Name: Modelos de ratón de la infección por Helicobacter y patologías gástricas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende a establecer modelos de infección por Helicobacter en ratones para estudiar patologías gástricas, inflamación y cáncer. Este método permite analizar cambios histopatológicos y desarrollar terapias.

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Los autores desean agradecer a la Sra. A. De Paoli y la Sra. Georgie Wray-McCann para asistencia técnica. Los autores reconocen el uso de las instalaciones y asistencia técnica de Monash plataforma de histología, Departamento de anatomía y Biología del desarrollo, Universidad de Monash. El laboratorio es apoyado por el financiamiento de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) a RLF (APP1079930, APP1107930). RLF es apoyado por una beca de investigación Senior de la NHMRC (APP1079904). KD y MC son apoyados por becas de postgrado de Monash. KD también es apoyado por el centro para la inmunidad innata y la infecciosa enfermedades, del Instituto Hudson de investigación médica, mientras que MC tiene una beca de Postgrado Internacional de la Facultad de medicina, enfermería y Ciencias de la salud, Universidad de Monash. Investigación en el Instituto de investigación médica de Hudson es apoyado por el programa de apoyo a infraestructura operacional del gobierno victoriano.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe el uso de un modelo de ratón en vivo para la infección por Helicobacter . Los pasos críticos del procedimiento son el: 1) preparación de los inóculos de Helicobacter que contiene bacterias viables y móviles; 2) la entrega de los números apropiados de bacterias para el ratón mediante sonda intragástrica; 3) detección de infección bacteriana por recuento de colonias o PCR; y 4) procesamiento de los tejidos gástricos para permitir la evaluación de la histopatología en infec...

Helicobacter pylori es un patógeno gástrico en forma de espiral, Gram-negativo, humano presente en todas las poblaciones en todo el mundo, con tasas de infección en países en desarrollo que se estima en el orden de 80%1. Aunque la mayoría H. pylori-individuos infectados son asintomáticos, algunos desarrollan enfermedades más severas, entre ulceración péptica y cáncer gástrico2. H. pylori-cánceres asociados ampliamente se caracterizan por la formación de tejidos linfoides extra nodales en el estómago, dando como resultado adenocarcinoma gástrico o asociado a mucosa linfoide o cambios malignos en las células epiteliales (GECs) linfoma de tejido (Malta), respectivamente. H. pylori está altamente adaptado para sobrevivir en el nicho ecológico áspero del estómago debido a la presencia de diversos factores de virulencia y mecanismos que facilitan su adherencia, el crecimiento y el metabolismo en este nicho. En particular, las cepas virulentas de H. pylori poseen el 40 kb cag isla de patogenicidad (cagPAI) que codifica aproximadamente 30 genes necesarios para la producción de un tipo 4 secreción sistema (T4SS)3,4 . CAG PAI-positivo las cepas de H. pylori se asociado con la inducción de niveles más altos de inflamación crónica en la hostia, que se ha implicado como un precursor esencial de adenocarcinoma gástrico5.
En vivo los modelos animales, especialmente ratones, han sido altamente informativos por permitiendo a los investigadores a investigar las contribuciones relativas de host, factores bacterianos y ambientales en la infección por H. pylori y enfermedad resultado6. Los estudios han demostrado previamente que prolongada H. pylori infección de ratones en los resultados de genética de C57BL/6 en el desarrollo de gastritis crónica y de las glándulas se atrofian, ambas características distintivas del H. pylori infección7. Además, la infección con la especie bacteriana relacionada canino/felino, H. felis, se ha demostrado para inducir la formación de Malta en ratones con patología similar y progresión de la enfermedad en humanos MALT linfoma8,9. Los más comúnmente utilizados de H. pylori aislado en los estudios de colonización de ratón es la "cepa 1 de Sydney" (SS1) cepa10, cagPAI+ pero una T4SS no funcional (T4SS−)11. Otras cepas usadas incluyen H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 y X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. Para las infecciones de H. felis , la cepa CS1 ("gato espiral 1, cagPAI–/T4SS−) es generalmente usado14.
Aquí proporcionamos un protocolo que describe la preparación de inóculos de Helicobacter infección en vivo , el procedimiento para sonda intragástrica de ratones, así como métodos para el procesamiento de tejidos para el estudio de los cambios histopatológicos en el estómago. En particular, este artículo se centrará en los métodos histológicos utilizados para visualizar la colonización bacteriana y evaluar cambios histopatológicos, incluyendo formación de Malta, en la mucosa gástrica de ratones infectados. Algunos de los métodos aquí descritos se pueden adaptadas al estudio de otros patógenos intestinales como S. Typhimurium o C. rodentium.

