Ingeniería 'Oro' de la fluorescencia por presión selectiva incorporación de aminoácidos no canónica y análisis de proteínas por espectrometría de masas y la fluorescencia

El objetivo de este experimento es reemplazar un aminoácido canónico por un aminoácido no canónico para la producción de proteínas recombinantes mediante la incorporación selectiva a presión para producir la nueva proteína fluorescente de oro. El método de incorporación selectiva a presión está destinado a producir proteínas con características químicas novedosas. Esto es especialmente útil cuando se intenta comprender o diseñar la función de las proteínas.

La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente sencilla de llevar a cabo porque es similar a la producción común de proteínas recombinantes. La fluorescencia correlacionada con el tiempo y la longitud de onda es útil para investigar la dinámica del estado excitado de la proteína modificada, lo que a su vez facilita la comprensión de la influencia del aminoácido no canónico introducido en el cromóforo en las propiedades ópticas. En principio, el SPI puede aplicarse a cualquier entorno de producción de proteínas para el que se disponga de cepas auxotróficas y medios químicamente definidos.

Esto incluye otras cepas bacterianas y también el cultivo de células de mamíferos. El momento y la configuración de las condiciones de expresión son críticos, ya que es obligatorio suprimir la producción de la proteína de tipo salvaje no modificada. Es por eso que es necesario optimizar ciertos parámetros como la temperatura, el tiempo de inducción o la composición del medio de cultivo.

Primero tuvimos la idea de este método después de estudios iniciales de extracto de proteínas con aminoácidos que contienen metilo como la selenometionina. El demostrador del procedimiento será Almut Pelzer, un estudiante de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, transforme las células de E. coli auxótrofa de triptófano con el plásmido de expresión para ECFP.

Utilice una sola colonia para inocular un precultivo de cinco mililitros de medio LB suplementado con ampicilina en un tubo de cultivo. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 200 rpm. Al día siguiente, inocule 100 mililitros de medio NMM19 suplementado utilizando un mililitro del cultivo nocturno en un matraz Erlenmeyer de un litro.

Luego, incubar el cultivo durante la noche en un agitador orbital a 200 rpm y 30 grados Celsius. Al día siguiente, mida la densidad óptica a 600 nanómetros cada 30 minutos hasta que el valor cambie en menos de 0,05 durante 30 minutos. A continuación, centrifugar el cultivo a 5.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos para recolectar las células bacterianas.

Deseche el sobrenadante por decantación. Resuspender las células en medio NMM19 suplementado con ampicilina hasta un volumen total de 100 mililitros. Transfiera esta suspensión nuevamente al mismo matraz Erlenmeyer.

Agregue 4-amino-indol a una concentración final de un milimolar. Incubar en un agitador orbital durante 30 minutos a 30 grados centígrados y 200 rpm. Después de 30 minutos, agregue IPTG al cultivo hasta una concentración final de 0,5 milimolar para inducir la expresión del gen diana.

Incubar durante la noche en un agitador orbital a 30 grados centígrados y 200 rpm. Al día siguiente, recoja las células bacterianas centrifugando a 5.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante por decantación.

Congele el pellet celular a menos 20 grados Celsius o menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para realizar la purificación de proteínas objetivo. Primero, prepare el lisado de células bacterianas como se describe en el protocolo de texto. Después de preparar la columna de cromatografía de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilice un tampón de unión para equilibrar la columna de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados.

Cargue el lisado en la columna hasta su finalización. Observe la proteína de color dorado unida a la resina de cromatografía. Lave la columna con tampón de encuadernación.

A continuación, eluir la proteína objetivo utilizando el tampón de elución. Recoja y agrupe cualquier fracción eluida que contenga proteína fluorescente de oro, que se puede identificar por el color dorado visible. Después de esto, prepare una membrana de diálisis con un límite de peso molecular entre 5.000 y 10.000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Diálisis una muestra de un mililitro contra al menos 100 mililitros de tampón durante un mínimo de dos horas. Para empezar, utilice el tampón MS para diluir la muestra de proteína a 0,1 miligramos por mililitro, de modo que el volumen final sea de 80 microlitros. Pipetear con cuidado para mezclar.

Transfiera la solución a un vial de muestreador automático MS con inserto de vidrio y ciérrelo con una tapa. Agite el vial para eliminar las burbujas de aire. A continuación, prepare un blanco que contenga tampón MS en un segundo vial.

