A continuación, vuelva a centrifugar la muestra a 934 veces g y, a continuación, retire el sobrenadante. Añadir 300 microlitros de tampón ChIP con inhibidores de la proteasa por cada 50 miligramos de tejido y lisar las muestras durante 30 minutos en hielo. Mientras las células están lisando, encienda el disruptor del baño de agua y el sistema de enfriamiento asociado y permita que la temperatura alcance los cuatro grados centígrados.

Coloque el tubo sonicador en el disruptor del baño de agua y sonique el tejido de melanoma durante 60 ciclos a 30 segundos de encendido y 30 segundos de apagado para obtener fragmentos de cromatina de 200 a 600 pares de bases. Para ocho miligramos de tejido de melanoma, incubar tres microgramos de cada anticuerpo de histonas con 20 microlitros de perlas magnéticas de proteína g y 100 microlitros de tampón de bloqueo de unión durante dos horas a cuatro grados Celsius con rotación, usando un revólver de tubo. Después de la sonicación, diluya la muestra cinco veces con tampón de dilución ChIP para reducir la concentración de SDS al 0,1%Una vez finalizada la incubación de las perlas magnéticas de anticuerpos y proteínas g, retire el tampón de dilución ChIP y vuelva a suspender las perlas en 240 microlitros del tampón fresco.

Luego, coloque 20 alícuotas de microlitros de las cuentas en 12 tubos separados, cada uno de los cuales se utilizará para una muestra de tejido separada. Alícuota el material sonicado uniformemente a las perlas de proteína g con anticuerpo específico y girar los tubos con un revólver de tubo durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente de la reticulación inversa, transfiera la solución de proteína de anticuerpo a una placa de 96 pocillos y colóquela en un soporte magnético.

Después de dejar que las cuentas se adhieran durante al menos 30 segundos, retire el sobrenadante. Lave las perlas cinco veces con 150 microlitros de tampón de lavado RIPA helado utilizando una pipeta multicanal. Mueva el imán continuamente durante 30 segundos por lavado, luego retire el sobrenadante.

Después de los pasos de lavado, agregue una mezcla maestra de tampón de elución, que contenga 44 microlitros de tampón de elución directa, un microlitro de Rnasa y cinco microlitros de protenasa k por chip e ingrese la muestra para la reticulación inversa. Incubar las muestras utilizando un termociclador de PCR durante cuatro horas a 37 grados centígrados, cuatro horas a 50 grados centígrados y de ocho a 16 horas a 65 grados centígrados. A la mañana siguiente, vuelva a colocar las muestras en el imán y transfiera el sobrenadante a una nueva placa de PCR de 96 pocillos que contiene el ADN precipitado amino.

Añada 2,3 perlas paramagnéticas a la solución y pipetee cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo 25 veces con una pipeta multicanal. Después de esto, incube a temperatura ambiente durante cuatro minutos. A continuación, vuelva a colocar las muestras en el imán e incube a temperatura ambiente durante otros cuatro minutos.

Después de desechar el sobrenadante, agregue 150 microlitros de etanol al 70% a las muestras e incube a temperatura ambiente durante 30 segundos sin alterar las perlas. Después de dejar que las perlas se sequen, retire las muestras del imán y agregue 30 microlitros de traza de 10 milimolares. Mezclar pipeteando 25 veces.

Después de incubar las muestras a temperatura ambiente, vuelva a colocarlas en el imán e incube a temperatura ambiente durante otros cuatro minutos. Transfiera 20 microlitros de cada muestra a una nueva placa de 96 pocillos para la preparación de la biblioteca. Después de la amplificación por PCR, retire las muestras y lleve el volumen total a 100 microlitros utilizando agua sin núcleo.

Realice la selección del tamaño paramagnético a doble cara añadiendo primero 55 microlitros de perlas a cada muestra y mezclando 25 veces con una pipeta. A continuación, incubar a temperatura ambiente durante cuatro minutos. Vuelva a colocar las muestras en el imán e incube a temperatura ambiente durante otros cuatro minutos para obtener fragmentos grandes en las perlas que no son adecuados para la secuenciación.

Después de la incubación, transfiera el sobrenadante a una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Agregue otros 25 microlitros de perlas paramagnéticas y mezcle pipeteando 25 veces e incube a temperatura ambiente fuera del imán durante cuatro minutos. Después de incubar a temperatura ambiente, vuelva a colocar las muestras en el imán e incube a temperatura ambiente durante cuatro minutos.

A continuación, deseche el sobrenadante. Mientras deja las muestras en el imán, agregue 150 microlitros de etanol al 70% e incube a temperatura ambiente durante 30 segundos sin alterar las perlas. Retire el etanol y repita el lavado.

Después de dejar que las perlas se sequen, retire las muestras del imán y agregue 25 microlitros de traza de 10 milimolares pH 8.0. Mezclar pipeteando 25 veces e incubar a temperatura ambiente, fuera del imán durante cuatro minutos. Después de incubar a temperatura ambiente, vuelva a colocar las muestras en el imán e incube a temperatura ambiente durante cuatro minutos.

Ahora, cuantifique las bibliotecas utilizando un instrumento de electroferograma de ADN de alta sensibilidad antes de la multiplexación para asegurarse de que los tamaños sean adecuados para la secuenciación. Este protocolo permite la inmunoprecipitación de tejidos tumorales congelados y líneas celulares que se pueden realizar en docenas de muestras y en paralelo utilizando un método de alto rendimiento. Los fragmentos de cromatina deben oscilar entre 200 y 1000 pares de bases para una inmunoprecipitación óptima.

El ADN ChIP purificado debe cuantificarse antes de proceder a la preparación de la biblioteca. Las bibliotecas completas adecuadas para la multiplexación y la secuenciación de próxima generación deben oscilar entre 200 y 600 pares de bases y estar desprovistas de dímeros de cebadores. Tras la secuenciación posterior, hay muchas métricas de control de calidad que deben cumplirse antes de continuar con los pasos posteriores de la canalización, como las llamadas máximas de macs y el análisis chromHmm.

Las muestras de ChIP deben enriquecerse con el ADN de entrada y cada modificación de histonas debe mostrar un perfil distinto que represente un componente específico del panorama epigenético. El algoritmo HMM de cromo utiliza un modelo de Markov oculto multivariante para identificar los patrones de cromatina combinatoria y espacial recurrentes más destacados en función de las modificaciones de histonas estudiadas. Utilizando estas seis modificaciones, el cromo HMM identifica estados de cromatina funcionalmente distintos que representan dominios represivos y activos, como la represión polycomb, la represión heterocromática, la transcripción activa y los potenciadores activos.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro días, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante determinar las condiciones óptimas de sonicación y la especificación de los anticuerpos antes de continuar con la preparación de la biblioteca y el análisis de datos. Para aprender este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación RRS y la captura de confirmación cromosómica para determinar la coalición de partes del estado de la cromatina con expresión génica y estructura de cromatina superior.

Después del experimento, la técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética del cáncer exploren los patrones de estado de la cromatina en muestras tumorales de pacientes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo procesar y disociar tejidos tumorales, realizar la inmunoprecipitación de cromatina, preparar bibliotecas para el secuenciaje de próxima generación, procesar datos posteriores a la secuenciación y obtener información sobre los pasos iniciales del análisis posterior. No olvide que cuando se trabaja con formaldehído, puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como una campana extractora adecuada, al realizar este procedimiento.