<table><tbody><tr><td><reactivos bacteriológicos fuertes></fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Agar Sangre Oxoide Base No.2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CM0271B</td><td>Disolver en agua desinonizada antes de la esterilización</td></tr><tr><td>Sangre de caballo desfibrinada de primera calidad</td><td>Biológicos éticos australianos</td><td>PDHB100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Brain Caldo de infusión de corazón</td><td>BD Bioscience</td><td>237500</td><td>Disolver en agua desinonizada antes de la esterilización</td></tr><tr><td>Paquetes de gas CampyGen</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CN0035A/CN0025A</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos histológicos</formol fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, tamponado neutro, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol absoluto, 100% desnaturalizado</td><td>ChemSupply</td><td>AL048-20L-P</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (2-propanol)</td><td>Merck</td><td>100995</td><td></td></tr><tr><td>Xileno (sin azufre)</td><td>ChemSupply</td><td>XT003-20L</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Hematoxilina</td><td>Amber</td><td>Scientific MH-1L</td><td>de</td>Mayer antes de usar</tr><tr><td>Eosina, Tinción acuosa</td><td>Ámbar Scientific</td><td>EOCA-1L</td><td>Filtro antes</td></tr><tr><td>de usar Wright-Giemsa Stain, modificado</td><td>Sigma Aldrich WG80-2.5L</td><td></td><td>Diluir antes de usar (20 % Giemsa, 80 % agua desionizada)</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Grale Scientific</td><td>11031/5</td><td></td></tr><tr><td>DPX medio de montaje</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos de biología molecular</td>Qubit dsDNA BR Kit de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ensayo Thermo</td><td>Fischer Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleótidos</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>La temperatura de recocido de los cebadores ureB utilizados en este estudio es de 61 &deg; El</td></tr><tr>kit<td>C GoTaq Flexi DNA Polymerasa</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>incluye 10x tampón PCR y dNTP de cloruro de magnesio</td></tr><tr><td></td><td>Bioline</td><td>BIO-39028</td><td>Diluir a 10 mM en agua estéril libre de nucleasas antes de usar</td></tr><tr><td>Agarosa de grado molecular</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de hidrógeno de sodio</td><td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td><td>A475-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesio Sulfato Heptahidratado</td><td>Chem-Supply</td><td>MA048-500G</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Antibióticos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vancomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2002-1G</td><td>Disolver en agua desionizada</td></tr><tr><td>Polimixina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4932-5MU</td><td>Disolver en agua desionizada</td></tr><tr><td>Trimetoprima (&ge; 98% HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7883</td><td>Disolver en etanol 100% (absoluto)</td></tr><tr><td>Anfotericina</td><td>Amresco (Astral Scientific)</td><td>E437-100MG</td><td>Disolver en agua desionizada</td></tr><tr><td>Bacitracina de Bacillus licheniformis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0125</td><td>Disolver en agua desionizada</td></tr><tr><td>Ácido naladíxico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878</td><td>Disolver en agua desionizada</td></tr><tr><td><fuerte>Otros reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metoxiflurano (Pentrhox)</td><td>Desarrollos Médicos Internacional</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Cera de parafina</td><td>Paraplast Plus, Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipos y artículos de plástico</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos anaeróbicos oxoides</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>HP0011/HP0031</td><td></td></tr><tr><td>COPAN Pasteur Pipetas</td><td>Interpath Services</td><td>200CS01</td><td></td></tr><tr>Centrífuga <td></td><td></td><td>Eppendorf 5810R</td><td>Recoja gránulos bacterianos por centrifugación a 2.200 rpm durante 10 minutos a 4 & grados; Aguja</td></tr><tr><td>deslizante de precisión C 23 g</td><td>BD Bioscience</td><td>301805</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis, VWR</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Portex tubo de polietileno de diámetro fino</td><td>Smiths Medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Catéteres de alimentación de plástico</td><td>Instech&nbsp; Laboratorios</td><td>FTP20-30</td><td></td></tr><tr><td>1 mL tuberculina luer slip jeringas desechables</td><td>BD Bioscience</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>Micromortero Eppendorf para tubos de 1,2 - 2 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z317314</td><td>Morteros de polipropileno esterilizables en autoclave utilizados para la homogeneización del estómago</td></tr><tr><td>Disociador GentleMACs</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Utilice un sistema preestablecido gentleMACS Programas para tejido estomacal de ratón</td></tr><tr><td>Tubos M (tapón naranja)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorímetro</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Bucle de plástico estéril</td><td>LabServ</td><td>LBSLP7202</td><td></td></tr><tr><td>Placa fría, Leica EG1160 Sistema de incrustación</td><td>Leica Biosystems</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de molde base Tissue-Tek, molde base 38 x 25 x 6</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4124</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Uni-Casette Tissue-Tek III</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo, Leica RM2235</td><td>Portaobjetos de vidrio Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Charged SuperFrost Plus</td><td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

