Name: Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Aprende a producir y purificar baculovirus mediante cromatografía de afinidad con heparina y ultracentrifugación para aplicaciones de terapia génica. Este método elimina contaminantes celulares y mejora la seguridad del vector viral.

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Este trabajo es apoyado en parte por la financiación de puesta en marcha de Fundación de investigación de niños de Cincinnati (CCPR) M.N. y el innovador núcleo Grant (ICG) apoyado por el centro nacional para avanzar las Ciencias traslacional de los institutos nacionales de salud en Premio número UL1 TR001425. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Vea la figura 1 para una ilustración que resume el protocolo.
1. purificación de ADN de plásmido de Baculovirus
<ol><li>Crece cultivo bacteriano que contiene baculovirales plásmido ADN (bacmid)14 en 200 mL de LB caldo con antibióticos; kanamicina (50 μg/mL), tetraciclina (10 μg/mL) y gentamicina (7 μg/mL), de 16 h a 37 ° C en un entorno de Agitador orbital a 300 rpm.</li>
	<li>Purificar el bacmid ADN de la cultura bacteriana con lisis alcalina estándar protocolo15y disolver el bacmid en solución tampón TE.</li>
</ol>2. producción de Baculovirus
<ol><li>Células Sf9 en cultivo en un Incubador agitador orbital 135 rpm y 28 ° C en un matraz Erlenmeyer que contenga medio de cultivo libre de suero insectos1,2,3de policarbonato. Nota: Si las células Sf9 son descongeladas en stock congelado, deje al menos dos semanas para que las células para recuperarse y entrar en la fase exponencial de crecimiento.</li>
	<li>Contar las células Sf9 cosechadas en fase exponencial de crecimiento con un hemocitómetro después de la tinción con azul de tripano. Semilla 1 x 106 Sf9 células viables por pozo en una placa de cultivo de tejidos tratados 6 bien en 2 mL de medio. Permite a la célula unir por 1 h a 28 ° C en una incubadora.</li>
	<li>Reemplazar el medio de cultivo con 1 mL insectos de suero sin suplemento Grace medio de cultivo.</li>
	<li>Transfectar bacmid ADN en las células Sf9 con el reactivo de transfección de células de insecto.<ol>
<li>Mezcla 8 μl célula insectos transfección de reactivo con 100 μl de medio de insecto de gracia.</li>
		<li>Diluir 2 μg de bacmid ADN en 100 μl de medio sin suplemento de insectos y mezcle suavemente con un vórtex.</li>
		<li>Combinar el ADN diluido con el reactivo de transfección de células de insecto diluido y mezclar suavemente. Incubar durante 15 a 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Añadir la mezcla de ADN de lípidos gota a gota en las células. Incubar a 28 ° C en una incubadora durante aproximadamente 5 horas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire la mezcla de la transfección de las células y lavan las células con 2 mL de PBS.</li>
	<li>Añadir 2 mL de medio de cultivo de insectos y continuar a la cultura a 28 ° C en una incubadora sin cambiar los medios de comunicación. Nota: Si el bacmid contiene una proteína fluorescente, su expresión se puede detectar en la transfección de células 48 h. Baculovirus es producida por células Sf9 transfected y secretan en el medio de cultivo que posteriormente infecta a las células untransfected. La población de toda la célula se infecta con baculovirus en 5 días y muestra signos de infección viral, también llamado efecto citopático. Estos incluyen diámetro creciente de la célula, las vacuolas/gránulos en el citoplasma, cesación del crecimiento celular y las células muertas o sometidas a lisis están presentes en cultivo celular. Sin embargo, si la eficiencia de la transfección o infección no es óptima, la cultura no puede mostrar un evidente efecto citopático. El efecto citopático puede visualizarse con un microscopio invertido de fase con aumentos de 200-400. Baculovirus infectadas células pueden detectarse mediante tinción con anticuerpos de anti-gp6411.</li>
	<li>La cosecha baculovirus sobrenadante 5 días después de transfección y la etiqueta como la acción de virus P1 .</li>
	<li>Guarde el sobrenadante, baculovirus que es sensible a la luz, en la oscuridad con 0.5% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. Almacenar a 4 ° C para el corto plazo (hasta 90 días) o a-80 ° C a largo plazo.</li>
