Name: Una plataforma integrada para la asignación de todo el genoma de cromatina Estados mediante secuenciación del ChIP de alto rendimiento en los tejidos del Tumor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprende a identificar patrones de estados cromatínicos en tejidos tumorales mediante ChIP-seq de alto rendimiento. Este protocolo optimizado permite procesar múltiples modificaciones de histonas simultáneamente para investigar la epigenética del cáncer.

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Agradecemos a Marcus Coyle, Curtis Gumbs, núcleo de SMF en el MDACC para apoyo de la secuencia. El trabajo descrito en este artículo fue apoyado por subvenciones de la subvención del NIH (CA016672) a base de SMF y NCI premios (1K99CA160578 y R00CA160578) para K. R.

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Autores no declaran conflictos.

Este protocolo describe un módulo de ChIP-seq alto rendimiento completo e integral para la asignación de todo el genoma de Estados de cromatina en líneas celulares y tejidos del tumor humano. En cualquier protocolo de ChIP-seq, uno de los pasos más importantes es la especificidad del anticuerpo. Aquí, este método ilustra las condiciones de la inmunoprecipitación de las describe seis modificaciones de las histonas, las cuales son de ChIP-grado y han sido previamente validadas en nuestro y otros laboratorios<sup class="xre...

La mayoría de los genomas mamíferos (98-99%) se compone de secuencia codifica, y estas regiones nocoding contienen elementos reguladores que participan en el control de la expresión génica y cromatina organización1,2. En una célula normal, el conjunto específico de la DNA genomic en estructura de la cromatina compactada es crítico para la organización espacial, la regulación y sincronización precisa de diversos procesos asociados de ADN3,4,5. En una célula cancerosa sin embargo, modificaciones de la cromatina por mecanismos epigenéticos aberrantes pueden llevar a la inadecuada organización de la estructura de la cromatina, incluido el acceso a elementos reguladores, sistemas de bucles cromosómicos y gene expresión patrones6, 7,8,9,10.
A pesar de los avances recientes, hemos limitado entendimiento de las alteraciones epigenéticas que se asocian a progresión del tumor o la respuesta terapéutica. El epigenoma consiste en una serie de modificaciones, incluyendo marcas de histonas y la metilación del ADN, que forman colectivamente un estado dinámico (denominado estado de cromatina) que inmiscuye en redes de expresión de genes y otros procesos críticos para el mantenimiento de identidad celular. Recientemente, alteraciones en potenciadores se han demostrado en múltiples neoplasias malignas mediante el estudio de perfiles de H3K27Ac11. Aunque tales estudios proporcionan la penetración en la correlación de las marcas epigenéticas aisladas, más de 100 modificaciones epigenéticas han sido identificados12,13 sin el claro entendimiento de sus papeles biológicos y interdependencia. Además, hay un número aún mayor de posibles patrones combinatorios de estas histonas y ADN modificaciones y es estos patrones combinatorios - modificaciones no individuales - que dictan Estados epigenéticos14. Por lo tanto, hay una tremenda necesidad de identificar alteraciones en estos Estados de cromatina durante la progresión del cáncer o la respuesta a la terapia. Amplio conocimiento de las alteraciones del epigenoma en cánceres ha sido rezagadas en parte debido a la técnica (por ejemplo, generación de datos a gran escala de pequeña cantidad de células solo material clínicas) y analíticos (por ejemplo, algoritmos para definir problemas de combinatoria de Estados). Por lo tanto, hay una necesidad crítica de métodos robustos de alto rendimiento para perfiles de gran número de marcas de modificación de las histonas de material clínico y fácil de implementar enfoques computacionales para predecir patrones combinatorios que facilitará determinación de Estados epigenéticos asociados a diferentes etapas de la tumorigénesis y resistencia a la terapéutica. Además, datos recientes epigenoma perfilado estudios15,16,17,18,19,20,21, 22,23 en tejidos normales y líneas celulares puede ser integrado con los perfiles de la cromatina de tumores para mayores revelaciones en el epigenoma contribución a la biología del tumor.
Cromatina de perfiles se ha convertido en una poderosa herramienta para la identificación de los patrones de enlace global de diferentes modificaciones de la cromatina15,24. En los últimos años, ChIP-seq se ha convertido en el "gold standard" para el estudio de las interacciones DNA-proteína en una escala global25,26,27. Para cualquier experimento de ChIP-seq, son pasos críticos necesarios para su éxito, incluyendo la disociación y el procesamiento de tejido, determinar condiciones óptimas de sonicación, determinar la concentración óptima del anticuerpo para precipitación, preparación de la biblioteca, la secuencia de procesamiento de datos y posteriores análisis. Cada uno de estos pasos contienen puntos clave de control de calidad y en conjunto, son crucial para correctamente identificar posibles objetivos para la validación funcional. A través de la innovación en estos pasos, varios estudios anteriores han desarrollado metodologías para realizar el ChIP o ChIP-Seq de pequeña cantidad de tejidos28,29,30,31,32 . Además, algunos estudios han sugerido protocolos para experimentos de ChIP de alto rendimiento seguidos de PCR basado en la cuantificación de33,34. Finalmente, algunas plataformas de análisis disponible públicamente para ChIP-Seq datos ahora están disponibles como Easeq35 y36de la galaxia. Sin embargo, ha faltado una plataforma integrada para realizar ChIP-Seq en un modo de alto rendimiento en combinación con una tubería computacional para realizar la sola marca así como el análisis del estado de cromatina.