modelos de ratón de la infección por helicobacter y patologías gástricas

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori es un patógeno gástrico que está presente en la mitad de la población mundial y es una causa significativa de morbilidad y mortalidad en los seres humanos. Varios modelos de ratón de la infección gástrica por Helicobacter se han desarrollado para estudiar los mecanismos moleculares y celulares por el H. pylori bacterias colonizan el estómago de los ejércitos humanos y causan enfermedad. Adjunto, describimos protocolos: 1) preparar suspensiones bacterianas de la infección en vivo de ratones mediante sonda intragástrica; 2) determinar los niveles de colonización bacteriana en el tejido gástrico de ratón, por reacción en cadena de polimerasa (PCR) y recuento de viables; y 3) evaluar los cambios patológicos, por la histología. Establecer Helicobacter infección en ratones, animales libres de patógenos específicos de (SPF) primero son inoculados con suspensiones (contiene ≥ 105 unidades formadoras de colonias, UFC) de cepas de ratón-colonización de o Helicobacter pylori o otros gástrico Helicobacter spp. de animales, tales como Helicobacter felis. En lo puntos apropiados del tiempo post-infección, estómagos son suprimidos y disecados sagittally en dos fragmentos de tejido iguales, cada uno compuesto por las regiones de antro y cuerpo. Uno de estos fragmentos entonces se utiliza para conteo de viables o la extracción de ADN, mientras que el otro se sujeta a procesamiento histológico. Colonización bacteriana y cambios histopatológicos en el estómago pueden evaluarse rutinariamente en secciones de tejido gástrico teñidas con tintes Warthin-Starry de tinción Giemsa o hematoxilina y eosina (H & E), según corresponda. Análisis inmunológicos adicionales también podrán ser efectuados por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia en secciones de tejido gástrico de ratón. Los protocolos se describen a continuación están diseñados para posibilitar la evaluación en los ratones de patologías gástricas en humanos relacionadas con H. pylori que se asemejan a las enfermedades, incluyendo inflamación, atrofia de la glándula y la formación del folículo linfoide. La preparación del inóculo y protocolos mediante sonda intragástrica también pueden ser adaptados para el estudio de la patogenia de otros patógenos entéricos humanos que colonizan ratones, tales como Salmonella Typhimurium o Citrobacter rodentium.

Este protocolo describe una técnica oral por sonda nasogástrica para lograr balon infección por H. pylori o H. felis en modelos de ratón murino (figura 1). Después de la eutanasia, estómagos se quitan, pesados y divididos en 2 mitades iguales formada por el antro, cuerpo y regiones no glandulares de los tejidos gástricos (figura 2). La región no glandular es eliminada antes de realizar cualquier análisis.
La coloniza...

Ratones representan un modelo inestimable en vivo para el estudio de la infección y las enfermedades causadas por microorganismos gastrointestinales. Aquí, describimos los métodos utilizados para estudiar la colonización bacteriana y cambios histopatológicos en modelos de ratón de Helicobacter pylori-relacionados con la enfermedad.

