Purificación de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado de ratón de perfusión

El objetivo general de este procedimiento es realizar una perfusión exitosa de hígado de ratón para facilitar la purificación de poblaciones específicas de células hepáticas de interés. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la hepatología sobre cómo ayudar a las funciones de poblaciones específicas de células hepáticas dentro de ensayos in vitro o in vivo. La principal ventaja de esta técnica es la alta cantidad de hepatocitos en las células endoteliales sinusoidales que se pueden obtener de cada hígado.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que es esencial ver el color y la forma de un hígado digerido de manera óptima para preservar la viabilidad celular. Para colocar el catéter de vena porta, primero use la parte posterior de una pinza para mover los intestinos hacia el lado derecho de la cavidad abdominal del ratón, exponiendo la vena porta, y use pinzas curvas para deslizar una pieza de hilo de coser de poliéster de 20 centímetros debajo de la vena porta entre el hígado y la vena duodenal pancreática superior. Use las pinzas para tirar con cuidado del hilo hacia el otro lado del animal, de modo que quede centrado debajo de la vena porta.

Y ata un nudo suelto alrededor de la vena porta. Coloque las pinzas curvas debajo de la vena y tire suavemente de todo el material de tejido hacia la cola para enderezar la vena. A continuación, coloque el bisel de la aguja de un catéter hacia arriba y paralelo a la parte inferior de la vena porta cerca de las pinzas, y perfore suavemente la vena con la aguja.

Cuando el bisel esté en el lumen de la vena, retraiga la aguja accionada por resorte y continúe empujando el catéter palmer a través de la vena, hasta que el bisel esté cerca del área ramificada de la venus. Después de asegurar el nudo alrededor del catéter, ajuste inmediatamente la bomba peristáltica a cuatro milímetros por minuto y conecte el extremo macho del tubo al extremo hembra del catéter, momento en el que debería comenzar a ver la rama del hígado. Cortar la aorta abdominal para el drenaje.

Use cinta adhesiva para inmovilizar el tubo en la almohadilla inferior. Utilice las tijeras para cortar la piel abdominal verticalmente, para permitir el drenaje de la sangre y el líquido de perfusión. A continuación, exprima el vaso sanguíneo efluente unas cuantas veces con las pinzas rectas para inflar el hígado, asegurándose de que toda la sangre se haya drenado, y perfunda el hígado con PBS hasta que el tejido hepático se blanquee.

Para recolectar los hepatocitos, primero cambie el tubo de salida del matraz de un litro de PBS a un matraz de 125 mililitros, que contenga tampón dos, suplementado con colagenasa-4. Cuando la colagenasa llegue al hígado, apriete breve pero firmemente el vaso sanguíneo efluente para aumentar la presión y permitir que el tampón de digestión llene todos los lóbulos del hígado. Libere el vaso antes de que el tampón rompa a través del tejido conectivo que rodea el hígado.

Y permita que el tampón se filtre a través del hígado hasta que todo el volumen haya fluido a través del tejido. A continuación, coloque un plato de cristalización que contenga 10 mililitros de tampón junto al ratón, y use pinzas rectas y tijeras para transferir el hígado al plato. Transfiera la placa a una campana de cultivo de tejidos estéril y, utilizando una técnica estéril, agarre el hígado para despegar la cápsula.

Agite suavemente las células del tejido hepático y vierta la solución celular resultante a través de un filtro de 100 micras en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, enjuague los restos de hígado del filtro con más tampón. Cuando el hígado parezca estar desprovisto de células, cuele el filtrado extraído a través de un filtro de 40 micras en un segundo tubo de 50 mililitros y recoja las células por centrifugación.

Vierta la célula no parenquimatosa y el hepatocito muerto que contiene sobrenadante en un nuevo tubo de 50 mililitros sobre hielo con un solo movimiento, para preservar el gránulo y vuelva a suspender el gránulo en 40 mililitros de tampón fresco para la siguiente centrifugación. Para aislar las células endoteliales sinusoidales, centrifugar los sobrenadantes que contienen células no parenquimatosas. Coloque las suspensiones de celdas en un solo tubo cónico nuevo de 50 mililitros y aumente el volumen total a 35 mililitros.

Recoja las células extraídas por centrifugación y use una pipeta de 25 mililitros para transferir cuidadosamente los 25 mililitros superiores de la célula no parenquimal que contiene sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros en hielo. Agregue 25 mililitros de medio fresco al tubo y vuelva a suspender el pellet para una segunda centrifugación y eliminación del sobrenadante. A continuación, centrifugar el sobrenadante y añadir 15 mililitros de una solución de Percoll al 50% en un nuevo tubo de 50 mililitros.

Usando un pipeteador ajustado a la velocidad de expulsión más baja, superponga 20 mililitros de Percoll al 25% sobre la solución de Percoll al 50% y vuelva a suspender las células no parenquimatosas en un medio de 10 mililitros de cuatro grados Celsius. Coloque cuidadosamente las células en capas sobre la solución de Percoll. Y separar las células por centrifugación en gradiente de densidad.

A continuación, aspire los primeros 30 mililitros de solución y utilice una pipeta de transferencia de plástico de cinco mililitros para recoger las células endoteliales sinusoidales y de Kupffer situadas en la interfase de la solución con gradiente de densidad del 25 al 50% en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Lave las celdas con 50 mililitros de medio y vuelva a suspender el pellet mientras enjuaga los lados del fondo del tubo con 12 mililitros de medio tibio. Para separar las células endoteliales sinusoidales de las células de Kupffer, transfiera la suspensión celular a una placa de Petri de poliestireno en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada durante ocho minutos.

Al final de la incubación, use una pipeta de 25 mililitros para aspirar el sobrenadante y use el sobrenadante para enjuagar el plato con la pipeta configurada a la velocidad más baja para recolectar las células endoteliales sinusoidales restantes. Luego, transfiera las células endoteliales sinusoidales a un nuevo tubo de 50 mililitros. A continuación, recoja las células por centrifugación para su resuspensión y siembra en placas de cultivo celular recubiertas de colágeno.

La microscopía electrónica de barrido de un hígado de ratón después de la perfusión infixitiva de PBS de una manera similar a la que se acaba de demostrar, revela una visión clara de la microanatomía del hígado y de las microvellosidades entre los hepatocitos. Los hepatocitos recolectados durante los centrifugados a baja velocidad al principio del procedimiento, demuestran una alta pureza después de cuatro lavados en tampones que contienen albúmina de suero bovino. La separación de las células endoteliales sinusoidales mediante la adhesión selectiva en una placa de Petri de poliestireno recubierta de colágeno da como resultado una pureza del 83 al 90% que depende en gran medida de la eficacia general de la digestión de la colagenasa.

Las mediciones cuantitativas utilizando microscopía óptica de un procedimiento de separación representativo, como se acaba de demostrar, revelan resultados de aislamiento típicos de una población de hepatocitos casi 100% pura. Y una población de poco más del 89% de células endoteliales sinusoidales puras. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo catetizar una vena porta de ratón y de cómo purificar tanto los hepatocitos como las células endoteliales sinusoidales del hígado de ratón.

Este procedimiento también se puede utilizar para purificar células satélite de la fracción no parenquimatosa después del aislamiento de hepatocitos utilizando diferentes gradientes de densidad y velocidades de centrifugación.