Este protocolo describe un flujo completo e integral de ChIP-seq para el mapeo del genoma de Estados de la cromatina en los tejidos del tumor y líneas celulares, con fácil seguir las pautas que abarca todos los pasos necesarios para un exitoso experimento. Mediante la adopción de un método de alto rendimiento previamente descrito por Blecher-Gonen et al. 37, este protocolo puede realizarse en decenas de muestras en paralelo y se ha aplicado con éxito en líneas celulares de cáncer y tumores humanos como melanoma, colon, próstata y multiforme del glioblastoma. Se demuestra la metodología de seis modificaciones de las histonas del core que representan componentes claves del paisaje regulación epigenético en líneas celulares de melanoma humano y muestras tumorales. Estas modificaciones incluyen H3K27ac (potenciadores), H3K4me1 (potenciadores activos y listos), H3K4me3 (promotores), H3K79me2 (transcrito regiones), H3K27me3 (polycomb represión) y H3K9me3 (heterochromatic represión). Estas marcas pueden utilizarse solo o en combinación para identificar Estados de cromatina funcionalmente distintas que representan ámbitos represivos y activadas.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo H3K4me1 de grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo H3K27ac de grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo H3K4me3 de grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo H3K79me2 de grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab3594</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo H3K27me3 de grado ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 de grado ChIP anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris HCl, pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>T1080</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma - Vida Ciencias</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746460</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1% TWEEN-20</td><td>Fisher Bioreactivos</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA - Sigma libre de IgG</td><td>- Vida Ciencias</td><td>A2058-5G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Tubo C</td><td>GentleMACS</td><td>120-008-466</td><td>tubo de disociación</td></tr><tr><td>16% Formaldehído</td><td>Peierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>miniInhibidor de proteasa&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836153001</td><td>comprimidos inhibidores de la proteasa</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10009D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Tubos NGS 0,65 mL</td><td>Tubos de sonicación</td><td>Diagenode</td><td>C30010011</td></tr><tr><td>DynaMag - 96 Faldón lateral</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td>Soporte magnético de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Tampón TE</td><td>Promega</td><td>V6231</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Invitrogen</td><td>100005393</td><td></td></tr><tr><td>Perlas AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>perlas paramagnéticas</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ds Kit de ensayo de ADN de alta sensibilidad</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>reactivos de ADN de alta sensibilidad</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit de preparación de bibliotecas de ADN</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td>Kit de preparación de bibliotecas</td></tr><tr><td>de ADN Agua</td> <td>sin nucleasasAmbion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Alta sensibilidad D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>reactivos de ADN de alta</td></tr><tr><td>sensibilidad Reactivos D1000 de alta sensibilidad</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td>reactivos de ADN de alta sensibilidad</td></tr><tr><td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7335L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7500L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>instrumento de electroferograma de ADN de alta sensibilidad</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico dispositivo de sonicación&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060001</td><td>baño de agua disuputor</td></tr><tr><td>Mezclador</td><td>Nutator</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Touch Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>PCR Termociclador</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Scientific</td><td>2322</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Denville</td><td>1003123</td><td></td></tr><tr><td>tubo Revólver</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td>88881001</tr><tr><td>Placa con faldón de 96 pocillos</td><td>Eppendorf</td><td>47744-110</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R Centrífuga&nbsp;</td><td>Centrífuga de sobremesa</td> <td>Beckman Coulter</td><td>A99464</td></tr><tr><td>Centrífuga 5424</td><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td></tr><tr><td>Tiras de tubo óptico (8x Strip)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Tapas de tiras de tubo óptico (8x strip)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de carga, 10 unidades</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice IKA MS3 Vórtice</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

una plataforma integrada para la asignación de todo el genoma de cromatina estados mediante secuenciación del chip de alto rendimiento en los tejidos del tumor