	<li>Semillas 6 × 106 Sf9 células en una placa de cultivo de tejidos tratados 10 cm en 10 mL de medio de cultivo de insectos. Añadir 1 mL de sobrenadante de baculovirus inicial (P1) a las células.</li>
	<li>Sobrenadante de baculovirus (P2) en post-infección 5 demayo día de la cosecha.</li>
	<li>Semilla de 50 mL de células Sf9 (3 x 106 células/mL) en cultivo de suspensión en medio de cultivo insectos en un policarbonato de 250 mL matraz Erlenmeyer y coloque el frasco en un Incubador agitador orbital. Añadir 2 mL de stock de2 P a las células y agitar a 135 rpm manteniendo una temperatura constante de 28 ° C. Nota: Tres o cuatro días después de la infección, toda la población de células Sf9 mostrará efecto citopático, que es una indicación de la producción del alto-título baculovirus.</li>
	<li>Ampliar secuencialmente los sobrenadantes de baculovirus hasta obtener el volumen deseado (P3, P4,...) mediante el aumento de 10 a 50-fold volumen de cultivo de células en cada infección subsecuente. Nota: P3 es el 3rd ronda de infección en que 500 mL a 1 L de Sf9 cultivos celulares pueden ser infectados con 10 a 20 mL de P2 baculovirus sobrenadante; P4 es 4th alrededor de la infección en que 5 a 10 L de Sf9 cultivos celulares pueden ser infectados con 100 a 200 mL de sobrenadante de baculovirus P3 y así sucesivamente. Por lo general, se siembran las células Sf9 en 3 × 106 células/mL en medios de cultivo libre de suero insectos.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante a 1.000 x g durante 30 min a 4 ° C para eliminar los residuos celulares y tratar el baculovirus sobrenadante con 50 nucleasa unidades/mL (250 unidades/μl de caldo) por 2 h a 37 ° C para digerir el ADN y el ARN genómico de baculovirus. Filtrar el sobrenadante a través de una unidad de filtración de 0.45 μm.</li>
</ol>3. preparación del sistema de cromatografía de
<ol><li>Preparar el sistema de cromatografía de enjuague secuencialmente las muestra y tampón líneas cada uno con 1 N hidróxido de sodio en agua estéril, agua y lavar tampón (tampón de fosfato de sodio 20 mM que contienen cloruro de sodio 150 mM, pH 7.0) a una velocidad de flujo lineal de 50 mL/min.</li>
	<li>Preparar una columna de μm de heparina 50 (10 × 10 cm, 7,9 mL de volumen (CV) de la columna) ejecutando secuencialmente columna limpieza de tampón (5 CV estéril 20 mM sodio fosfato buffer que contiene cloruro de sodio del de 2 M, pH 7.0) y tampón de lavado de 5 CV a un flujo lineal de 7 mL/min.</li>
</ol>4. purificación del Vector de Baculovirus
<ol><li>Configurar el sistema de cromatografía como sigue:<ol>
<li>Utilizar la muestra de carga del puerto de entrada para cargar el baculovirus sobrenadante.</li>
		<li>Utilizar el puerto de entrada de buffer A1 para cargar el tampón de lavado. Preparar una botella con al menos 500 mL de tampón de lavado y colocar la línea de tampón de lavado en la botella.</li>
		<li>Utilice el puerto de entrada de buffer A2 para cargar el buffer de elución (20 mM fosfato de sodio con cloruro de sodio de 1,5 M, pH 8.0). Preparar una botella con al menos 500 mL de tampón de elución y colocar la línea de tampón de elución en la botella.</li>
		<li>Inserte varios tubos cónicos de 50 mL en el colector de fracciones para recoger la columna paso baculovirus sobrenadante, el tampón de lavado y el baculovirus eluídas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Equilibrar la columna de heparina con cinco volúmenes de columna de 7,9 mL (CVs) de tampón de lavado (40 mL) a un flujo lineal de 7.0 mL/min.</li>
	<li>Carga de 250 mL de sobrenadante a la columna de heparina utilizando la bomba de la muestra (puerto de entrada de la muestra) del sistema de cromatografía a un flujo lineal de 2,0 mL/min de baculovirus.</li>
	<li>Ejecutar 10 CVs (80 mL) de tampón de lavado a través de la columna de la heparina en un flujo lineal de 2,0 mL/min hasta la curva de absorbancia (UV) ultravioleta (280 nm) ha vuelto a la línea de base y se convierte en estable.</li>
	<li>Eluir las partículas de baculovirus de la columna de 7,9 mL heparina con 5 CVs (40 mL) de tampón de elución a un flujo lineal de 4,0 mL/min de reloj para un pico agudo de elución de la proteína en el cromatograma cuando las partículas de baculovirus disocian de la columna de la heparina.</li>