Modelos de ratón de la infección por Helicobacter y patologías gástricas

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la gastroenterología sobre el impacto de los miembros de la microbiota, específicamente los del género Helicobacter, en la inflamación y el cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la infección por Helicobacter y su impacto en el estómago en condiciones fisiológicas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de terapias para la prevención o eliminación de la infección por Helicobacter o sus consecuencias, incluyendo antibióticos, medicamentos o vacunas.Estos métodos proporcionan información específica para la patogénesis de la infección por Helicobacter. Sin embargo, varias de las técnicas pueden adaptarse al estudio de otros patógenos gastrointestinales. Generalmente, individuos nuevos en este método lucharán con la preparación de un inóculo bacteriano capaz de establecer una infección en ratones.Es imperativo que los aislados de Helicobacter sean cepas conocidas de colonización de ratón que no han sido sometidas a una extensa subcultura in vitro. Además, debe registrarse el número de subculturas in vitro para estas cepas. Agregue suspensiones bacterianas a tubos de poliestireno de 15 mililitros y utilice un bucle de plástico para transferir una gota de 10 a 20 microlitros de cada cultivo a diapositivas de microscopio de vidrio individuales.A continuación, evalúe la viabilidad y la motilidad de las bacterias bajo microscopía de contraste de fase a un aumento de 100 veces. Utilice únicamente el H.pylori inocula si la mayoría de las bacterias tienen una forma bacilar. H.felis inocula debe contener principalmente bacterias en forma helicoidal.Y cargue la inócula en jeringas individuales, desechables de un mililitro. Equipe cada jeringa con una aguja de calibre 23 y utilice una película de parafina de plástico para fijar un catéter de polietileno desechable a cada aguja. A continuación, retuvo manualmente un ratón libre de patógenos específicos de seis a ocho semanas de edad y sin helicobacter por el escrúpulo del cuello y la cola, e inserte un catéter en el centro de la mandíbula abierta.Guiar el catéter en un caudal hacia el esófago, extendiendo el cuello del ratón para permitir la facilidad de acceso al estómago a través del esófago y lejos de la tráquea hasta que la mayor parte o todo el catéter ya no sea visible y se sienta una resistencia. Luego, entrega al menos una vez 10 a la quinta bacteria para asegurar una colonización óptima y patología de la enfermedad. Al final del experimento, usa tijeras finas y curvas para abrir la cavidad abdominal para la escisión del estómago.Corte el estómago a lo largo de la mayor curvatura, y lave suavemente el órgano dos veces en un tubo de 50 mililitros de PBS fresco por lavado para eliminar cualquier alimento residual. Después del segundo lavado, coloque el tejido en una placa de plástico Petri de seis centímetros para registrar el peso húmedo. Después de aplanar el estómago, bisect la muestra sagittally en dos fragmentos de tejido igual que comprenden el antrum, cuerpo, y regiones de bosque no glandular.Retire la región no glandular y pese la mitad de cada estómago antes de almacenar el trozo de tejido en la solución adecuada para el análisis descendente planificado. Agregue la otra mitad del tejido estomacal a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10%formalina, aplanando los tejidos contra los lados superiores de los tubos después de 10 segundos. Cuando los tejidos se hayan colocado en las paredes del tubo, vuelva a sumergir las muestras en el formol durante al menos 24 horas.Para contar el número de H.pylori viables en el estómago después de la infección, homogeneizar muestras de estómago almacenadas en BHI, y realizar diluciones en serie duplicadas de los homogeneatos gástricos resultantes en caldo fresco y estéril. Divida el agar de sangre de caballo preseleccionado, o HBA, las placas suplementadas con antibióticos adicionales en tres o cuatro segmentos, y, utilizando una adaptación de la técnica Miles y Misra, agregue de 10 a 100 microlitros de cada dilución homogeneizada estomacal en un segmento de cada placa de agar. Esparce los homogeneizas con bucles estériles de plástico y deja que las placas se sequen.A continuación, coloque las placas en una posición invertida en frascos de gas anaerobe que contengan un plato de agua Petri y un paquete de gas. Luego, incuba los frascos a 37 grados centígrados durante cuatro a siete días. Cuando se pueden observar colonias, enumere los segmentos que contienen entre 10 y 100 colonias aisladas.Después de la eutanasia, el estómago se cosecha de los animales y se pesa. Se extirpa la región no glandular, y el estómago se divide en dos mitades iguales que comprenden el antrum y el cuerpo. La colonización exitosa se confirma típicamente mediante la realización de un conteo viable y la posterior enumeración de colonias individuales de homogeneizaciones gástricas rayadas en placas de HBA.Tenga en cuenta que la presencia de bacterias contaminantes de la microbiota gástrica del ratón o un gran número de colonias de H.pylori puede complicar la enumeración de las UFC H.pylori. Alternativamente, se puede emplear pcR para verificar la infección utilizando imprimaciones validadas específicas dirigidas a una región de par de 325 bases de los genes H.felis y H.pylori ureB. En este experimento representativo, los ratones C57 Black-6 de tipo salvaje mostraron signos moderados de inflamación, incluyendo hiperplasia y atrofia de la glándula a los seis meses después de la infección con H.felis, así como la infiltración celular de la submucosa.Se observa una inflamación más grave en ratones knockout al mismo tiempo, con la presencia adicional de folículos linfoides observada cerca de los infiltrados celulares. Las bacterias H.felis también se pueden visualizar en secciones teñidas de Giemsa del tejido estomacal del ratón infectado. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la PCR cuantitativa, la inmunohistoquímica o la inmunofluorescencia para responder preguntas adicionales sobre los tipos de respuestas del huésped inducidas durante la infección por Helicobacter.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología y la gastroenterología exploraran el papel causal de Helicobacter pylori en la enfermedad estomacal en los seres humanos. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo infectar reproduciblemente ratones con especies de Helicobacter y para estudiar la patología asociada con la infección. No olvide que las cepas de Helicobacter utilizadas en este protocolo son infecciosas, y por lo tanto los procedimientos estándar de bioseguridad siempre deben seguirse mientras se trabaja con estas bacterias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video demuestra el establecimiento de la infección por Helicobacter pylori a través de la técnica de sonda nasogástrica intragástrica en un modelo de ratón. La suspensión bacteriana se administra a través de un catéter que se inserta a través de la boca hasta el estómago. Las bacterias inoculadas colonizan y establecen una infección en el estómago, que se puede utilizar para estudiar la interacción huésped-patógeno.

