Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

El objetivo general de este protocolo es producir baculovirus en cultivo de células de insectos, purificar con cromatografía de afinidad con heparina y concentrarse con ultracentrifugación. El producto final puede utilizarse para la transferencia de genes in vivo o como vacuna. Este método puede ayudar a los investigadores que desean utilizar baculovirus purificados y concentrados para la aplicación de terapia génica.

Las partículas de baculovirus pueden contener restos celulares y proteínas del cultivo de Sf9 que pueden inducir inflamación o una respuesta inmunitaria cuando se utilizan en personas. Para evitar la toxicidad, el baculovirus se purifica y se separa de las partículas contaminantes. Marilou Narciso, asistente de investigación de mi laboratorio, hará una demostración de algunas partes del procedimiento.

Para establecer el cultivo en suspensión, siembre 50 mililitros de células Sf9 en medio de cultivo de insectos en un matraz Erlenmeyer de policarbonato de 250 mililitros. Y coloque el matraz en una incubadora agitadora orbital. Agregue dos mililitros de caldo de baculovirus P2 a las células y agite a 135 rpm mientras mantiene una temperatura constante de 28 grados centígrados.

Cuatro días después de la infección, toda la población de células Sf9 mostrará un efecto citopático, que es una indicación de la producción de baculovirus de alto título. Amplificar secuencialmente el baculovirus hasta obtener el volumen deseado, aumentando el volumen de cultivo celular en cada infección subsiguiente de 10 a 50 veces. Después de centrifugar el sobrenadante final de baculovirus durante 30 minutos a 1000 g y cuatro grados centígrados para separar los restos celulares del curso, transfiera el sobrenadante a un recipiente limpio y trate con nucleasa a 50 unidades por mililitro durante dos horas a 37 grados centígrados para digerir el ADN y el ARN genómicos.

Finalmente, filtre el sobrenadante viral a través de una unidad de filtración de 0,45 micras. Configure el sistema de cromatografía colocando la línea de tampón de lavado desde el puerto de entrada A1 en una botella que contenga al menos 500 mililitros de tampón de lavado. Utilice el puerto de entrada del tampón A2 para cargar el tampón de elución.

Inserte varios tubos cónicos de 50 mililitros en el colector de fracciones para recoger el sobrenadante de baculovirus de paso de columna, el tampón de lavado y el baculovirus eluido. Equilibre la columna de heparina con cinco columnas de 7,9 mililitros de tampón de lavado a un caudal lineal de siete mililitros por minuto. Cargue 250 mililitros de sobrenadante de baculovirus en la columna de heparina utilizando la bomba de muestra del puerto de muestra de entrada a un caudal lineal de dos mililitros por minuto.

A continuación, pase 10 volúmenes de tampón de lavado a través de la columna de heparina a un caudal lineal de dos mililitros por minuto hasta que la curva de absorbancia ultravioleta haya vuelto a la línea de base y se haya estabilizado. Eluda las partículas de baculovirus de la columna de heparina con cinco volúmenes de columna de tampón de elución a un caudal lineal de cuatro mililitros por minuto. Esté atento a un pico de elución brusco de proteína en el cromatograma cuando las partículas de baculovirus se disocian de la columna de heparina.

Después de la elución, diluir inmediatamente el sobrenadante de baculovirus eludido 10 veces utilizando un tampón de fosfato de sodio de 20 milímetros para evitar la activación de las partículas de baculovirus por choque osmótico durante la centrifugación posterior. Comience el procedimiento de concentración agregando un volumen igual del sobrenadante de baculovirus al autoclave a los tubos de ultracentrífuga. Mida el peso del tubo con una balanza y ajuste el peso del contenido de los tubos de ultracentrífuga con PBS estéril.

Coloque cada uno de los tubos de ultracentrífuga en un cubo opuesto del rotor SW 32 Ti y haga funcionar la ultracentrífuga a 80.000 g durante 90 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, abra los tubos de ultracentrífuga en una campana de cultivo de tejidos y aspire asépticamente el líquido sin quitar la pastilla de baculovirus. Agregue 200 microlitros de PBS que contengan 0.5% de BSA y vuelva a suspender cada pellet pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo.

Finalmente, transfiera de 50 a 100 microlitros de alícuotas del baculovirus concentrado a crioviales y almacene a 80 grados centígrados negativos. Los títulos de baculovirus se estimaron mediante la infección de células HT1080. La línea conectada por diamantes muestra el total de unidades infecciosas de baculovirus en cada fracción.

Las partículas de baculovirus se unen fuertemente a la columna de heparina, por lo que no se detecta una cantidad significativa de virus en el tampón de lavado de la columna. Durante la elución se observa un pico agudo de proteína, que corresponde a la fracción de baculovirus. Los parámetros utilizados en este protocolo maximizan el rendimiento y minimizan la inactivación de partículas infecciosas de baculovirus.

Este protocolo se puede utilizar para la purificación de otros virus y proteínas que tienen afinidad por la heparina.