	<li>La elución, diluir inmediatamente el sobrenadante de baculovirus eluídas 10 veces usando 20 mM de tampón fosfato de sodio en agua para evitar la inactivación de baculovirus partículas de choque osmótico durante la centrifugación posterior.</li>
	<li>Almacenar 100 μl de cada una de las fracciones, incluyendo la columna paso recogido durante la carga del sobrenadante de baculovirus, el tampón de lavado y el efluente. Infectar a estas fracciones de baculovirus a HT1080 para evaluar el proceso de purificación (véase sección 6).</li>
	<li>Limpiar la columna con tampón y tampón de lavado de limpieza de la columna. Por último, enjuagar la columna con 5 CV estéril 20% de etanol en agua a una velocidad de flujo lineal de 7.0 mL/min y almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Limpiar el sistema de cromatografía con agua, hidróxido de sodio 1 N, otra vez con agua y 20% de etanol en agua a una velocidad de flujo lineal de 50,0 mL/min y almacenar el sistema en 20% de etanol.</li>
</ol>5. concentración de Baculovirus
<ol><li>Pre esterilizar con autoclave los tubos de centrífuga. Añadir un volumen igual de sobrenadante de baculovirus en cada tubos de ultracentrífuga en una campana de cultivo de tejidos. Medir el peso del tubo por un equilibrio y ajuste el peso del contenido de los tubos de la ultracentrífuga con PBS estéril.</li>
	<li>Coloque cada uno de los tubos de la ultracentrífuga oponerse a cubo del rotor SW 32 Ti.</li>
	<li>Corren la ultracentrífuga de 80.000 g × 90 min a 4 ° C.</li>
	<li>Abrir los tubos de la ultracentrífuga en una campana de cultivo de tejidos y aspirar asépticamente el líquido sin la eliminación de la pelotilla de baculovirus.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de cada tubo mediante pipeteo vigorosamente hacia arriba y hacia abajo con 200 μL de PBS con 0,5% BSA (w/vol).</li>
	<li>Transferir el baculovirus concentrado para crioviales (50 a 100 μl por vial) y almacenar a-80 ° C.</li>
</ol>6. valoración de Baculovirus
<ol><li>El día antes de la infección, contar las células HT1080 usando un hemocitómetro después de la tinción las células con Trypan blue. 1 x 105 HT1080 células por pocillo en una placa de 6 pozos en 2 mL de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) de la semilla. Semillas varios pozos adicionales para poder determinar el número exacto de células presentes en el momento de la infección. Cultura de las células en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2. Nota: Las células HT1080 se utilizan para la valoración como expresan un mayor nivel de heparán sulfato en comparación con la otra célula líneas16. Puesto que las células HT1080 son adherentes, titulación es más simple y menos desperdiciador de tiempo en comparación con usando la tradicional valoración basada en Sf9.</li>
	<li>En el día de la infección, determinar el número de células por pocillo contando las células de los pozos. Infectar a las células mediante la adición de los baculovirus original diluida que había sido destinado antes de purificación de la columna y con muestras de la columna fluir-por, lavado y elución fracciones. Para cada muestra, determinar la dilución y el volumen basado empíricamente en las partículas infecciosas de baculovirus e infectar a cada pocillo por triplicado.</li>
	<li>Dos días después de la infección, analizar las células para la expresión del gen de interés. Las células pueden ser analizadas utilizando un citómetro de flujo si expresan una proteína fluorescente (e.g. GFP)17.</li>
	<li>Calcular los títulos (unidad de infecciosa por mL) basados en el número de células presentes en el momento de la infección, el factor de dilución y porcentajes de proteínas fluorescentes en las células usando la fórmula: (número de células durante el porcentaje de infección × de proteína fluorescente factor de dilución de las células positivas x) / volumen de baculovirus en mL. Nota: Por ejemplo, si el número total de células por pocillo en el momento de la infección es de 1,2 × 105, el porcentaje de proteína fluorescente es 5%, el factor de dilución es 100 y el volumen de baculovirus diluida añadir es de 10 μl, el título es 6 x 107 unidades infecciosas (IU) / ml.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