Coloque ambos viales en el muestreador automático de HPLC. Después de esto, prepare y calibre el instrumento MS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Establezca el volumen de inyección del muestreador automático en cinco microlitros para la cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada al método de espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización por electrospray.

Cree una lista de trabajo para la ejecución en blanco, seguida de la ejecución de ejemplo de GdFP. Asigne el volumen de inyección, las posiciones correspondientes de los viales del muestreador automático y ejecute la lista de trabajo. Para comenzar, prepare una solución de proteína fluorescente de oro y el detector para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo y la longitud de onda, como se describe en el protocolo de texto.

Usando un software de conteo de fotones individuales, adquiera la emisión de fluorescencia a una tasa de conteo de aproximadamente 200,000 fotones por segundo hasta que se acumulen aproximadamente 10,000 recuentos en el máximo de adquisición de las curvas de decaimiento de fluorescencia. Después de esto, reemplace la cubeta de muestra con una cubeta de cuarzo de un centímetro llena de sílice coloidal en tampón PBS. Saque el filtro láser y ajuste la rejilla para la adquisición de fotones de 470 nanómetros en el canal central del detector.

Luego, adquieren la función de respuesta instrumental hasta que se acumulan aproximadamente 10.000 recuentos en el máximo de emisión. Convierta, ajuste y trace los datos resultantes como se describe en el protocolo de texto para obtener los espectros asociados a la desintegración, que representan la dependencia de los tiempos de decaimiento de la fluorescencia en la longitud de onda de la emisión. En este estudio, se utiliza la espectrometría de masas para confirmar que la variante de fluoróforo de tipo proteína fluorescente verde desplazada espectralmente al rojo, denominada proteína fluorescente de oro, se produce con éxito.

Mientras que el ECFP de tipo salvaje tiene una masa proteica calculada de 28.283,9 daltons después de la maduración del cromóforo, la masa correspondiente de la proteína fluorescente de oro es de 28.313,9 daltons. El espectro ESI-MS deconvoneado de la proteína fluorescente de oro exhibe un pico de masa principal de aproximadamente 28.314,1 daltons, desviándose del valor teórico en menos de 10 partes por millón. Esto confirma la incorporación del aminoácido no canónico por incorporación selectiva a presión.

El espectro de absorción de ECFP tiene dos máximos característicos a 434 nanómetros y 452 nanómetros. Por el contrario, la proteína fluorescente de oro se caracteriza por una amplia banda de absorción desplazada al rojo con un máximo de 466 nanómetros. Mientras que el máximo de absorción de EGFP se desplaza aún más hacia el rojo a 488 nanómetros, el espectro de emisión de fluorescencia de la proteína fluorescente de oro y el correspondiente desplazamiento de Stokes de GdFP significa que es el más desplazado al rojo de todos los derivados de la proteína fluorescente verde Aequorea victoria.

Aquí se muestra la emisión de fluorescencia resuelta en el tiempo monitoreada por el conteo de un solo fotón. Las curvas de decaimiento exhiben un decaimiento de fluorescencia ligeramente más rápido a 600 nanómetros que a 550 nanómetros. La emisión de fluorescencia de la proteína fluorescente de oro depende en gran medida del pH, como es típico de muchas variantes de proteínas fluorescentes verdes.

Como se ve aquí, hay una clara disminución de la fluorescencia a un pH más bajo, aunque las características espectrales permanecen constantes. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días a partir de colonias de células bacterianas transformadas o de reservas de glicerol congeladas. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que el aminoácido objetivo se agote.

El ncAA debe ser absorbido por la célula, biocompatible, e incorporado a las proteínas por la cepa auxotrófica elegida. Siguiendo este procedimiento, se puede generar una gran variedad de proteínas con fines de ingeniería. Dependiendo de la proteína objetivo, se pueden utilizar métodos como los analizadores de estabilidad de proteínas, los ensayos de actividad enzimática, la espectroscopia de fluorescencia o la cristalización de proteínas, para describir la influencia del aminoácido no canónico en las propiedades funcionales y estructurales.

Tras su desarrollo, esta técnica demostró ser muy útil en el campo de la biología sintética, dotándola de proteínas y proteomas nuevos para la naturaleza. Esto amplía las capacidades químicas para la ingeniería de proteínas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo incorporar aminoácidos no canónicos en proteínas recombinantes mediante la incorporación selectiva de presión, cómo verificar la introducción de un aminoácido artificial mediante espectrometría de masas y cómo analizar una proteína fluorescente mediante fluorescencia resuelta en el tiempo.