Una técnica de sonda nasogástrica intragástrica para controlar la infección por Helicobacter en ratones

En este video, describimos un protocolo para cuantificar la carga de Helicobacter pylori en tejidos estomacales de ratones después de la infección para confirmar su colonización.

Cuantificación de la carga de Helicobacter pylori en el estómago de un ratón infectado

Este video muestra un método para establecer un modelo de infección por organoides gástricos mediante la microinyección del patógeno gástrico Helicobacter pylori en la luz de los organoides. Este modelo ayuda a estudiar los cambios inducidos por infecciones en las células gástricas.

Establecimiento de un modelo de infección mediante microinyección de organoides gástricos con bacterias patógenas

Aquí describimos un método para visualizar el orgánulo bacteriano oncogénico conocido como el Sistema de Secreción Cag Tipo IV (Cag-T4SS).  Encontramos que el Cag-T4SS se produce diferencialmente en la superficie de H. pylori en respuesta a diferentes condiciones de disponibilidad de hierro.

Microscopía Electrónica de Alta Resolución de la Helicobacter pylori Cag secreción tipo IV Sistema Pili Producido en condiciones variables de Hierro disponibilidad

Este artículo demuestra procedimientos quirúrgicos de reflujo gastroesofágico con ratones. Estos modelos son herramientas útiles para la investigación sobre los mecanismos y el tratamiento de la enfermedad por reflujo gastroesofágico y potencialmente el esófago de Barrett y el adenocarcinoma de esófago.

Modelos quirúrgicos de reflujo gastroesofágico con ratones

Los cultivos derivados de células madre albergan un tremendo potencial para modelar enfermedades infecciosas. Aquí se describe el cultivo de organoides gástricos de ratón y humanos derivados de células madre adultas. Los organoides se microinyectan con el patógeno gástrico Helicobacter pylori.

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Cultura de monocapa epitelial gástrico primario derivadas de ratón y humanos para el estudio de la regeneración

En este trabajo se realizó una evaluación sistemática de los pacientes diagnosticados de neoplasia intraepitelial gástrica de bajo grado mediante biopsia endoscópica previa y se obtuvo un diagnóstico anatomopatológico mediante resección completa de la lesión mediante disección endoscópica de la submucosa (DSE), analizando los factores que potencialmente aumentan el riesgo de escalada patológica.

Establecimiento y evaluación de un modelo de predicción de riesgo para el escalamiento patológico de la neoplasia intraepitelial gástrica de bajo grado

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Modelos de ratón de la infección por Helicobacter y patologías gástricas

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