El protocolo que presentamos describe la producción de baculovirus en células Sf9 en cultura de suspensión y purificación de baculovirus mediante una cromatografía de afinidad de heparina. Los parámetros utilizados en el presente Protocolo maximizan el rendimiento y minimizan la inactivación de baculovirus infecciosas. El protocolo que aquí se muestra que una recuperación significativamente mayor de partículas de baculovirus en comparación con recuperaciones alcanzada por otros9.
<p class="jov...

Baculovirus se utiliza principalmente para la producción de proteínas recombinantes y vacunas en lepidópteros Spodoptera fugiperda (Sf) 9 células de los insectos mediante el uso de recombinante virus de poliedrosis nuclear multicapsid de Autographa californica (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. más recientemente, se perfila como un prometedor vector gene terapia aplicación5. Es conocido por tener un amplio tropismo tejido y host, infecta las células quiescentes y proliferación, es no patógena y no integrar en el anfitrión cromosomas4,5,6. Además, se pueden producir baculovirus en cultura de suspensión libre de suero que es escalable y permite para sistema cerrado de procesamiento para la producción futura clínica1.
La pureza de las partículas de los baculovirus es importante para el logro de transducción eficaz minimizando la citotoxicidad7,8,9. Baculovirus puede concentrarse por ultracentrifugación o filtración de flujo tangencial (TFF) con impacto limitado en su infectividad. Sin embargo, estos procedimientos no sólo concentran las partículas del virus sino también detritos celulares y proteínas de Sf9 de la cultura, que pueden ser tóxicos en vitro (observación personal) y pueden inducir inflamación o respuesta inmune cuando se usa en vivo. Para evitar esto, sobre todo cuando uso altamente concentrado acciones de virus, baculovirus infecciosas debe ser purificado y separado de las partículas de contaminantes.
Varios métodos se han divulgado para la purificación y concentración de vectores de baculovirus10,11,12. De los métodos disponibles, cromatografía de afinidad de heparina permite un solo paso alto nivel de purificación con la baja concentración de contaminantes proteínas12. El método se basa en la identificación del sulfato del heparan como receptor de baculovirus13,14. Después de cargar el sobrenadante de células Sf9 sobre la columna y la vinculación de baculovirus, se puede lavar la columna con tampón fisiológico (isotónica) para eliminar partículas contaminantes ligeramente consolidadas o no consolidadas. Puesto que la Unión a la heparina es reversible, partículas de baculovirus pueden eluidas con un tampón salino alto, que se diluye inmediatamente a la concentración de sal (bebidas isotónica) fisiológica para evitar la inactivación por choque osmótico12. Por otra parte, la producción de baculovirus, así como captura en y la elución de la columna de cromatografía, se puede realizar mediante un proceso de sistema cerrado que es compatible con las actuales buenas prácticas de manufactura (cGMP).
Presentamos un protocolo detallado para la fabricación, purificación y concentración de baculovirus infecciosas mediante centrifugación y cromatografía de afinidad. Brevemente, producimos baculovirus por transfección de células Sf9 con un ADN de plásmido de baculovirus en cultura adherente y ampliar el baculovirus infecciosa en cultivo de suspensión libre de suero. Purificar el baculovirus mediante cromatografía de afinidad de heparina y usar ultracentrifugación como paso final para altamente concentrado el vector para el uso de la terapia génica.