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Modificaciones de las histonas constituyen un componente importante del epigenoma y desempeñan importantes funciones reguladoras para determinar el estado transcripcional de loci asociados. Además, la presencia de modificaciones específicas se ha utilizado para determinar la posición y elementos funcionales no codificante de identidad como potenciadores. En los últimos años, seguida por la secuencia de generación siguiente (ChIP-seq) de inmunoprecipitación de cromatina se ha convertido en una poderosa herramienta en la determinación de los perfiles de genoma de modificaciones de las histonas individuales. Sin embargo, se ha vuelto cada vez más claro que los patrones combinatorios de modificaciones de la cromatina, denominados Estados de cromatina, determinan la identidad y la naturaleza del locus genómico asociado. Por lo tanto, los flujos de trabajo de sólidas metodologías de (HT) de alto rendimiento para perfilar una serie de marcas de modificación de las histonas, así como tuberías de análisis computacional capaces de manejar miríadas de ChIP-Seq perfiles conjuntos de datos, son necesarios para determinación integral de epigenómica Estados en gran número de muestras. Flujo de trabajo de la HT-ChIP-Seq presentada consta de dos módulos: 1) un protocolo experimental para perfilar varias modificaciones de la histona de pequeñas cantidades de muestras tumorales y líneas celulares en un formato de 96 pozos; y 2) una tubería de análisis computacional de datos que combina las herramientas existentes para calcular combinatoria cromatina estado patrones y ocupación de cada marca. Juntos, estos dos módulos facilitan el fácil procesamiento de cientos de muestras de ChIP-Seq en forma rápida y eficiente. El flujo de trabajo que presentamos se utiliza para derivar patrones de cromatina estado de 6 perfiles de marca de las histonas en melanoma tumores y líneas celulares. En general, se presenta un flujo de trabajo de ChIP-seq integral que puede aplicarse a decenas de muestras de tumores humanos y líneas celulares de cáncer para determinar aberraciones epigenómicas en varias malignidades.

Este protocolo permite la inmunoprecipitación de los tejidos del tumor congelado y líneas celulares que se pueden realizar en decenas de muestras en paralelo utilizando un método de alto rendimiento (figura 1A). Fragmentos de cromatina deben estar comprendida entre ~ 200-1000 bps para la inmunoprecipitación óptima. Hemos observado que el tiempo necesario para alcanzar la misma longitud de corte es diferente para diferentes tejidos y tipos cel...

Aquí, describimos un protocolo de secuencia de ChIP de alto rendimiento optimizado y tubería de análisis computacional para la determinación de patrones de estado de todo el genoma cromatina de líneas celulares y tejidos del tumor congelado.

Una plataforma integrada para la asignación de todo el genoma de cromatina Estados mediante secuenciación del ChIP de alto rendimiento en los tejidos del Tumor

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

El objetivo general de este protocolo es identificar de forma imparcial los patrones de estado combinatorio de la cromatina en tejidos tumorales y líneas celulares cancerosas. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética del cáncer, como cómo un estado de modificación de histonas estéril podría contribuir a la génesis del tumor. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden procesar múltiples modificaciones de histonas, así como múltiples muestras, tanto de manera simultánea como eficiente.Primero, disocie 50 miligramos de tejido de melanoma manualmente y dos mililitros de la solución salina equilibrada de Hank o HBSS, usando una hoja de afeitar estéril. Picar el tejido en trozos de tres o cuatro milímetros durante aproximadamente cinco minutos en una placa de cultivo de tejidos estéril. Transfiera la solución tisular a un tubo disociador y agregue otro octavo de mililitros de HBSS.Disociar aún más el tejido, utilizando un disociador, hasta homogeneizarlo. A continuación, reticular el tejido, añadiendo 200 microlitros de formaldehído al 16% por cada tres mililitros de HBSS. Con una batidora, agite la mezcla a 10 rpm durante exactamente

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El método de Hi-C permite la identificación imparcial de todo el genoma de las interacciones entre la cromatina (1). Hi-C parejas ligadura de proximidad y de secuenciación masiva en paralelo. Los datos resultantes se pueden utilizar para estudiar arquitectura genómica a diferentes escalas, los resultados iniciales identificaron características tales como los territorios de cromosomas, la segregación de la cromatina abierta y cerrada, y la estructura de la cromatina en la escala de megabase.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

Análisis de la interacción de la cromatina por género Secuenciación Paired-End (Chia-PET) es un método...