<table><tbody><tr><td>Akta Avant 150</td><td>GE Healthcare</td><td>28976337</td><td>sistema de cromatografía</td></tr><tr><td>POROS Heparina 50 &micro; m Columna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4333414</td><td>Columna de heparina</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Artículo no catalogado</td><td>Concentra virus a alta velocidad</td></tr><tr><td>Polialómero Tubo ultracentrífugo</td><td>Beckman-Coulter 326823</td><td></td><td>Concentra virus a alta velocidad</td></tr><tr><td>Incubadora agitadora orbital MaxQ 8000&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Artículo no catalogado</td><td>Agitador para cultivo en suspensión</td></tr><tr><td>Matraces Erlenmeyer de 250 mL</td><td>Matraz ThermoFisher Scientific</td><td>238071</td><td>para cultivo en suspensión</td></tr><tr><td>Matraces Erlenmeyer de 1 L</td><td>Matraces ThermoFisher Scientific</td><td>238072</td><td>para cultivo en suspensión</td></tr><tr><td>Microscopio (Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>Artículo no catalogado</td><td>Monitorización y recuento de células&nbsp;</td></tr><tr><td>centrífuga de sobremesa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>Para la clarificación del sobrenadante de Baculovirus</td></tr><tr><td>50 ml Tubo cónico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td>Para la recogida de sobrenadante de Baculovirus</td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-200-80</td><td>Placa</td></tr> tratada para cultivo <tr><td>de tejidos Placa de 10 cm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-772E</td><td>Placa tratada para cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Stericup-HV, 0,45&nbsp; y micro; m, PVDF</td><td>EMD-Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td>unidad de filtración</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15160-054</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Kit de vectores Bac-to-Bac</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10360-014 Sistema de expresión de</td><td>baculovirus</td></tr><tr><td>DH10B-T1R&nbsp; Célula competente</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12331-013</td><td>Célula competente para tampón bacmid</td></tr><tr><td>TE</td><td>Interno</td><td>Artículo fuera de catálogo</td><td>10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0.</td></tr><tr><td>Kit de Maxiprep de plásmido</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K2100-06</td><td>Para la purificación de bacmid</td></tr><tr><td>Células Sf9</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11496-015</td><td>Células de insectos</td></tr><tr><td>Grace' s Medio de cultivo de células de insectos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11605-094</td><td>Medio de transfección</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>20012227 Lavado de células, muestras de dilución</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Medios de células de insectos</td><td>GE Healthcare SH30278.02</td><td></td><td>Medio de crecimiento de células de insectos sin suero</td></tr><tr><td>Benzonasa Nucleasa Sigma-Aldrich</td><td></td><td>E1014</td><td>Enzima para degradar ADN y ARN</td></tr><tr><td>Plásmido de baculovirus (bacmid) ADN</td><td>interno</td><td>Artículo no catalogado</td><td>Bacmid para la producción de baculovirus</td></tr><tr><td>Cellfectin II&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10362</td><td>Reactivo de transfección para células de insectos</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>Estabiliza el Baculovirus</td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thomas Scientific</td><td>1222C24</td><td>Para el almacenamiento de la línea celular de Baculovirus</td></tr><tr><td>HT1080</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>Línea celular de fibroblastos</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>Crecimiento Medios para líneas celulares</td></tr><tr><td>Tampón</td><td>de</td> lavado <td>Interno Artículo no de catálogo</td><td>20 mmol/l Tampón de fosfato que contiene 150 mmol/l de cloruro de sodio</td></tr><tr><td>Tampón de elución</td><td></td><td>Interno Artículo interno Fuera de catálogo</td><td>Tampón de fosfato de 20 mmol/l que contiene cloruro de sodio de 1,5 mol/l Tampón de</td></tr><tr><td>limpieza de columnas</td><td>Interno Artículo no de catálogo</td><td>Tampón de fosfato de 20 mmol/l que contiene cloruro de</td><td></td></tr> <tr><td>sodio de 2,0 mol/lAgua estéril</td><td>Interno</td><td>Artículo no catalogado</td><td>Para la limpieza Akta Avant</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.09137</td><td>Para la limpieza Akta Avant</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7073</td><td>Para la limpieza Akta Avant</td></tr></tbody></table>

producción y purificación de baculovirus para la aplicación de la terapia génica

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Baculovirus se ha utilizado tradicionalmente para la producción de proteínas recombinantes y vacunas. Sin embargo, más recientemente, baculovirus se perfila como un prometedor vector para el uso de la terapia génica. Aquí, el baculovirus es producido por transitorios de la transfección del plásmido baculovirus ADN (bacmid) en una cultura adherente de células Sf9. Baculovirus se amplía posteriormente en células Sf9 en una cultura de suspensión libre de suero hasta obtener el volumen deseado. Luego se purifica de la cultura de sobrenadante mediante cromatografía de afinidad de heparina. Sobrenadante el virus es cargado en la columna de heparina que se une partículas de baculovirus en el sobrenadante debido a la afinidad de la heparina por baculovirus envuelven glicoproteína. La columna se lava con un buffer para eliminar los contaminantes y baculovirus es eluida de la columna con un amortiguador de sal. El eluido se diluye a una concentración isotónica de sal y baculovirus partículas están más concentrados mediante ultracentrifugación. Usando este método, baculovirus puede ser concentrado hasta 500-fold con una recuperación del 25% de partículas infecciosas. Aunque el protocolo descrito aquí muestra la producción y purificación de los baculovirus de culturas hasta 1 L, el método puede ser escalado-para arriba en una cultura de suspensión de sistema cerrado para producir un vector de tipo clínico para uso de la terapia génica.

El protocolo presentado es en un diagrama de flujo (figura 1). Los pasos incluyen los transitorios de la transfección de células Sf9 con bacmid ADN para producir baculovirus en cultura adherente en una placa, la amplificación posterior en cultura de suspensión libre de suero, nucleasa tratamiento y clarificación por centrifugación y filtración, y la purificación mediante la cromatografía de afinidad de heparina seguida por concentración con ultracentrifugació...

En este protocolo, baculovirus es producida por transitorios de la transfección del plásmido de baculovirus en células Sf9 y amplificado en una cultura de suspensión libre de suero. El sobrenadante es purificado por cromatografía de afinidad de heparina y más concentrado por ultracentrifugación. Este protocolo es útil para la producción y purificación de baculovirus para el uso de la terapia génica.

Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

El objetivo general de este protocolo es producir baculovirus en cultivo celular de insectos, purificarlo mediante cromatografía de afinidad por heparina y concentrarlo mediante ultracentrifugación. El producto final puede utilizarse para transferencia génica in vivo o como vacuna. Este método puede ayudar a investigadores que deseen utilizar baculovirus purificado y concentrado para aplicaciones de terapia génica.Las partículas de baculovirus pueden contener restos celulares y proteínas del cultivo Sf9 que podrían inducir inflamación o una respuesta inmunitaria cuando se utilizan en personas. Para evitar la toxicidad, el baculovirus se purifica y separa de partículas contaminantes. Algunas partes del procedimiento serán demostradas por Marilou Narciso, una asistente de investigación de mi laboratorio.Para establecer el cultivo en suspensión, siembre 50 mililitros de células Sf9 en medio de cultivo para insectos en un matraz Erlenmeyer de policarbonato de 250 mililitros. Coloque el matraz en un incubador con agitador orbital. Añada dos mililitros del stock de baculovirus P2 a las células y agite a 135 rpm manteniendo una temperatura constante de 28 grados Celsius.Cuatro días despué

production-purification-baculovirus-for-gene-therapy

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

En este video, demostramos la técnica para aislar baculovirus de un sobrenadante de células de insecto utilizando cromatografía de afinidad de heparina. El aislamiento se ve facilitado por la afinidad entre la heparina de la columna y la glicoproteína de la envoltura del baculovirus.