La cromatina Análisis de Interacción con la etiqueta de secuenciación pareadas final (Chia-PET) para el mapeo de la cromatina y la comprensión de las interacciones Reglamento Transcripción

La combinación de inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de ultra-alto rendimiento (chip-ss) puede identificar y mapear las interacciones proteína-ADN en un tejido o línea celular dada. Contorno es cómo generar una plantilla de chip de alta calidad para la posterior secuenciación, utilizando la experiencia con el factor de transcripción TCF7L2 como un ejemplo.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

Se describe aquí una plataforma que permite la detección ensayo cometa de daño en el ADN con un rendimiento sin precedentes. Los patrones de dispositivos células de mamífero en un microarray y permite el procesamiento paralelo de 96 muestras. El enfoque facilita el análisis de daño en el DNA nivel de base, daño en el ADN inducido por la exposición-y de reparación del ADN cinética.

CometChip: Un gran procesamiento Plataforma 96-Bueno, para medir el daño del ADN en las células en micromatriz Humanos

Se describe un sistema integrado para la secuenciación dirigida de próxima generación de muestras oncológicas. Este sistema multiplataforma está optimizado para biopsias tumorales de baja calidad y baja cantidad, se adapta a entradas de ADN bajas, incluye controles multivariantes bien caracterizados y cuenta con un nuevo llamador de variantes que se basa en medidas cuantitativas de control de calidad preanalítico.

Integración de Procesos húmedo y en seco de banco Optimiza Targeted secuenciación de próxima generación de baja calidad y biopsias de tumores de baja cantidad

La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Este artículo describe un protocolo ChIP-Seq semiautomatizado y microescalado de regiones de ADN asociadas con una modificación específica de histonas (H3K27ac) utilizando una plataforma de manejo de líquidos ChIP, seguida de la preparación de la biblioteca mediante tagmentación. El procedimiento incluye la evaluación de control con fines de calidad y cantidad y puede adoptarse para otras modificaciones de histonas o factores de transcripción.

Un procedimiento ChIP-Seq semiautomatizado para estudios epigenéticos a gran escala

ATAC-seq es un método de secuenciación de ADN que utiliza la transposasa mutante hiperactiva, Tn5, para mapear los cambios en la accesibilidad de la cromatina mediada por factores de transcripción. ATAC-seq permite el descubrimiento de los mecanismos moleculares subyacentes a las alteraciones fenotípicas en las células cancerosas. Este protocolo describe los procedimientos de optimización para ATAC-seq en tipos de células epiteliales, incluidas las células cancerosas.

Optimización ATAC-SEQ para la investigación epigenética del cáncer

La expresión génica está regulada por interacciones de promotores génicos con elementos reguladores distales. Aquí, describimos cómo la baja entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite la identificación de estas interacciones en tipos de células raras, que antes no se podían medir.

Un flujo de trabajo integrado para estudiar la arquitectura del genoma espacio-temporal centrada en el promotor en poblaciones celulares escasas

Se describe un protocolo optimizado de Cliavage Under Targets and Release Using Nuclease followed by next generation sequencing (CUT&amp;RUN-seq) para líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas neuroendocrinas. Permite el mapeo genómico de diversas modificaciones de histonas y sitios de unión a factores de transcripción (por ejemplo, E2F7) para investigar la desregulación epigenética y transcripcional en la patobiología de SCLC.

Mapeo genómico de modificaciones de histonas y sitios de unión a factores de transcripción en líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas neuroendocrinas utilizando CUT&amp;RUN

Aprende a identificar patrones de estados cromatínicos en tejidos tumorales mediante ChIP-seq de alto rendimiento. Este protocolo optimizado permite procesar múltiples modificaciones de histonas simultáneamente para investigar la epigenética del cáncer.

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Una plataforma integrada para la asignación de todo el genoma de cromatina Estados mediante secuenciación del ChIP de alto rendimiento en los tejidos del Tumor

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