Purificación de baculovirus basada en cromatografía de afinidad con heparina: una técnica para aislar baculovirus del sobrenadante de células de insectos

Complejos de proteínas catalizan las funciones celulares clave. Caracterización detallada funcional y estructural de muchos complejos esenciales requiere la producción recombinante. MultiBac es un sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para la expresión de proteínas eucarióticas y sus complejos. MultiBac se implementó como una plataforma de acceso libre, y los procedimientos operativos estándar desarrollados para maximizar su utilidad.

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

En el presente protocolo, se demuestra un método de purificación de proteínas a pequeña escala altamente eficiente y rentable, que permite la purificación de proteínas recombinantes, combinando de forma única una etiqueta de GST escindible y una pequeña cola de His.

GST-Su purificación: A dos pasos Affinity Protocolo Purificación Cediendo largos proteínas purificadas

Kindlins son fundamentales para la adhesión celular a través de las integrinas, pero los estudios de ellos se han visto obstaculizados por la dificultad para expresarlos de forma recombinante en huéspedes bacterianos. Se describen aquí métodos para su producción eficiente en células de insecto infectadas con baculovirus.

Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

A continuación, se presenta un protocolo para la síntesis de partículas similares a virus, ya sea utilizando baculovirus o sistemas de expresión de mamíferos, y la purificación ultracentrifugación. Este enfoque altamente adaptable se usa para identificar antígenos virales como objetivos de vacunas de una manera segura y flexible.

Expresión y purificación de partículas similares al virus para la Vacunación

Este protocolo describe un calor proteína inducida por choque expresión sistema (pDHsp/V5-su/sf9 de la célula), que puede utilizarse para evaluar la actividad anti-apoptótica de posibles proteínas extrañas y su truncado amino o expresando proteínas extrañas ácidos en las células de los insectos.

Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas

La purificación de los canales iónicos es a menudo difícil, pero una vez alcanzado, pueden permitir en vitro las investigaciones de las funciones y estructuras de los canales. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso para la expresión y purificación de proteínas de mamíferos bestrophin, una familia de Ca2 +-activa los canales de Cl– .

Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

Aquí, presentamos los protocolos para la utilización de la célula y baculovirus proteína expresión sistema insecto para producir grandes cantidades de proteínas vegetales segregada para la cristalización de proteínas. Un vector de expresión de baculovirus se ha modificado con GP67 o insectos hemolin péptido señal para la expresión de la secreción de la proteína de planta en células de los insectos.

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

El sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS) es una plataforma robusta para la detección de expresión y la producción de proteínas arginina metiltransferasas (PRMTs) que se utilizarán para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales. Cantidades de miligramo de material se pueden producir para la mayoría de prmts y otras proteínas de interés que requieren una plataforma de expresión eucariota.

Producción De Proteínas Prmt Recombinantes Utilizando El Sistema De Vectores De Expresión De Baculovirus

En este protocolo, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de insectos Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-proteína fluorescente verde (GFP) o gen terapéutico y células Sf9 infectadas con BV-AAV2-rep-cap en cultivo en suspensión. Las partículas de AAV se liberan de las células utilizando detergente, se clarifican, se purifican mediante cromatografía de columna de afinidad y se concentran mediante filtración de flujo tangencial.

Desarrollo de Procesos para la Producción y Purificación de Virus Adeno-Asociados (AAV)2 Vector utilizando el Sistema de Cultivo Celular Baculovirus-Insecto

Los estudios estructurales y bioquímicos de los transportadores de membrana humana requieren cantidades de miligramos de proteína estable, intacta y homogénea. Aquí describimos métodos escalables para seleccionar, expresar y purificar transportadores de solutos humanos utilizando genes optimizados para codones.

Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Aprende a producir y purificar baculovirus mediante cromatografía de afinidad con heparina y ultracentrifugación para aplicaciones de terapia génica. Este método elimina contaminantes celulares y mejora la seguridad del vector viral.

Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

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